摘要: 本研究旨在明确猪去分化脂肪细胞（dedifferentiatedadipocytes,DFATs）成脂再分化与成肌转分化早期脂肪分化因子24（factor24foradipocytedifferentiation,Fad24）的表达模式，为证实Fad24为猪DFATs成脂再分化与成肌转分化启动的共性开关蛋白的研究奠... 展开 本研究旨在明确猪去分化脂肪细胞（dedifferentiatedadipocytes,DFATs）成脂再分化与成肌转分化早期脂肪分化因子24（factor24foradipocytedifferentiation,Fad24）的表达模式，为证实Fad24为猪DFATs成脂再分化与成肌转分化启动的共性开关蛋白的研究奠定基础。研究采用“天花板培养”分离培养猪DFATs，用成脂诱导方法诱导猪DFATs成脂再分化，油红O染色和显微镜观察鉴定；用三种成肌诱导方法诱导猪DFATs的成肌转分化，显微镜观察进行形态学鉴定，间接免疫荧光法检测成肌细胞特异蛋白肌间线蛋白（Desmin）和肌球蛋白重链（myosinheavychain,MyHC）的表达,用实时荧光定量PCR技术检测成肌特异基因肌红蛋白（myoglobin,MyoG）mRNA的表达等；用实时荧光定量PCR技术分别检测猪DFATs成脂再分化和成肌转分化早期Fad24的表达模式。实验结果如下： 1.猪DFATs成脂再分化诱导 将猪DFATs诱导成脂再分化，诱导3d时长梭状的DFATs开始变短，胞质中出现了少量且较小的亮泡状结构，经油红O染色鉴定证实为脂滴。随着诱导时间的增加，细胞质中的脂滴逐渐增多和增大。 2.猪DFATs成肌转分化诱导 本研究采用三种在不同动物和不同细胞中诱导成肌转分化的方法，比较诱导猪DFATs成肌转分化的效果，旨在筛选诱导猪DFATs成肌转分化的较优方法。三种诱导成肌分化的方法包括，糖皮质激素（glucocorticoid,Glc）法、半乳糖凝集素-1（Galectin-1）法、5-氮杂胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine,5-aza）法。用三种方法分别诱导猪DFATs成肌转分化6d、15d和21d，分别用倒置显微镜观察分化的细胞形态；诱导21d后用间接免疫荧光法检测Desmin和MyHC的表达，用Real-timeRT-PCR检测MyoGmRNA的表达。诱导后的细胞形态学观察显示，Galectin-1法诱导的肌管形态最佳，多核细胞数量也最多；5-aza法次之，但诱导过程中细胞死亡率较高；Glc法诱导的细胞形态不规则，多形成放射状突起，而且出现较多成脂转分化细胞。间接免疫荧光分析显示，Galectin-1法和Glc法诱导的成肌细胞，Desmin和MyHC都呈强阳性表达，而在5-aza法诱导的细胞呈弱表达。Real-timeRT-PCR检测显示，Galectin-1法和Glc法诱导的成肌细胞MyoGmRNA表达量都很高，而5-aza法诱导的细胞MyoGmRNA表达量显著（p<0.05）低于Galectin-1法和Glc法。从诱导细胞的肌管形态、生存能力、特异蛋白和基因的表达量等综合判断，诱导猪DFATs成肌转分化，Galectin-1法优于Glc法和5-aza法。 3.猪DFATs成脂再分化与成肌转分化早期Fad24的表达模式 为检测猪去分化脂肪细胞成脂再分化和成肌转分化早期Fad24的表达模式，将F3代猪DFATs分为2组，一组进行成脂再分化诱导，另一组进行成肌转分化诱导。每组分别诱导0h、3h、6h、12h、24h并提取总RNA，反转录cDNA，然后用Real-timeRT-PCR检测Fad24的相对表达量。在成脂再分化组，Fad24的相对表达量3h时达到峰值，随后下调，到24h时再升高；在成肌转分化组，Fad24的相对表达量也在3h时达到峰值，随后到12h为止一直处于下调状态。 用上述三种方法诱导猪DFATs成肌转分化时，Galectin-1法诱导效果最佳；在诱导猪DFATs成脂再分化和成肌转分化早期，Fad24的表达量在诱导3h时都出现峰值，这表明Fad24在猪DFATs成脂再分化和成肌转分化启动过程中都发挥重要作用。 收起