中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 李伟岸广西医科大学 2013年硕士导师: 韦庆军共86页

摘要 : 目的利用体外分离培养兔滑膜间充质干细胞(synovium-derivedmesenchymal stem cells，SMSCs)，探讨其在体外多向分化潜能。为其作为组织工程的种子细胞来源提供科学依据。方法取4-6周龄的新西兰大白兔4只，雌雄不限，体重1.5-1.8kg。取兔子膝关... 展开目的利用体外分离培养兔滑膜间充质干细胞(synovium-derivedmesenchymal stem cells，SMSCs)，探讨其在体外多向分化潜能。为其作为组织工程的种子细胞来源提供科学依据。方法取4-6周龄的新西兰大白兔4只，雌雄不限，体重1.5-1.8kg。取兔子膝关节滑膜组织，通过消化培养法从兔滑膜组织中分离出SMSCs并加以纯化，进一步在体外培养条件下研究其形态学、超微结构、分子表型、增殖动力学等基本的生物学特性。行原代及传代培养，在光镜下观察细胞形态，在电镜下观察细胞超微结构，并用流式细胞仪和免疫组化进行细胞表面标记物的检测，MTT法测定第三代细胞的增殖情况，并绘制出生长曲线。待第3代细胞长满培养瓶后移去细胞基础培养液，分别加入特定培养液进行成骨、成脂、成软骨诱导分化。成骨诱导7天后行Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色，10d后行碱性磷酸酶(ALP)染色检测，2ld后行茜素红染S染色及von-kossa染色检测;21天后通过电镜检测诱导后SMSCs的表面结构及超微结构;成脂诱导21d后行油红0染色检测;成软骨诱导21d后行甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色检测。取生长状态良好第三代细胞兔滑膜间充质干细胞接种到自制的异种生物衍生骨支架材料上成骨诱导体外构建组织工程骨。结果SMSCs原代培养24h后细胞形态呈细长或呈多角形;48h后细胞数量明显增多，72h-96h后可见大量纺锤形细胞，其间散在分布少许小圆形细胞。流式细胞仪检测SMSCs表面标记物CD55的表达为99.4％;免疫荧光检测SMSCs表面标记物CD90的表达阳性。第3代SMSCs的生长曲线符合干细胞的生长曲线。第三代与第七代细胞的增殖无明显差异(p＞0.05)。第3代SMSCs通过透射电镜下可见SMSCs较分散，细胞间无明显连接结构，扫描电镜下见细胞呈长梭形，有两分支样突起，SMSCs细胞核呈椭圆形，单核或双核，通常有2-3个核仁。第3代SMSCs成骨诱导7天后行Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色阳性，10d后ALP染色阳性，21d时茜素红S染色呈阳性，von-kossa染色阳性，SMSCs成骨诱导21天后通过扫描电镜下见细胞成星形，胞体增大，透射电镜下见诱导后细胞连接紧密，带有大量微绒毛样突起，交错样排列，细胞器更加丰富，线粒体明显增多;成脂诱导21d后油红0染色阳性;成软骨诱导21d后甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性。SMSCs能与自制的生物衍生骨支架材料粘附并增殖，可见成骨细胞贴附，SMSCs与支架有较好的相容性。结论兔膝关节滑膜组织可分离获取SMSCs，兔SMSCs在体外诱导下具有向成软骨、成骨、成脂多向分化的潜能，SMSCs与自制的生物衍生骨支架材料有较好的相容性。有望成为组织工程理想的种子细胞来源，在骨和软骨的再生修复中发挥重要作用。收起

关键词 : 滑膜间充质干细胞成骨分化成脂分化成软骨分化组织工程

2. 不同浓度万古霉素对大鼠脂肪干细胞体外定向诱导分化为成骨细胞的影响

[学位论文] 黄俊中南大学 2009年硕士导师: 倪江东共34页

摘要 : 目的：研究大鼠脂肪干细胞（ADSCs）在体外分离培养、诱导分化为成骨细胞及成脂细胞的能力，初步观察不同浓度万古霉素对其增殖、成骨分化的影响方法：将大鼠ADSCs放入成脂诱导液中培养，采用油红O染色观察其成脂分化能力；同时将大鼠ADSCs放入... 展开

关键词 : 脂肪干细胞万古霉素成骨分化成脂分化

3. 不同年龄人群脂肪干细胞体外成脂、成骨诱导分化能力的比较

[学位论文] 陈树鑫中山大学 2009年硕士导师: 钟志刚共27页

摘要 : 目前，国内外很多研究结果均显示，在脂肪组织中同样存在具有多向分化潜能的基质干细胞。由于骨髓组织来源的干细胞获取来源有限、获得困难等不利因素，限制了其应用。而脂肪组织来源的干细胞作为一种干细胞的新来源，具有一定的潜在的优越性。使得脂... 展开目前，国内外很多研究结果均显示，在脂肪组织中同样存在具有多向分化潜能的基质干细胞。由于骨髓组织来源的干细胞获取来源有限、获得困难等不利因素，限制了其应用。而脂肪组织来源的干细胞作为一种干细胞的新来源，具有一定的潜在的优越性。使得脂肪干细胞的研究迅速成为研究的新热点。随着研究的深入，各种更细节的问题都将会被考虑。目前，国内外对于不同年龄人群的脂肪干细胞成脂、成骨能力是否存在差异尚无统一认识。本实验在于观察年龄对人脂肪干细胞体外成脂、成骨分化的影响，为脂肪干细胞的进一步应用提供实验依据。方法： 1.分三组：儿童(<14岁)(n=5)、成年(30-35岁)(n=5)、老年(>60岁)(n=5)。 2.采用第3代ADSCs细胞，以105/孔接种于6孔板，待其生长融合后，于普通培养液中分别加入成脂诱导剂进行培养。成脂诱导2周后进行油红0染色检测，染色后脂滴所占的面积百分比采用图像分析软件(Image—ProPlus，美国)进行定量分析。 3.同样采用第3代ADSCs细胞，以105/孔接种于6孔板，待其生长融合后，于普通培养液中分别加入成骨诱导剂进行培养。成骨诱导2周后进行碱性磷酸酶的定量检测。得到各个标本细胞的碱性磷酸酶数值，再计算各年龄组的碱性磷酸酶数值。成骨诱导4周后进行von Kossa染色。采用图像处理软件(Image——ProPlus，美国)对染色后钙化面积进行定量分析。结果： 1.细胞接种48小时后大部分细胞已贴壁生长，并开始伸展，呈成纤维细胞样梭形，6-7天基本融合，传代细胞稳定。 2.细胞经成脂诱导后形态发生变化，由长梭形变成不规则的圆型，胞浆中可见大小不等的脂滴，有的相互融合，形成较大的脂滴。油红0染色显示红色的脂滴，图像分析软件显示各组成脂情况存在一定的差异，老年组成脂水平均低于儿童组及成年组。 3.细胞经成骨诱导后由长梭形变为扁圆型，2周时行碱性磷酸酶定量检测时发现细胞着色呈粉红或紫红色，各组定量结果显示年龄增加其成骨能力下降。4周时进行von Kossa染色可见呈集落生长的细胞中间有黑色的钙化结节出现，图像分析软件定量分析同样显示年龄增加其成骨能力下降。结论： 1.利用原代细胞培养技术可从人脂肪组织中分离出脂肪干细胞，并进行体外培养及传代。这些细胞在诱导培养基作用下可分化成脂肪细胞和骨细胞。 2.老年患者的脂肪干细胞成脂分化能力降低；各组成骨分化能力随着年龄的增加而降低。收起

关键词 : 脂肪干细胞成脂分化成骨分化年龄因素

4. 利用细胞和小鼠模型研究PLIN1基因对肌肉发育的影响

[学位论文] 高娟扬州大学 2023年硕士导师: 鞠辉明；牟玉莲共79页

摘要 : 围脂滴蛋白1(PLIN1)是脂滴表面最丰富的结构蛋白，对脂质的合成和脂解起到重要的调控作用。本研究小组前期利用不同猪种模型开展猪体型发育、肌肉发育差异研究，筛选出包括PLIN1基因在内的一批不同肌肉组织中表达差异显著的基因。本研究拟从细胞层面研... 展开围脂滴蛋白1(PLIN1)是脂滴表面最丰富的结构蛋白，对脂质的合成和脂解起到重要的调控作用。本研究小组前期利用不同猪种模型开展猪体型发育、肌肉发育差异研究，筛选出包括PLIN1基因在内的一批不同肌肉组织中表达差异显著的基因。本研究拟从细胞层面研究PLIN1基因对骨骼肌卫星细胞(skeletalmusclesatellitecells,SMSCs)成肌和成脂分化功能的影响，并且构建骨骼肌组织中特异性敲除PLIN1基因的条件性敲除小鼠模型研究PLIN1基因对骨骼肌发育的表型变化及功能影响。从而全面研究PLIN1基因对肌肉发育和肉质的具体影响，有助于推进家猪产肉性状改良工作。研究一利用细胞模型研究PLIN1基因对成肌及成脂分化功能的影响本研究以姜曲海猪SMSCs为对照组(NC),以PLIN1基因表达敲低(PLIN1-KO)及PLIN1基因过表达(PLIN1-EX)SMSCs为实验组，3组细胞成肌诱导后检测各组细胞中成肌分化标志因子MYH1和MyoD1的表达变化来研究PLIN1基因对成肌分化的影响;各组细胞成脂诱导分化后，通过检测各组细胞中成脂分化标志基因PPARγ和成脂分化抑制基因PRKAG2的表达;利用油红O染色及定量检测细胞中脂肪量;测定细胞中甘油三脂(TG)含量等方法检测PLIN1基因对成脂分化的影响。结果表明，各组细胞成肌分化诱导4天后，NC组细胞中MYH1和MyoD1的mRNA表达均极显著高于PLIN1-KO及PLIN1-EX组(P＜0.01);NC组细胞中MYH1和MyoD1蛋白表达也极显著高于PLIN1-KO及PLIN1-EX组(P＜0.01);细胞免疫荧光检测MYH1和MyoD1的结果和上述趋势一致。各组细胞成脂分化后，NC组细胞中油红O染色及定量水平均显著高于PLIN1-KO及PLIN1-EX组(P＜0.01),NC组细胞中PPARγ基因的表达显著高于PLIN1-KO及PLIN1-EX组(P＜0.05);NC组PRKAG2基因的表达极显著低于PLIN1-KO及PLIN1-EX组(P＜0.01),NC组细胞TG水平显著高于PLIN1-KO及PLIN1-EX组(P＜0.01)。综上所述，PLIN1基因稳定表达对骨骼肌卫星细胞分化功能非常重要，PLIN1基因过表达或者敲低后均会导致SMSCs成肌、成脂分化能力显著下降。研究二利用小鼠模型研究PLIN1基因对肌肉发育的影响本研究在小鼠PLIN1基因第3外显子两端设计2个sgRNA序列，构建含PLIN1exon3两端带loxp序列的同源臂的Donor载体，通过原核期胚胎显微注射制备PLIN1Flox小鼠，通过和骨骼肌组织中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠交配，筛选出骨骼肌组织中PLIN1基因特异性敲除的基因编辑小鼠。以野生型C57BL/6J小鼠为对照（WT）,首先在DNA、RNA和蛋白水平对PLIN1基因编辑小鼠进行分子生物学鉴定;通过绘制生长曲线、测定8周龄小鼠股四头肌和腓肠肌脏器系数及肌肉形态进行小鼠表型检测。采集两组小鼠腓肠肌，通过索氏抽提检测腓肠肌总脂肪含量、制备冰冻切片后通过油红O测定肌肉组织脂质含量、利用试剂盒测定肌肉组织中TG的含量、HE染色观察肌肉组织中肌纤维横截面积;分别通过qRT-PCR及WB检测骨骼肌组织中成肌标志基因MyoD1、MYH和成脂标志基因PPARγ、LPLmRNA及蛋白表达以检测PLIN1基因对肌肉组织分化功能的影响。提取两组小鼠骨骼肌组织线粒体，检测线粒体膜电位、活性氧和ATP水平，以全面检测PLIN1基因对肌肉代谢的影响。结果表明，PLIN1cKO组小鼠PLIN1mRNA在心肌、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮肤、脂肪中表达和WT组小鼠差异不显著，在骨骼肌极中显著低于WT组小鼠（P＜0.01）,PLIN1cKO组小鼠骨骼肌中PLIN1蛋白相对表达量极显著低于WT组（P＜0.01）。测量小鼠出生后8周的生长体重，从第2周后WT组较PLIN1cKO组有显著上升（P＜0.05）;WT组小鼠腓肠肌和股四头肌脏器系数显著高于PLIN1cKO组（P＜0.05）;组织学切片HE染色结果表明，WT组肌纤维横截面积极显著高于PLIN1cKO组（P＜0.01）;腓肠肌组织冰冻切片油红O染色结果表明，WT组肌肉组织中脂类物质相对量极显著高于PLIN1cKO组（P＜0.01）;WT组小鼠腓肠肌内的脂肪含量显著高于PLIN1cKO组（P＜0.05）;WT组肌肉组织中MYH、MyoD1、PPARγ和LPLmRNA表达水平均显著高于PLIN1cKO组（P＜0.01）,WB检测成肌分化标志蛋白MyoD1、Myog、MYH及成脂分化标志蛋白PPARγ和LPL表达，WT组均显著高于PLIN1cKO组（P＜0.05）。和WT组相比，PLIN1cKO组小鼠骨骼肌膜电位下降42％,活性氧上升22％,ATP水平下降29％。上述结果说明，本研究成功制备了骨骼肌中PLIN1基因特异性敲低的小鼠模型，证明了PLIN1基因敲低后对肌肉组织肌纤维和脂肪的产生和代谢有显著的抑制作用。全文结论:本研究首次利用细胞及小鼠模型，证明了PLIN1基因对骨骼肌发育及代谢有重要影响。其中细胞水平证明了PLIN1基因的稳态表达有助于维持猪SMSCs的正常分化功能，PLIN1基因表达过高或者过低均会抑制SMSCs分化功能;小鼠模型中证明了骨骼肌组织中PLIN1基因敲除后直接抑制骨骼肌组织中脂肪及肌纤维生成，抑制肌肉组织代谢。本研究后续将在不同猪种群体中进行PLIN1表达水平和肌肉发育的关联分析，有助于推进我国猪种的遗传选育工作。收起

关键词 : PLIN1基因骨骼肌卫星细胞成肌分化成脂分化肌肉发育

5. 葛根素对猪前体脂肪细胞成脂分化的作用机制研究

[学位论文] 吕香州延边大学 2022年硕士导师: 于永生；金一共61页

摘要 : 松辽黑猪是由吉林省农业科学院培育出的我国北方第一个瘦肉型黑色母系品种，在生产上常用于优质黑猪肉生产或作为母本应用于黑猪配套系生产，寻求健康安全的添加剂改善肉质已经成为了畜牧学发展的新要求。葛根素是从豆科植物葛根中提取出来的一种异黄... 展开松辽黑猪是由吉林省农业科学院培育出的我国北方第一个瘦肉型黑色母系品种，在生产上常用于优质黑猪肉生产或作为母本应用于黑猪配套系生产，寻求健康安全的添加剂改善肉质已经成为了畜牧学发展的新要求。葛根素是从豆科植物葛根中提取出来的一种异黄酮类衍生物，对高血压、心律失常、以及肝肾功能损伤均有一定改善作用，但临床上更多被用于治疗代谢疾病上。本试验以松辽黑猪前体脂肪细胞为研究对象以探究葛根素对松辽黑猪前体脂肪细胞分化的影响，以及通过何种途径影响松辽黑猪前体脂肪细胞分化。第一步通过胶原酶消化法分离脂肪细胞，并油红O染色鉴定第8d脂质沉积情况，同时不同时间成脂标志基因的表达量以鉴定松辽黑猪前体脂肪细胞模型是否构建成功。第二步通过CCK8检测确定葛根素对细胞的毒性作用;并检测不同浓度组油红O染色脂滴OD值与甘油三酯浓度筛选出最优葛根素浓度组;对一些成脂分化相关基因mRNA定量猜想葛根素通过何种途径调节松辽黑猪前体脂肪细胞分化。第三步将试验分为在诱导液中不添加葛根素的对照组(Con)、添加40μmol/L葛根素(Pue)组、葛根素+AMPK激活剂AICAR(500μmol/L，AICAR)组作为阴性对照组、葛根素+AMPK抑制剂CompoundC(20μmol/L，CompoundC)组作为阳性对照组，使用油红O染色、甘油三酯测定、脂质氧化水平检测、实时荧光定量PCR、Westernblotting、MDA脂质氧化测定的方法探究葛根素、AMPK通路和成脂分化之间的关系，并对葛根素与AMPKα亚基做分子对接预测。结果显示，在前体脂肪细胞分离试验中，胶原酶消化法成功分离松辽黑猪前体脂肪细胞，实时荧光定量PCR结果显示，成脂标志基因C/EBPa表达量在0-8d整体呈现上升趋势，成脂标志基因PAPRγ在0-6d表达量上升，第8d表达量下降。为试验的下一步进展打下基础。添加葛根素后发现，葛根素对松辽黑猪前体脂肪细胞生长无显著毒性作用;40μmol/L葛根素处理下前体脂肪细胞脂质沉积最高;在40μmol/L葛根素处理下，成脂标志基因表达量显著高于无葛根素处理的对照组，且葛根素处理组AMPK下游蛋白ACC表达量显著高于对照组，因此猜想葛根素或可通过AMPK通路调节松辽黑猪前体脂肪细胞分化与脂质沉积。通过添加AMPK激活剂AICAR与抑制剂CompoundC发现，Pue组、CompoundC组甘油三酯含量显著高于Con组;Con、Pue、AICR、CompoundC组组间MDA差异不显著。实时荧光定量PCR结果表明，CompoundC能够上调葛根素促进脂质沉积的作用，AICAR则会抑制其作用。这表明激活AMPK蛋白能够显著降低葛根素的成脂分化效果。Westernblotting结果显示，Pue、CompoundC组PPARγ和ACC的表达量均显著高于Con组，AICAR组则显著低于其他三组。Pue、CompoundC组AMPK、p-AMPK的表达量均显著低于Con、AICAR组，AICAR组p-AMPK表达量显著高于Con组。因此推测葛根素是通过AMPK蛋白对脂肪细胞脂质分化其调节作用。分子对接试验显示，葛根素与AMPKα亚基之间可形成5个氢键以及5个Pi-阳离子键。收起

关键词 : 猪葛根素脂肪细胞成脂分化

6. GroEL对牙周膜干细胞成骨成脂分化的影响及其机制研究

[学位论文] 张莉四川大学 2021年硕士导师: 程磊共83页

摘要 : 研究背景牙周炎是主要由细菌感染引起的慢性炎性破坏性疾病，菌斑生物膜中的细菌及其代谢产物作用于宿主引发炎症和免疫反应，导致牙周组织的破坏。牙周疾病流行范围广泛，在多个国家和地区牙周疾病患病率超过80%，是全世界范围内的重大公共卫生负担。... 展开研究背景牙周炎是主要由细菌感染引起的慢性炎性破坏性疾病，菌斑生物膜中的细菌及其代谢产物作用于宿主引发炎症和免疫反应，导致牙周组织的破坏。牙周疾病流行范围广泛，在多个国家和地区牙周疾病患病率超过80%，是全世界范围内的重大公共卫生负担。牙周组织破坏是菌斑生物膜与宿主之间动态失衡的结果。病原菌分泌大量的微生物毒力因子可直接作用于宿主细胞改变其生物学行为，引发局部炎症反应，进一步促进牙周组织的破坏。牙周膜干细胞具有修复和再生受损牙周骨组织的成骨潜能，可调节牙周膜和牙槽骨的动态平衡，但炎症状态下会影响其成骨能力。GroEL蛋白是一种细菌代谢物，是炎症的主要刺激因子之一。GroEL可以激活炎症反应，然而GroEL与宿主相互作用的潜在机制尚不清楚，国内外也暂无GroEL对牙周膜干细胞分化潜能的影响的报导。研究目的本课题旨在探究GroEL对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成骨及成脂分化潜能的影响及其潜在的作用机制，进一步揭示微生物通过毒力因子GroEL对牙周炎的作用。研究方法 1.通过酶消法从拔除的健康患者的正畸牙中体外分离培养hPDLSCs。并通过结晶紫染色、ALP染色、茜素红染色、油红O染色和免疫荧光染色鉴定其增殖能力、多向分化能力及间充质干细胞表面标志蛋白表达。GroEL作用于hPDLSCs后，q-PCR检测炎症因子及基质金属蛋白酶（MMPs）的表达变化，明胶酶谱实验检测MMPs活性的变化。 2.GroEL作用于成骨诱导的hPDLSCs，通过ALP染色、茜素红染色、qRT-PCR实验和Westernblot实验检测其对hPDLSCs成骨分化能力的影响。 3.GroEL作用于成脂诱导的hPDLSCs，通过油红O染色和Westernblot实验检测其对hPDLSCs成脂分化能力的影响。 4.GroEL作用于hPDLSCs，通过qRT-PCR实验检测Toll样受体的表达变化；Westernblot实验检测胞内信号通路蛋白成分的变化，免疫荧光染色实验进一步验证其表达及定位的变化；使用膜受体及通路蛋白抑制剂预处理后，Westernblot实验和免疫荧光染色实验验证通路蛋白的变化，ALP染色、茜素红染色和油红O染色检测GroEL影响的hPDLSCs成骨及成脂分化的变化。研究结果1，GroEL可促进hPDLSCs炎症因子及基质金属蛋白酶表达增加。2，GroEL抑制hPDLSCs的成骨向分化但促进hPDLSCs的成脂向分化。3，对其作用机制的探索发现GroEL通过TLR激活hPDLSCs的JNK/MAPK和NF-κB信号通路。TLR、JNK/MAPK和NF-κB抑制剂可恢复或部分恢复GroEL损伤的hPDLSCs的成骨向分化及逆转或部分逆转GroEL促进的成脂向分化。结论GroEL抑制hPDLSCs的成骨能力及增强hPDLSCs的成脂能力；GroEL通过TLR调节JNK/MAPK和NF-κB信号通路，参与其对hPDLSCs成骨及成脂分化的调控，揭示了细菌代谢产物与宿主细胞之间的直接相互作用。这项研究提供了细菌代谢产物可以影响干细胞分化的证据，为牙周炎的治疗提供潜在的靶点。收起

关键词 : GroEL蛋白牙周膜干细胞成骨分化成脂分化

7. ERK5信号通路调控骨髓间充质干细胞成脂分化和成骨分化的机制研究

[学位论文] 杨信信兰州大学 2020年硕士导师: 夏亚一;耿彬共68页

摘要 : 目的：骨质疏松患者的骨组织内常出现大量脂肪细胞，但其发生机制尚不清楚。我们的前期研究提示抑制小鼠体内ERK5信号通路后，出现了骨量减少、脂肪细胞增多及成骨细胞减少的现象，推测ERK5对于维持骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Ce... 展开目的：骨质疏松患者的骨组织内常出现大量脂肪细胞，但其发生机制尚不清楚。我们的前期研究提示抑制小鼠体内ERK5信号通路后，出现了骨量减少、脂肪细胞增多及成骨细胞减少的现象，推测ERK5对于维持骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)成脂分化和成骨分化的平衡至关重要。本研究拟进一步从细胞水平研究ERK5信号通路调控骨髓间充质干细胞成脂分化和成骨分化平衡的分子机制，为临床治疗骨质疏松提供理论依据和思路。方法：(1)通过慢病毒感染BMSCs，插入ERK5干扰基因片段，再通过嘌呤霉素筛选，得到ERK5稳定低表达的小鼠BMSCs模型；(2)对ERK5基因沉默后的小鼠BMSCs进行成骨诱导，于诱导的第4d、9d和14d检测细胞内碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)活性，同时检测细胞于0-4d、4-9d和9-14d三个时间段分泌到培养基中骨钙素(Osteocalcin，OCN)的含量，并于诱导分化的第10d通过Real-timePCR技术检测ERK5和成骨标志基因Runt相关转录因子2(Runt-related Transcription Factor 2，RUNX-2)、ALP、骨形态发生蛋白2(Bone Morphogenic Protein 2，BMP2)的mRNA相对表达情况，最后在诱导21d后进行茜素红染色，观察成骨诱导后钙结节形成的情况；(3)对ERK5基因沉默后的小鼠BMSCs进行成脂诱导，于诱导分化的第10d通过Real-timePCR技术检测ERK5和成脂标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PeroxisomeProliferator-activatedReceptor-gamma，PPARγ)、CCAAT-增强子结合蛋白α(CCAATEnhancerBindingProteinAlpha，C/EBPα)、脂肪酸结合蛋白4(Fatty Acid Binding Protein 4，ap2)的mRNA相对表达情况，并于诱导28d后进行油红O染色，观察成脂诱导后脂肪细胞的形成情况。结果：(1)空载病毒CON077感染Balb/c小鼠BMSCs后并不影响ERK5的表达，而慢病毒ERK5-RNAi(83235-1)和ERK5-RNAi(83236-1)感染细胞后有效沉默了ERK5的表达；(2)在成骨诱导分化的过程中，沉默ERK5使得小鼠BMSCs内的ALP活性降低，分泌的OCN含量降低，成骨分化标志基因RUNX-2、ALP和BMP2的表达显著下调，茜素红染色后细胞内钙结节明显减少；(3)在成脂诱导分化的过程中，沉默ERK5使得成脂分化标志基因PPARγ、C/EBPα、ap2的表达显著上调，且在成脂诱导分化28天进行油红O染色时发现脂滴更多更大更圆。结论：(1)ERK5信号通路通过调控成骨分化的标志基因RUNX-2、ALP和BMP2，促进了小鼠BMSCs的成骨分化；(2)同时，ERK5信号通路通过调控成脂分化的标志基因PPARγ、C/EBPα和ap2，抑制了小鼠BMSCs的成脂分化。收起

关键词 : 骨质疏松 ERK5信号通路成脂分化成骨分化

8. 脂联素（AdipoQ）及其受体（AdipoR1/2）对山羊脂肪沉积的作用机制研究

[学位论文] 薛科四川农业大学 2014年硕士导师: 张红平;王林杰共59页

摘要 : 本试验目的是研究AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2对山羊脂肪沉积的作用机制，为后续通过AdipoQ来调控山羊肌肉中的脂肪酸合成，改善山羊肉品质提供依据。试验克隆得到南江黄羊AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2基因的全长编码区序列。利用半定量RT-PCR检测3个基因在... 展开本试验目的是研究AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2对山羊脂肪沉积的作用机制，为后续通过AdipoQ来调控山羊肌肉中的脂肪酸合成，改善山羊肉品质提供依据。试验克隆得到南江黄羊AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2基因的全长编码区序列。利用半定量RT-PCR检测3个基因在山羊11个组织（皮下脂肪、背最长肌、股二头肌、腓肠肌、卵巢、子宫、脑、瘤胃、肾脏、肝脏和心脏）中的表达模式。利用qPCR检测AdipoQ、Adipo R1和AdipoR2基因在南江黄羊出生后5个发育阶段(3d、30d、60 d、90 d和120 d)背最长肌中mRNA的相对表达量。利用含高浓度葡萄糖的培养基(25 mM/L)诱导山羊骨骼肌卫星细胞(Skeletal muscle satellite cells，SMSCs)向脂肪细胞分化，油红O染色检测细胞内脂肪滴的沉积，qPCR检测AdipoQ、AdipoR1、AdipoR2、脂肪酸合成及成脂分化相关基因的相对表达量。构建AdipoQ基因过表达载体pEGFP-N1-AD，并在山羊SMSCs中过表达AdipoQ基因。荧光显微镜检测融合蛋白的亚细胞定位，qPCR检测AdipoR1、AdipoR2、脂肪酸合成及成脂分化相关基因的相对表达量。结果如下: (1)克隆得到南江黄羊AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2基因的CDS区全序列（GenBank登录号分别为JX573539、KC286912和JX573540）。CDS区全长分别为720 bp、1128 bp和1176 bp，编码氨基酸数分别为239、375和391。南江黄羊与人、牛和猪AdipoQ基因核苷酸序列的一致性达到85％、97％和88％;AdipoR1基因核苷酸序列一致性为87％、97％和90％; AdipoR2基因核苷酸序列一致性为86％、97％和88％，表明3个基因在物种间高度保守。 (2)半定量RT-PCR检测到AdipoQ基因mRNA在脂肪组织中表达量最高，在肌肉组织和肝脏中表达量相对较低，其它组织中无表达。AdipoR1基因mRNA在所有组织中都有表达，在肌肉组织、瘤胃、脂肪组织中表达量较高，其它组织中表达量较低。AdipoR2基因mRNA同样在所有组织中都有表达，在脂肪组织、肌肉组织中表达量相对较高，在其它组织中表达量较低。3个基因主要在脂肪组织和肌肉组织中表达，表明3个基因在这些组织中起到重要作用。 (3)利用qPCR检测南江黄羊背最长肌(3d、30d、60 d、90 d和120 d) AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2基因mRNA的相对表达量，发现在南江黄羊公、母羊背最长肌中AdipoQ的表达相似，呈上升-下降-上升趋势，公羊中3d时表达量最低(P＜0.05)，120 d时表达量最高(P＜0.05);母羊中3d时表达量最低(P＜0.05)，60 d时表达量最高(P＜0.05)。AdipoR1在南江黄羊公羊背最长肌中表达趋势为下降-上升，在60 d时表达量最高(P＜0.05)，90 d时表达量最低(P＜0.05);母羊中表达趋势为下降-上升-下降，在30 d时表达量最低(P＜0.05)，60 d时表达量最高(P＜0.05)。AdipoR2在南江黄羊公、母羊背最长肌中表达趋势分别为下降-上升和下降-上升-下降，都是在30d时表达量最低(P＜0.05)，90 d时表达量最高(P＜0.05)。 (4)山羊SMSCs在高糖培养基诱导下合成脂肪酸，油红O染色发现培养6d后开始出现少量脂肪滴沉积，培养至10d时细胞内沉积大量脂肪滴，而低糖组无明显脂肪滴沉积。同时qPCR检测到脂肪酸合成及成脂分化相关基因ACC、FAS、C/EBPα、PPARγ和SREBP-1表达量均显著性升高，表明高糖能上调SMSCs中上述基因的表达，促进脂肪酸合成及向类脂肪细胞转化。在成脂分化过程中AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2表达量也有显著上升，表明AdipoQ及其受体基因可能参与了脂肪酸合成及成脂分化的调控。 (5)在山羊SMSCs中过表达AdipoQ基因，发现AdipoQ融合蛋白只在细胞质中表达，表明AdipoQ主要在细胞质中发挥作用。另外qPCR检测发现试验组中ACC、FAS、SREBP-1、AdipoR2基因表达量显著升高，而AdipoR1、C/EBPα、PPARγ基因表达量无明显变化，表明AdipoQ能上调ACC、FAS、SREBP-1和AdipoR2基因，促进脂肪酸的合成。收起

关键词 : 山羊脂联素脂肪沉积成脂分化基因表达

9. 猪DFATs成脂再分化与成肌转分化和分化早期Fad24的表达

[学位论文] 胡晓丽青岛农业大学 2018年硕士导师: 宋学雄共48页

摘要 : 本研究旨在明确猪去分化脂肪细胞（dedifferentiatedadipocytes,DFATs）成脂再分化与成肌转分化早期脂肪分化因子24（factor24foradipocytedifferentiation,Fad24）的表达模式，为证实Fad24为猪DFATs成脂再分化与成肌转分化启动的共性开关蛋白的研究奠... 展开本研究旨在明确猪去分化脂肪细胞（dedifferentiatedadipocytes,DFATs）成脂再分化与成肌转分化早期脂肪分化因子24（factor24foradipocytedifferentiation,Fad24）的表达模式，为证实Fad24为猪DFATs成脂再分化与成肌转分化启动的共性开关蛋白的研究奠定基础。研究采用“天花板培养”分离培养猪DFATs，用成脂诱导方法诱导猪DFATs成脂再分化，油红O染色和显微镜观察鉴定；用三种成肌诱导方法诱导猪DFATs的成肌转分化，显微镜观察进行形态学鉴定，间接免疫荧光法检测成肌细胞特异蛋白肌间线蛋白（Desmin）和肌球蛋白重链（myosinheavychain,MyHC）的表达,用实时荧光定量PCR技术检测成肌特异基因肌红蛋白（myoglobin,MyoG）mRNA的表达等；用实时荧光定量PCR技术分别检测猪DFATs成脂再分化和成肌转分化早期Fad24的表达模式。实验结果如下： 1.猪DFATs成脂再分化诱导将猪DFATs诱导成脂再分化，诱导3d时长梭状的DFATs开始变短，胞质中出现了少量且较小的亮泡状结构，经油红O染色鉴定证实为脂滴。随着诱导时间的增加，细胞质中的脂滴逐渐增多和增大。 2.猪DFATs成肌转分化诱导本研究采用三种在不同动物和不同细胞中诱导成肌转分化的方法，比较诱导猪DFATs成肌转分化的效果，旨在筛选诱导猪DFATs成肌转分化的较优方法。三种诱导成肌分化的方法包括，糖皮质激素（glucocorticoid,Glc）法、半乳糖凝集素-1（Galectin-1）法、5-氮杂胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine,5-aza）法。用三种方法分别诱导猪DFATs成肌转分化6d、15d和21d，分别用倒置显微镜观察分化的细胞形态；诱导21d后用间接免疫荧光法检测Desmin和MyHC的表达，用Real-timeRT-PCR检测MyoGmRNA的表达。诱导后的细胞形态学观察显示，Galectin-1法诱导的肌管形态最佳，多核细胞数量也最多；5-aza法次之，但诱导过程中细胞死亡率较高；Glc法诱导的细胞形态不规则，多形成放射状突起，而且出现较多成脂转分化细胞。间接免疫荧光分析显示，Galectin-1法和Glc法诱导的成肌细胞，Desmin和MyHC都呈强阳性表达，而在5-aza法诱导的细胞呈弱表达。Real-timeRT-PCR检测显示，Galectin-1法和Glc法诱导的成肌细胞MyoGmRNA表达量都很高，而5-aza法诱导的细胞MyoGmRNA表达量显著（p<0.05）低于Galectin-1法和Glc法。从诱导细胞的肌管形态、生存能力、特异蛋白和基因的表达量等综合判断，诱导猪DFATs成肌转分化，Galectin-1法优于Glc法和5-aza法。 3.猪DFATs成脂再分化与成肌转分化早期Fad24的表达模式为检测猪去分化脂肪细胞成脂再分化和成肌转分化早期Fad24的表达模式，将F3代猪DFATs分为2组，一组进行成脂再分化诱导，另一组进行成肌转分化诱导。每组分别诱导0h、3h、6h、12h、24h并提取总RNA，反转录cDNA，然后用Real-timeRT-PCR检测Fad24的相对表达量。在成脂再分化组，Fad24的相对表达量3h时达到峰值，随后下调，到24h时再升高；在成肌转分化组，Fad24的相对表达量也在3h时达到峰值，随后到12h为止一直处于下调状态。用上述三种方法诱导猪DFATs成肌转分化时，Galectin-1法诱导效果最佳；在诱导猪DFATs成脂再分化和成肌转分化早期，Fad24的表达量在诱导3h时都出现峰值，这表明Fad24在猪DFATs成脂再分化和成肌转分化启动过程中都发挥重要作用。收起

关键词 : 猪去分化脂肪细胞成脂再分化成肌转分化 Fad24基因转录调控

10. 成脂分化早期阶段C/EBPs对fad24的调控作用

[学位论文] 高素敏华中农业大学 2013年硕士导师: 雷霆共67页

摘要 : Fad24(factorforadipocytedifferentiation24)是一个在脂肪细胞分化早期阶段特异表达的基因。已有研究表明在前脂肪细胞(3T3-L1)中敲减fad24可抑制成脂分化早期的有丝克隆扩增(mitoticclonalexpansion，MCE)过程并阻断随后的终末分化，而在成纤维细胞... 展开 Fad24(factorforadipocytedifferentiation24)是一个在脂肪细胞分化早期阶段特异表达的基因。已有研究表明在前脂肪细胞(3T3-L1)中敲减fad24可抑制成脂分化早期的有丝克隆扩增(mitoticclonalexpansion，MCE)过程并阻断随后的终末分化，而在成纤维细胞(NIH/3T3)中超表达fad24则能赋予其成脂分化的能力。这表明fad24可促进成脂分化，但其作用机制尚不明确。本研究利用细胞转染、双荧光素酶报告基因、定点突变、染色质免疫共沉淀、荧光定量PCR和RNA干扰等技术对fad24的转录调控机制进行了分析，并探讨了其与成脂分化转录级联调控的关联。我们证实了CCAAT增强子结合蛋白(C/EBPβ和C/EBPδ)可直接结合于fad24启动子的顺式元件并调控其转录活性，进而对MCE过程进行调节，取得的主要结果如下: 1.获取小鼠fad24基因5'上游(-1128/+151)1279bp的区段并构建到荧光素酶报告基因载体，在NIH/3T3细胞中验证了其启动子活性。然后根据预测的C/EBP结合位点对其进行不同长度的截短（-896/+151、-450/+151、-164/+151），并分别对其启动子活性进行了验证。 2.将包含有fad24启动子截短片段的荧光素酶报告基因载体与C/EBPβ和C/EBPδ表达载体分别共转染细胞，发现C/EBPβ对fad24启动子活性有显著的下调作用，而C/EBPδ对其有显著的上调作用。 3.在3T3-L1细胞内超表达C/EBPβ和C/EBPδ对内源fad24转录水平的调节与其对fad24启动子的作用一致。 4.突变fad24启动子的-605/-591和-354/-340位点可减弱或消除C/EBPβ和C/EBPδ对fad24启动子的调节效应。 5.染色质免疫共沉淀实验证实在细胞内C/EBPβ和C/EBPδ均可直接结合于fad24启动子的-354/-340位点处。 6.在3T3-L1细胞中敲减C/EBPδ可下调fad24和cyclinD1的转录，并上调P21的mRNA水平，从而抑制MCE。在此细胞中超表达fad24可部分挽救敲减C/EBPδ引发的对细胞增殖的影响。收起

关键词 : fad24基因启动子成脂分化调控作用