摘要: 甘草作为卫生部颁布的药食同源的资源之一，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、免疫调节等多种活性。本论文以甘草为材料，研究甘草黄酮的提取、分离纯化出甘草查尔酮A和甘草查尔酮B;明确甘草查尔酮A和甘草查尔酮B诱导人肝癌HepG2细胞的凋亡及其机理;最... 展开 甘草作为卫生部颁布的药食同源的资源之一，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、免疫调节等多种活性。本论文以甘草为材料，研究甘草黄酮的提取、分离纯化出甘草查尔酮A和甘草查尔酮B;明确甘草查尔酮A和甘草查尔酮B诱导人肝癌HepG2细胞的凋亡及其机理;最后，利用转录组和miRNA组学技术，从mRNA和miRNA整体水平明确甘草查尔酮A和甘草查尔酮B处理对HepG2肝癌细胞的调控。研究结果明确了甘草查尔酮A和甘草查尔酮B的抗癌机制，为把甘草开发为特殊医学食品建立了基础。 甘草黄酮提取条件的优化及其分离鉴定。利用超声波辅助提取甘草黄酮的工艺优化为:乙醇浓度64.38％、提取时间2.1h、超声功率112.42W、液料比30.15∶1;在该条件下最大提取率为6.56％。利用高速逆流色谱技术和硅胶柱层析技术分离纯化得到甘草查尔酮A和甘草查尔酮B。 甘草查尔酮A诱导肝癌HepG2细胞凋亡及其机理。以制备的甘草查尔酮A处理肝癌HepG2细胞，甘草查尔酮A能显著抑制HepG2细胞的增殖，24h的IC50为65.96μM。甘草查尔酮A阻滞细胞周期在G2/M期，诱导细胞凋亡，并引起细胞内ROS水平的上升。甘草查尔酮A处理后，细胞周期相关基因的表达量发生变化，Survivin、CyclinB1以及CDK1的表达量降低，Weel、p21、CyclinD1和JNK1的表达量上升。甘草查尔酮A通过调控死亡受体通路和线粒体等通路的基因表达诱导HepG2细胞的凋亡，甘草查尔酮A处理后上述通路中的DR3、DR5、Caspases3、Caspases8、Caspases10、Fas、Bad、Bax、Bcl-2、Bak和PUMA基因的表达显著上升，PKCε、p70S6K和Akt的表达下降。因此，甘草查尔酮A通过调控死亡受体信号通路、线粒体信号通路中相关基因的表达，促使HepG2细胞凋亡。 甘草查尔酮B诱导肝癌HepG2细胞凋亡及其机理。甘草查尔酮B对HepG2细胞的抑制能力低于甘草查尔酮A，24h的IC50为110.15μM。甘草查尔酮B阻滞细胞周期在G2/M期，诱导细胞凋亡，并引起细胞内ROS水平的上升。甘草查尔酮B处理后，细胞周期相关基因的表达量发生变化，CDK1、CyclinB1、CHK2、CDC14B和CDC7的mRNA表达下调，而ZBTB17、CDC20、PKMYT1、GADD45A、GADD45B、SFN、CDKNIC、p21和p53的表达显著上调。CyclinB1、p21、p53、CDK1和p-CHK2的蛋白表达与mRNA表达趋势一致。死亡受体途径的相关基因在mRNA水平(TNF、TNF-R1、Caspase8、Caspases 8、Fas、FasL、FOS、JUN)的表达以及在蛋白水平(TNF-R1、Fas、Caspases 8)的表达均上调。线粒体途径中，除Bcl-xl外，Bid、Bak、PUMA、DIABLO、ENdoG、Caspase9和Caspase3的mRNA和蛋白表达水平均增加。Caspases8和Caspase9的抑制剂可以抑制甘草查尔酮B诱导的细胞凋亡。甘草查尔酮B通过调控死亡受体信号通路、线粒体信号通路路中相关基因的表达，促使HepG2细胞凋亡。 甘草查尔酮A、B处理对肝癌HepG2细胞mRNA整体水平的影响。依据前面得出的IC50值，用浓度为70μM的甘草查尔酮A以及浓度为120μM的甘草查尔酮B处理HepG2，利用转录组技术明确其mRNA水平差异表达谱。甘草查尔酮A处理24h后，HepG2细胞表达量上调的基因有3414个，下调基因有2647个。甘草查尔酮B处理24h后，HepG2细胞表达量上调基因有2928个，下调基因有2601个。甘草查尔酮A处理后的差异基因主要富集在MAPK信号通路、FoxO信号通路和p53信号通路。甘草查尔酮B处理的差异基因主要富集在PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路。 甘草查尔酮A、B处理对肝癌HepG2细胞miRNA整体水平研究的影响。利用浓度为70μM的甘草查尔酮A以及浓度为120μM的甘草查尔酮B处理肝癌细胞HepG2，调查miRNA整体水平的变化。甘草查尔酮A处理24h后的上调的miRNA有54个，下调的miRNA有48个。甘草查尔酮B处理24h后的上调miRNA有50个，下调的miRNA有42个。甘草查尔酮A处理诱导的差异表达的miRNA的靶基因主要富集在MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路及Ras信号通路。甘草查尔酮B处理诱导的差异表达的miRNA的靶基因主要富集在MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路以及Rap1信号通路。miRNA组学的结果与转录组表达谱的结果一致。 收起