摘要: 本研究以‘长营’橄榄叶片为材料,采用RT-PCR和RACE技术,克隆获得了橄榄叶黄烷酮-3-羟化酶基因(flavonoid3-hydroxylase,F3H)和查尔酮异构酶基因(chalcone isomerase,CHI)的cDNA全长序列以及查尔酮合成酶基因(chaleone synthase,CHS)的部分cDNA序列,为橄... 展开 本研究以‘长营’橄榄叶片为材料,采用RT-PCR和RACE技术,克隆获得了橄榄叶黄烷酮-3-羟化酶基因(flavonoid3-hydroxylase,F3H)和查尔酮异构酶基因(chalcone isomerase,CHI)的cDNA全长序列以及查尔酮合成酶基因(chaleone synthase,CHS)的部分cDNA序列,为橄榄黄酮化合物的生物合成调控及开发利用提供一定的理论基础。主要研究结果如下: 1.利用RACE和RT-PCR技术克隆橄榄叶F3H基因cDNA全长 橄榄叶F3H基因cDNA序列全长1295 bp,包含一个完整的开放阅读框1095bp,5’和3’非编码区分别为41 bp和159 bp,编码364个氨基酸,蛋白质分子量41084.9 Da,理论等电点pI5.47,总平均疏水性为-0.437,不稳定系数为42.34,属于不稳定蛋白。橄榄叶F3H基因cDNA序列与荔枝、柚子、龙眼、甜橙、陆地棉、海岛棉的同源性比较高,分别为84％、84％、83％、83％、82％、82％。对F3H保守区功能分析结果显示,F3H包含三个结构功能域:20G-FeⅡ-Oxy高度保守区域、PLN03176和PLN02515结构域。全酶催化以下反应:ProcollagenL—proline+2-oxoglutarate+O2<=>procollagen trans-4-hydroxy-L-proline+succinate+C02。20G-FeⅡ-Oxy家族还具有赖氨酸水解酶、异青霉素合成酶及AlkB的活性。该序列的GenBank登录号为:JF728820。 2.利用RACE和RT-PCR技术克隆橄榄叶CHI基因cDNA全长 橄榄叶CHI基因cDNA序列全长1054 bp,包含一个开放阅读框672 bp,5’和3’非编码区分别为50 bp和332 bp,编码223个氨基酸,蛋白质分子量24247.9Da,理论等电点pI5.58,总平均疏水性为0.013,不稳定系数为34.60,属于稳定蛋白。序列对比表明,橄榄叶CHI基因cDNA序列与温州蜜柑、甜橙、柚子、杨树、美洲葡萄的同源性比较高,分别为80％、80％、80％、79％、78％。对CHI保守区功能分析结果显示,CHI包含一个Chaleone superfamily保守结构域。查尔酮异构酶是植物体内催化查尔酮到柚配苷的一种酶,在类黄酮合成过程中起到关键作用。该序列的GenBank登录号为:JF728821。 3.利用RACE和RT-PCR技术克隆橄榄叶CHS基因cDNA片段 从橄榄叶中克隆获得的CHS基因cDNA序列长511 bp,5’非编码区碱基数为117 bp,推测编码146个氨基酸。经BLAST分析表明,该cDNA序列与其它多种植物CHS基因具有较高的同源性。对CHS保守区功能分析结果显示,CHS在16-146位氨基酸之间,包含部分cond_enzymes superfamily结构域。该酶家族是一类缩合酶,催化缩合反应,各模体之间结构相似性非常高,与脂肪酸的合成和降解、聚酮化合物的产生以及各种不同的天然产物有关。该序列的GenBank登录号为:JF728822。 本实验继王云梅之研究,进一步克隆了黄酮代谢途径中的F3H和CHI基因的全长以及CHS基因的片段,以期为橄榄整个类黄酮代谢的表达调控、基因的进化及功能研究奠定一定的基础。 收起