摘要: 鬼箭锦鸡儿为豆科锦鸡儿属植物,别名鬼见愁、浪麻、腰冒、冠毛锦鸡儿等，藏文音译汉文名为“作毛兴”、“佐木兴”等。鬼箭锦鸡儿分布于中国青海、西藏、新疆、甘肃、宁夏、内蒙古、河北、山西、辽宁等省区，是主要生长在海拔3000?4700米的阴坡、半阴坡地... 展开 鬼箭锦鸡儿为豆科锦鸡儿属植物,别名鬼见愁、浪麻、腰冒、冠毛锦鸡儿等，藏文音译汉文名为“作毛兴”、“佐木兴”等。鬼箭锦鸡儿分布于中国青海、西藏、新疆、甘肃、宁夏、内蒙古、河北、山西、辽宁等省区，是主要生长在海拔3000?4700米的阴坡、半阴坡地带的落叶灌木。鬼箭锦鸡儿作为传统藏药藏锦鸡儿的主要基源植物，具有活血散瘀、凉血、降压、生肌止痛等功效，临床上与其它药物配伍用于治疗缺血性心脑血管病、高血压、多血症、月经不调等症。现代药理研究表明该植物具有抗炎、抗癌及抗病毒等活性。 本论文在对锦鸡儿属植物的化学成分和药理活性进行综述的基础上，对该植物所含的两类特征成分，即查尔酮二聚体类和查尔酮—异黄酮二聚体类化合物的来源、药理活性以及生物合成途径进行了系统总结。对于鬼箭锦鸡儿二氯甲烷部分的化学成分，在前期研究工作的基础上开展了针对性分离工作，鉴定了分离得到的化合物，对分离得到的化合物进行了抗炎活性的测定与评价并对分离得到的新化合物的生物合成途径根据文献进行了合理的推测。 在鬼箭锦鸡儿二氯甲烷萃取物化学成分研究中采用95%乙醇水溶液对鬼箭锦鸡儿红色木部心材粗粉进行回流提取，乙醇提取物水分散后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取液浓缩后得到各萃取物。其中，二氯甲烷萃取物采用反相C18硅胶中压制备色谱进行分段分离，流动相为甲醇-水，梯度洗脱。中压制备色谱分离得到的各个部分在反相C18硅胶高压分析液相色谱上进行分离条件优化，将优化分离后的条件应用于制备型高压液相色谱，然后结合凝胶色谱法进行进一步的细分及纯化。综合运用多种现代波谱技术(MS、1H NMR、13CNMR、DEPT135、COSY、HSQC、HMBC、UV、IR、CD)对分离得到的8个化合物中的6个化合物进行了结构鉴定，其中，四个为新化合物，两个为首次从该植物中分离得到的已知化合物。新化合物包括两个异黄酮－查尔酮二聚体，即caraganinA(1)和caraganinB(2),和两个查尔酮二聚体，即caraganinC(3)和caraganinD(4)。两个已知化合物分别为5，7-二羟基-4′-甲氧基异黄酮和熊果醛。经过对Scifinder和Reaxy数据库进行化合物检索，发现新化合物1和2中的异黄酮和查尔酮之间的连接方式为新的C-C连接方式。 采用现代波谱分析法对新化合物1～4的化学结构进行推导。根据化合物1的高分辨质谱数据推断其分子式为C33H28O9。氢谱显示化学位移在δH8.23处有一个尖锐的单峰，推测可能具有异黄酮的骨架存在。根据HMBC谱上的碳氢相关信号以及对比相关化合物的文献数据可以推断异黄酮骨架的存在。在低场区位于δH13.01处有一尖锐的单峰，推测为异黄酮的5位羟基，该羟基因为能与羰基形成分子内氢键，所以化学位移大幅度向低场移动。氢谱显示出化合物A环上存在两个间位偶合的氢，B环上两个对位取代的氢，C环上有一个ABX自旋系统，D环上有一个AA′BB′自旋系统。根据氢谱以及COSY谱中的相关信号可以推测一个丙烯基的存在。根据双键上两个氢信号间具有较大的偶合常数(J＝15.6Hz)可以推断该双键为反式构型。HMBC谱图中的相关信号表明H-7′与C-2″′存在相关，可以推断D环与C-7′相连，H-6′与H-6″和C-9′存在相关，可以推断B环与C环和C-9′相连。结构中C-9′的绝对构型通过对比实验测定的ECD谱和计算所得的ECD谱确定为R构型。化合物1的结构确定为R-(E)-3-(5-(1-(2,4-dimethoxyphenyl)-3-(4-hydroxyphenyl)allyl)-2,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxy-7-methoxy-4H-chromen-4-one并命名为caraganinA。化合物2与化合物1的结构非常相似，不同之处仅在于化合物2的C环和D环的取代模式与化合物1不同。因此，其结构推导过程与化合物1相同。化合物2的结构确定为R-(E)-3-(5-(3-(2,4-dimethoxy-phenyl)-1-(4-hydroxyphenyl)allyl)-2,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxy-7-methoxy-4H-chromen-4-one，并命名为caraganinB。化合物1和2是首次发现的在异黄酮B环上的C-5′直接与二苯丙烯相互连接的结构。根据高分辨质谱数据推断化合物3的分子式为C33H32O6。根据氢谱以及COSY谱上H-2与H-3以及H-4存在相关，以及HMBC谱上H-2与C-9存在相关，H-5与C-4存在相关等信息可以推断出苯并二氢吡喃结构骨架的存在。根据氢谱和COSY谱可以推测出A环和B环皆为ABX自旋系统，C环和D环为AA′BB′自旋系统，以及反式双键的存在。HMBC谱上H-13与C-2″′的相关表明苯乙烯基的存在，H-6″与C-11的相关表明苄基的存在，H-6′与C-2存在相关表明B环中的C-1′与C-2相连，H-13与C-4存在相关表明苯乙烯基与C-4相连，H-4与C-11相关表明苄基与C-3相连。化合物3的相对构型由H-2/H-3,以及H-4/H-3的偶合常数以及NOESY谱确定，H-2/H-3以及H-4/H-3的偶合常数大于8Hz,表明H-2、H-3和H-4均为直立键，从NOESY谱上可以看到H-2与H-4存在相关，H-2和H-4都与H-11存在相关，因此确定H-2和H-4在同侧，H-3与H-2，H-4处于异侧。通过对比实验测定的ECD谱和计算所得的ECD谱，确定化合物3的绝对构型为2R,3R,4R。化合物3的结构确定为(2R,3R,4R)-(E)-2-(2,4-dimethoxyphenyl)-3-(4-hydroxybenzyl)-4-(4-hydroxystyryl)-7-methoxychromane，并命名为caraganinC。化合物4的分子式为C32H28O6，其化学结构化合物4与化合物3结构相似，不同之处在于化合物4的结构中多形成了B环与F环形成了另一个苯并二氢吡喃环，并且以及化合物4与化合物3的绝对构型也不相同。波谱数据综合分析确定其结构为(2S, 3R, 4R)-(E)-3-(4-hydroxybenzyl)-4-(4-hydroxystyryl)-7-methoxychroman-[2,4]-7-methoxychromane，并命名为caraganinD。 经对异黄酮和查尔酮二聚体和查尔酮二聚体的药理活性进行综述，发现这两类成分有抗炎的作用，以及鬼箭锦鸡儿也具有抗炎的作用，本论文对分离得到的化合物进行了抗炎活性的筛选。当机体发生炎症反应时，组织会释放一系列的炎症因子。其中，一氧化氮(NO，即血管内皮舒张因子)在生物体内作为一种反应性极强的自由基，兼有第二信使和神经递质作用。同时，NO又是一种效应分子，在体内具有广泛的生理作用，如松弛血管平滑肌、抑制血小板聚集、调节脑血流、介导细胞毒效应和免疫调节、参与学习和记忆、动脉粥样硬化等。NO产生异常与某些疾病的发生发展有着密切关系。因此，近年来对NO的研究越来越受到广大科学工作者的重视。NO本身半衰期极短，血液中的NO主要由血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、血小板、巨噬细胞等产生并以亚硝酸盐及硝酸盐式存在。运用Griess试剂将亚硝酸盐转化为深紫色的含氮化合物，测定该含氮化合物内发色团的的浓度可以间接测定NO的浓度。肿瘤坏死因子(TNF-α)是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎症介质，能激活中性粒细胞和淋巴细胞，使血管内皮细胞通透性增加，调节其他组织代谢活性并促进其他细胞因子的合成和释放。白细胞介素-6(IL-6)能诱导B细胞分化和产生抗体，并诱导T细胞活化增殖、分化、参加机体的免疫应答，是炎症反应的促发剂。Elisa检测采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量检测。文献数据表明鬼箭锦鸡儿及其所含的特征类成分异黄酮-查尔酮二聚体和查尔酮二聚体均具有较好的抗炎活性。因此，本论文采用小鼠巨噬细胞RAW264.7模型通过检测NO、IL-6、TNF-α等炎症因子的生成量对研究中分离得到的化合物进行了抗炎活性评价。实验分为空白组、阴性对照组、阳性对照组和样品组等四组。通过在酶标仪上检测各孔吸光度值并根据公式或者建立标准曲线的方法来计算出各炎症因子的产生量，进而计算出各炎症因子的抑制率，并且根据相应的公式以及标准曲线计算出各炎症因子IC50值。实验结果表明，化合物2和4具有较强的抑制NO产生的活性，其IC50值分别为4.09和5.21μmol/L。通过对比化合物3和化合物4的结构可以看出，化合物4抑制NO生成的活性显著高于化合物3的原因可能与化合物4的结构中增加了一个桥环有关。化合物1和4在抑制炎症因子TNF-α产生过程中也表现出了一定的抑制活性，其IC50值分别为11.37和14.72μmol/L。 天然有机化合物的生物合成途径研究有利于天然化合物的结构分类以及结构推测，并能指导仿生合成、指导组织培养生物活性物质，帮助定向寻找生物活性成分以及进行生物调控来提高活性成分的含量。通过对文献报道的所有异黄酮-查尔酮二聚体和查尔酮二聚体进行综述发现这两类成分的主要生物合成途径均包括加成反应和缩合反应。根据文献数据和基本的生物合成反应，本论文对分离得到的化合物1~4的生物合成途径进行了分析和合理的推测，发现化合物1和2可能是异黄酮的C-5′与查尔酮的β碳或者羰基碳通过α，β-不饱和酮的加成反应以及进一步的还原反应得到；化合物3和4可能是查尔酮先经过还原以及脱水反应形成中间体，然后此中间体再与一分子查尔酮通过[2+4]环加成反应、还原反应得到化合物3，或者此中间体与另一分子查尔酮通过[2+4]环加成反应、亲核取代反应及还原反应得到化合物4。 收起