中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 张旋旋中国科学院大学 2021年博士导师: 唐双焱共123页

摘要 : 转录调控蛋白广泛存在于细菌中，用以识别代谢产物或环境因子等，及时精密调控特定基因的转录表达，从而维持细胞稳态，提高细菌对外界环境的适应性。近年来，基于转录调控蛋白构建的生物传感器被用作高通量筛选及动态调控基因表达的工具，广泛应用于... 展开转录调控蛋白广泛存在于细菌中，用以识别代谢产物或环境因子等，及时精密调控特定基因的转录表达，从而维持细胞稳态，提高细菌对外界环境的适应性。近年来，基于转录调控蛋白构建的生物传感器被用作高通量筛选及动态调控基因表达的工具，广泛应用于代谢工程和合成生物学研究中。然而已报道的转录调控蛋白数目较少，导致生物传感器的构建与应用受限。本研究基于Corynebacterium glutamicum来源的VanR转录调控蛋白、Deinococcus radiodurans来源的HucR转录调控蛋白以及Pseudomaonas putia DOT-TIE来源的TtgR转录调控蛋白进行改造和应用。 VanR转录调控蛋白能特异性识别香草酸并调控C.glutamicum中香草酸代谢操纵子的转录表达。在香草酸缺乏时，VanR与调控序列结合，阻遏香草酸代谢基因的转录表达;在香草酸存在时，VanR与香草酸结合构象发生变化，从调控序列解离，香草酸代谢基因得以表达。本文利用定向进化手段对VanR进行改造，最终获得五个响应香草醛的突变体。其中，突变体V3-4在不加香草醛时渗漏表达最低，在加入香草醛时诱导倍数可达13.7倍。突变体V3-4仅特异性响应香草醛，对于VanR天然诱导物香草酸、以及香草醛结构类似物香草醇和阿魏酸均无响应。利用突变体V3-4构建的全细胞生物传感器作为高通量筛选工具，在添加底物阿魏酸的琼脂平板上利用蓝白筛选Escherichia coli基因组转座子突变文库，成功获得了香草醛产量提高的突变菌株。其中，ptsH基因失活阻断磷酸葡萄糖转移酶系统，导致细胞内磷酸烯酮式丙酮酸累积，促进乙酰辅酶A经乙酰磷酸生成乙酸以及香草醛合成途径所需的辅酶A和ATP，从而将香草醛产量提高45％。尽管编码膜蛋白的acrA基因缺失未明显提高香草醛产量，但菌落最蓝。通过检测细胞内香草醛与阿魏酸发现，ΔacrA细胞内香草醛浓度较野生型高，而阿魏酸浓度无明显变化。这表明AcrA可能参与了胞内香草醛的外运。随后，利用香草醛全细胞生物传感器建立了香草醛转运蛋白的筛选方法，获得了与香草醛内运相关的蛋白MhpT。转录调控蛋白与相应配体结合后构象发生变化，从而改变与调控序列的亲和力。基于该变构效应，可以在胞外构建新型小分子检测方法。利用PCR和荧光定量PCR技术扩增检测游离的调控序列DNA浓度变化，从而反映相应配体化合物的浓度。本文利用天然响应生物标志物尿酸的HucR转录调控蛋白和改造后特异性响应农药小分子西维因的TtgR转录调控蛋白突变体，在胞外建立了检测尿酸和西维因的方法，使用荧光定量PCR可检测1nM-1μM的尿酸和1-10nM的西维因。这一方法具有可定制、灵敏高效等优点。综上所述，本研究将转录调控蛋白应用于E.coli代谢途径的优化、E.coli基因组中与香草醛转运相关蛋白的筛选，以及建立胞外检测尿酸和西维因的新方法，极大拓展了转录调控蛋白在转运蛋白筛选和胞外检测领域的应用。收起

关键词 : VanR转录调控蛋白 HucR转录调控蛋白 TtgR转录调控蛋白蛋白筛选胞外检测

2. 大豆开花转录调控网络研究

[学位论文] 魏晶月中国科学院大学 2019年硕士导师: 董志诚共101页

摘要 : 植物整个生长发育过程要经历多次发育阶段的转换。高等开花植物进入成年期，能够感受外界环境刺激接受诱导，从成花感受态进入相对稳定的成花决定态，该过程被称为成花诱导。成花诱导受外界环境和内在因素共同调节，确保植物在适宜的外界环境，较好的... 展开植物整个生长发育过程要经历多次发育阶段的转换。高等开花植物进入成年期，能够感受外界环境刺激接受诱导，从成花感受态进入相对稳定的成花决定态，该过程被称为成花诱导。成花诱导受外界环境和内在因素共同调节，确保植物在适宜的外界环境，较好的自我生长状态下顺利开花，成功繁衍后代。对植物开花调控的研究，最早可以追溯到1865年Julius Sachs提出花激素概念。近30年，利用分子遗传学手段，在模式植物拟南芥、水稻中鉴定了大量开花时间调控基因，并建立了以转录因子为关键节点的调控网络。大豆是重要的经济作物，是食品、饲料、生物质能源的重要来源。作为短日照开花植物，大豆的开花时期和产量与种植区域密切相关。目前为止，通过正向遗传学手段已经定位到E1-E9、J等多个大豆开花QTL位点，其中E1和J基因编码转录因子，在开花过程中起中心作用。由于大豆生育期长、基因组复杂（经历了两次全基因组加倍）、并且遗传转化困难，正向遗传学研究周期长，每次只能鉴定一个到几个遗传位点及基因的功能，所以利用传统手段在短时间内无法全面揭示大豆开花过程的转录调控网络。真核生物基因表达活动复杂但又有条不紊，是生命活动的基础。反式作用因子和顺式作用元件是基因表达调控过程中的主要参与者;染色质结构的开放状态为转录因子招募RNA聚合酶Ⅱ提供了前提条件。新一代平行测序有效提高了DNA序列检测效率并降低了成本，由此衍生的染色质免疫共沉淀结合测序(ChIP-seq)、转录组测序(RNA-seq)和DNA酶Ⅰ敏感位点测序(DNase-seq)等技术，使得在基因组水平研究转录调控网络成为可能。由于遗传转化困难、缺乏转录因子的抗体等限制，难以利用ChIP-seq技术在大豆中鉴定转录因子的结合位点。本研究面向这一挑战，利用DNA亲和纯化测序(DAP-seq)技术与染色质开放区域测序技术(ATAC-seq)结合的策略，尝试建立大豆开花的转录调控网络。本研究初步建立了大豆DAP-seq和ATAC-seq的方法，获得了41个大豆开花过程关键转录因子的顺反组(cistrome)数据。分析了这些转录因子在基因组上结合位点的特征。利用RNA-seq技术获得了大豆由营养生长向生殖生长过程转变时，第一片三出复叶中转录活动的动态变化。利用ATAC-seq初步比较了转变过程前后染色质开放状态的变化。最终整合顺反组、转录组数据，初步搭建大豆开花的转录调控网络，为在基因组水平研究大豆开花诱导过程中转录的规律做了有益的尝试。收起

关键词 : 大豆开花过程转录调控网络

3. SGT促凋亡作用及Cyclin D3与VDR相互作用对其转录调控的影响研究

[学位论文] 王汉洲复旦大学 2005年博士导师: 顾建新共94页

摘要 : 第一部分,SGT的促凋亡功能研究:我们首先建立了SGT超表达的稳定细胞株，接下来用来诱导细胞凋亡实验结果显示SMMC-7721细胞中超表达SGT可以加速细胞凋亡并表现出细胞核碎裂等细胞凋亡特征；分别用CHX和STS诱导细胞凋亡的过程中，SGT的mRNA水平也有一定... 展开

关键词 : SGT Cyclin D3 转录调控 VDR

4. ERCC4基因启动子单倍型对转录调控影响的研究

[学位论文] 陈佩林华东师范大学 2008年硕士导师: 倪晓华共70页

摘要 : 肺癌是世界上最常见的肿瘤之一,在所有的恶性肿瘤中,肺癌的死亡率最高。吸烟引起的DNA损伤在肺癌的发生过程中起重要的作用。香烟中的多环芳烃、芳族胺、亚硝胺被认为是引起机体形成DNA加合物的主要致癌物,积累的DNA加合物能增加DNA损伤的可能性,损伤... 展开肺癌是世界上最常见的肿瘤之一,在所有的恶性肿瘤中,肺癌的死亡率最高。吸烟引起的DNA损伤在肺癌的发生过程中起重要的作用。香烟中的多环芳烃、芳族胺、亚硝胺被认为是引起机体形成DNA加合物的主要致癌物,积累的DNA加合物能增加DNA损伤的可能性,损伤的DNA会阻止DNA的复制和基因的转录,导致基因突变和肿癌的发生。NER(Nucleotide excision repair)是最通常的DNA修复途径,是修复吸烟产生的DNA加合物的主要途径。所以不正常的DNA修复系统能增加基因组的不稳定性以致引起基因的突变乃至肺癌的发生。人ERCC4(Excision repair cross-complementing rodent repair deficiency,complementation group 4)IXPF (Xeroderma pigmentosum,complementationgroupF)位于16p13.3-13.13,它的编码产物是NER途径关键酶之一,它与ERCCl蛋白形成复合物,不仅参与识别受损DNA,而且可以特异切割受损DNA片段的5'端。ERCC4基因缺陷能导致基因的不稳定和引起致癌作用。已有的研究显示在中国人群中(n=1010)ERCC4启动子区-644C/T(rs3136038)多态性与肺癌的发生紧密关联。为了阐明这种关联的分子机制,我们研究了ERCC4基因的启动区多态与基因表达调控的关系。生物信息学分析与ERCC4启动区多态位点结合的转录因子,并用EMSA实验加以验证和分析SNP多态是否影响转录因子结合。双荧光素酶报告系统实验显示不同ERCC4启动子单倍型有不同的转录活性,在HELF细胞中,与其它单倍型启动子相比,野生大单倍型启动子-644C/-357A有较高的启动子转录活性。荧光定量PCR实验结果表明烟雾抽取物(CSE)能极大地抑制ERCC4基因的表达。在CSE条件下,细胞转染实验结果说明野生大单倍型-644C/-357A对CSE的损伤有较好的保护作用。 EMSA实验结果表明CREB和CRE-BP1可能是结合在ERCC4启动子-644和-357位点的转录因子,大单倍型-644C/-357A能增强与CREB和CRE-BP1的结合能力。 -644C/T(rs3136038)基因型与ERCC4表达水平研究结果显示,与野生纯合基因型相比,突变纯合基因型携带者的外周血白细胞有较低的ERCC4表达水平。我们的研究结果表明基因和环境因子共同调节ERCC4基因的表达,我们推测ERCC4转录调控很可能遵循以下模式：化学致癌物→DNA损伤等应激信号→细胞信号转导途径激活→基因表达改变→DNA损伤修复能力提高或降低,不同基因型的ERCC4受外界DNA损伤条件诱导表达能力可能不同。我们的研究有助于阐明肺癌的发生机理。收起

关键词 : ERCC4基因转录调控恶性肿瘤

5. CiACS1在柑橘株高及成花调控中的作用

[学位论文] 闫振华中农业大学 2021年硕士导师: 胡春根共69页

摘要 : 矮化有利于植株养分的积累和运输，改善果树的营养状况，在果树生产上具有重要价值。然而当前我国乔化果树修剪管理成本较高，具有矮化性状的果树品种又相对较少。因此，利用分子生物技术解析柑橘矮化机制，培育矮化果树品种并推广矮化高效栽培模式在... 展开矮化有利于植株养分的积累和运输，改善果树的营养状况，在果树生产上具有重要价值。然而当前我国乔化果树修剪管理成本较高，具有矮化性状的果树品种又相对较少。因此，利用分子生物技术解析柑橘矮化机制，培育矮化果树品种并推广矮化高效栽培模式在生产中具有重要意义。本实验室前期研究发现，柑橘中乙烯合成关键酶基因CiACS1（1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶）遗传转化烟草后表现出矮化和晚花的表型。本研究在此基础上进一步探究了CiACS1介导的乙烯生物合成途径参与调控植物株高和成花的机制。主要研究结果如下： 1.相较于野生型烟草，T2代的CiACS1转基因烟草株高、节间距、生长素、脱落酸和赤霉素含量以及CiGA20OX、CiFT和CiAP1等成花相关基因的表达量均显著降低，而叶片数显著增多；通过显微观察发现，CiACS1转基因烟草叶细胞较小，横向切面的茎细胞较大，纵向切面茎细胞较短小； 2.拟南芥GUS染色结果表明，CiACS1启动子能响应外源多效唑和乙烯的处理；进一步用外源乙烯和多效唑处理成年柠檬树后，CiACS1和CiERF23表达量均显著升高；而赤霉素处理后CiACS1、CiGA20OX、CiFT和CiAP1等基因的表达量均显著下降。 3.通过酵母单杂交实验筛选到一个乙烯响应因子（CiERF23）；EMSA证实CiERF23蛋白特异性结合在CiACS1启动子的“TGTCGGTG”位点；转录活性实验和LUC实验证实CiERF23具有转录激活活性，对CiACS1具有正向转录调控作用。 4.生物信息学分析发现，CiERF23属于ERF转录因子家族，含一个AP2结构域，在不同物种间，CiERF23蛋白与胡杨同源性最高；qRT-PCR实验表明CiERF23主要在顶端和叶片中表达；亚细胞定位结果表明CiERF23在细胞核中特异性表达，为典型的核定位转录因子；此外，相对于野生型烟草，超表达CiERF23植株叶片数显著增多。综上所述，本研究证实乙烯响应转录因子CiERF23对CiACS1的正向调控作用，并且CiACS1可能通过介导乙烯和赤霉素信号途径调控柑橘株高和成花。收起

关键词 : 柑橘成花性状 CiACS1 转录调控

6. CsETR1启动子上的顺式作用元件在黄瓜雌花雄蕊发育中的作用

[学位论文] 邹枨北京大学 2006年博士导师: 白书农共135页

摘要 : 单性花的发育是研究器官形成调控机制的重要模型之一。在单性花发育中，绝大多数都在花发育的早期形成了4轮花器官原基，只是由于非正常的性器官在随后发育中的特定阶段发生滞育，只有一种性器官发育成熟并具有功能，才导致了单性花的形成。本实验室对... 展开单性花的发育是研究器官形成调控机制的重要模型之一。在单性花发育中，绝大多数都在花发育的早期形成了4轮花器官原基，只是由于非正常的性器官在随后发育中的特定阶段发生滞育，只有一种性器官发育成熟并具有功能，才导致了单性花的形成。本实验室对黄瓜雌花中雄蕊发育的研究发现乙烯参与了诱导黄瓜雌花中花药特异的DNA断裂，CsETR1在黄瓜雌花发育6期的雄蕊特异的下调是控制黄瓜雌花雄蕊发育的关键因素。本项研究的核心问题就是探讨CsETR1是如何在基因表达调控层面上被时空特异性下调的。通过研究CsETR1启动子，并与拟南芥的ETR1启动子比较，发现在两个启动子上都存在着CArGbox顺式作用元件，通过瞬时转录激活实验证明黄瓜的CsMADS1和CUM1能够与黄瓜ETR1启动子上的CArGbox顺式作用元件结合，而这两个蛋白和拟南芥中的B类基因AP3+PI都不能与拟南芥ETR1启动子上的CArGbox顺式作用元件结合。CsMADS1与CsETR1启动子的结合用染色质免疫共沉淀的方法进一步在黄瓜体内得到了验证。通过在拟南芥中转入CsETR1启动子接报告基因和雌激素诱导表达的黄瓜MADS家族蛋白CsMADS1和CUM1，发现这种结合在转基因拟南芥体内表现为CsMADS1和CUM1的表达对CsETR1的表达起转录抑制的作用。由于这两个黄瓜MADS家族基因的表达有时空特异性，本研究发现的黄瓜MADS基因与ETR1启动子上顺式作用元件的结合作用，可以推测：黄瓜ETR1的器官时空特异性表达变化可能是受到时空特异性表达的MADS家族蛋白转录水平上调控的结果，MADS家族的蛋白通过与黄瓜ETR1启动子上的顺式作用元件相互作用，一定程度上影响了黄瓜ETR1基因表达的时空特异性。这项研究结果研究了黄瓜雌花雄蕊性别分化的过程中关键基因的表达调控，它不仅帮助我们理解ETR1器官特异性下调的问题，还为我们了解两性花和单性花的演化提供了新的提示。收起

关键词 : 黄瓜雄蕊乙烯转录调控家族蛋白

7. PGC-1α调节黄体生成素和醛固酮合成以及葡萄糖激酶表达的分子机制研究

[学位论文] 朱鏐娈北京协和医学院(中国医学科学院) 2005年博士导师: 方福德;常永生共129页

摘要 : 过氧化物酶体增殖激活受体r共激活因子la(PGC-la)能共刺激多种转录因子从而调节能量代谢进程。核受体类固醇激素生成因子(SF-1)在垂体、性腺、肾上腺等内分泌组织中高表达，转录调控多种关键基因，同时调节下丘脑一垂体一性腺轴多水平的激素合成。为探... 展开过氧化物酶体增殖激活受体r共激活因子la(PGC-la)能共刺激多种转录因子从而调节能量代谢进程。核受体类固醇激素生成因子(SF-1)在垂体、性腺、肾上腺等内分泌组织中高表达，转录调控多种关键基因，同时调节下丘脑一垂体一性腺轴多水平的激素合成。为探索PGC-1 a在类固醇激素合成及垂体激素分泌中的作用，本课题以小鼠垂体促性腺aT3-1细胞为研究模型，过表达PGC-la后，通过real-time PCR实验检测到LHp和aGSU在mRNA水平的表达量升高，又进一步通过酶联免疫吸附试验(ELISA)证明，PGC-la刺激aT3-1细胞分泌的黄体生成素增加。分析LHβ启动子序列，发现-127 by-119 by位点存在一个SF-1结合元件GSE(gonadotrope-specific element),突变该元件后，双荧光报告实验证明SF-1和PGC-la对LHp启动子的刺激作用全部消失。染色质免疫沉淀实验证明PGC-la与SF-1共定位在LHp启动子区含GSE元件的区域，并促进LHp转录。为进一步证明PGC-1 a对SF-1的共刺激作用，分析了二者相互作用的分子机制。哺乳动物双杂交实验和免疫共沉淀实验证明PGC-la与SF-1能在体内形成复合物，进一步GST pull-down实验证明二者能直接相互作用。该作用发生在PGC-1 a的N端1180氨基酸区域(含LXXLL模体，142146氨基酸)与SF-1 C端187462氨基酸区之间。构建不同长度的SF-1基因表达片段发现，只有当SF-1的最适激活结构域(proximal activation domain)和AF-2结构域同时存在时，PGC-1 a和SF-1‘能直接结合。肾上腺皮质是最主要的类固醇激素合成部位，细胞色素P450家族成员在此参与胆固醇代谢、类固醇激素合成的多个催化反应。Cyp11 b2基因编码的蛋白质产物负责催化醛固酮合成的最后三步反应，是醛固酮合成的限速酶。在小鼠肾上腺皮质Y1细胞中，real-time PCR实验证明，PGC-1 a能促使Cypllb2 Cypllbl和P450scc基因在mRNA水平表达上调，ELISA实验进一步检测到PGC-1 a协同SF-1促进细胞醛固酮的分泌。另一方面，通过双荧光报告实验检测到PGC-la与雌激素受体相关受体家族成员ERRa和ERRy共同促进SF-1转录，在过表达PGC-1 a的aT3-1细胞和Y1细胞中，SF-1在mRNA水平和蛋白质水平的表达量均显著提高。综上所述，本课题揭示了PGC-1 a在类固醇激素和促性腺激素合成中具有重要的调节作用，分析了其刺激激素合成的分子机制，提示PGC-1 a可能通过SF-1调节性腺和肾上腺的发育以及性别分化。收起

关键词 : 转录调控葡萄搪代谢胰岛素

8. 鱼腥藻PCC7120中异形胞分化所需基因hetZ的转录调控

[学位论文] 杜野中国科学院研究生院 2010年博士导师: 徐旭东共120页

摘要 : 鱼腥藻PCC7120是研究原核细胞分化和图式形成的模式生物,在缺乏可利用的氮盐时,约有10％的营养细胞以半规律的图式形成终极分化的固氮细胞--异形胞。本实验室宁德刚(2004)通过转座子插入诱变发现一个与异形胞分化及图式形成相关的基因丛,张维(2007)对... 展开鱼腥藻PCC7120是研究原核细胞分化和图式形成的模式生物,在缺乏可利用的氮盐时,约有10％的营养细胞以半规律的图式形成终极分化的固氮细胞--异形胞。本实验室宁德刚(2004)通过转座子插入诱变发现一个与异形胞分化及图式形成相关的基因丛,张维(2007)对该基因丛重新进行了注释,证实其中的hetZ基因对于异形胞分化起重要作用。本文着重研究hetZ的转录调控,发现异形胞分化的主调控因子HeLR可以直接识别结合hetZ的上游序列,调节其表达。主要的研究内容及结果如下: 第一,hetZ以及“头对头”排列的all0097的转录表达关系。通过5'-RACE方法确定了hetZ和all0097基因的转录起始位点,以gfp为报告基因检测了hetZ和all0097上游一系列缺失片段的转录活性,确定了二者启动转录所需区域,发现hetZ在异形胞中表达上调,而all0097在异形胞中表达下调。all0097的反向转录能削弱hetZ在营养细胞中的表达,增加其在异形胞和营养细胞表达水平的反差。第二,hetZ的转录表达受RGSGR的抑制。抑制异形胞分化的小肽PatS和蛋白HetN都含有RGSGR序列,带有RGSGR的小肽可能从异形胞扩散出来抑制邻近细胞的分化。PhetZ-gfp在patA::C.K突变株中趋近末端异形胞的营养细胞中呈现渐近渐弱的表达梯度。这种梯度可以被外加的RGSGR抑制。PhetZ-gfp在patA::C.K/nifH::C.CE2双突变株中也呈现相似的表达梯度,可见异形胞固氮作用不决定梯度的形成。此外,在hetZ突变株中,即使在有氮培养条件下,PhetZ-gfp的表达水平比野生型也有大幅提高,而外加RGSGR可抑制其表达。第三,通过EMSA和竞争实验研究了hetZ上游序列与HetR相结合的区域。通过逐渐缩小范围,发现一个40bp区域为HetR识别结合,并证明该片段对于hetZ的转录是必需的,RGSGR五肽可以抑制二者的结合。另外,在hetZ::C.K突变株中过量表达hetR并不在缺氮条件下产生成串异形胞,而是呈现hetZ突变株表型。因此,在异形胞分化的基因调控途径中,hetZ应受HetR直接调控,而HetR部分依赖于HetZ对异形胞分化发挥调控作用。本研究得到以下结论:hetZ作为调控异形胞分化的重要基因,其表达完全依赖于HetR；HetR可识别结合hetZ启动子调控其表达,这种结合受RGSGR抑制;HetZ对于HetR调控异形胞分化起重要作用。收起

关键词 : 鱼腥藻异形胞分化转录调控

9. KLF2调控GATA2抑制鸡腹部脂肪细胞形成的功能影响及机制研究

[学位论文] 高琴石河子大学 2023年硕士导师: 慕晓玲；张志威共89页

摘要 : 目的: KLF2与GATA2是脂肪细胞生成的重要负调控因子，经课题组前期研究结果显示在鸡腹部脂肪组织中KLF2和GATA2均有表达，在体外细胞水平过表达KLF2或GATA2均可以抑制PPARγ和油酸诱导的鸡前脂肪细胞分化，但关于KLF2和GATA2是否相互作用尚未见报... 展开目的: KLF2与GATA2是脂肪细胞生成的重要负调控因子，经课题组前期研究结果显示在鸡腹部脂肪组织中KLF2和GATA2均有表达，在体外细胞水平过表达KLF2或GATA2均可以抑制PPARγ和油酸诱导的鸡前脂肪细胞分化，但关于KLF2和GATA2是否相互作用尚未见报道，本研究将鸡作为实验的模式动物，探究了KLF2对脂肪细胞形成的功能影响以及转录因子KLF2调控GATA2在鸡腹部脂肪沉积中的功能作用及机制。方法: 1.采用Spearman相关分析方法研究脂肪组织中KLF2与GATA2表达水平的相关性。 2.油红O染色技术、细胞流式技术以及细胞增殖实验研究KLF2对鸡前脂肪细胞增殖和分化的影响。 3.半定量PCR、Real-timeqPCR技术以及蛋白质印迹法检测分析KLF2、GATA2、GATA3、KLF7、PPARγ、C/EBPα在鸡前脂肪细胞中的mRNA和蛋白表达量。 4.PCR克隆的方法获得鸡GATA2转录起始位点上(-2000/+1)的序列，并构建报告基因重组载体。 5.双荧光素酶报告基因技术研究过表达KLF2、KLF3、KLF7、GATA2,GATA3对GATA2基因5''侧翼区(-2000/+1)启动子活性，过表达KLF2对鸡前脂肪细胞重要功能基因PPARγ、C/EBPα、LPL、FASN、PLIN和FABP4启动子活性的影响，过表达KLF2对脂肪生成调控网络基因GATA2、KLF7、GATA3、C/EBPZ、CCNB1启动子活性的影响以及过表达KLF2对GATA2、KLF7不同长度片段的启动子活性的影响。 6.转染干扰KLF2片段，通过半定量PCR、Real-timeqPCR技对GATA2、KLF2基因内源性miRNA检测，Westernblot检测GATA2、KLF7、PPARγ、KLF2、C/EBPZ蛋白表达量以及双荧光素酶技术转染KLF2siRNA片段对GATA2不同长度的启动子活性的影响。 7.ChIP-PCR技术研究KLF2调控GATA2表达的作用机制。结果: 1.在脂肪组织中KLF2与GATA2的表达模式 Spearman秩相关分析结果显示无论是腹部脂肪组织还是皮下脂肪组织人KLF2和GATA2的表达数据均存在显著正相关(r＞0.3,P＜0.05)。 2.KLF2调控鸡前脂肪细胞增殖和分化油红O染色分析显示，经油酸诱导的0h,24h,48h,72h,96h,120h鸡前脂肪细胞，存在自分化现象并且细胞内脂滴的含量随着诱导时间的增加而增多，其KLF2的内源性mRNA和蛋白表达量逐渐降低;转染过表达KLF2抑制油酸诱导的鸡前脂肪细胞分化(P＜0.01),促进鸡前脂肪细胞增殖。流式细胞周期实验结果显示:过表达KLF2的鸡前脂肪细胞在G0期细胞G2期和S期细胞的比例没有显著差异(P＞0.05),但在细胞增殖实验中显示过表达KLF2分别在48h、72h和96h促进鸡前脂肪细胞增殖，效应显著。此外，荧光素酶报告基因显示:过表达KLF2显著抑制鸡PPARγ、C/EBPα、FABP4的启动子活性(P＜0.05),显著促进FASN、LPL、GATA2、C/EBPZ、CCNB1、KLF7启动子活性(P＜0.05)以及对KLF7不同长度启动子活性促进显著(P＜0.05),对GATA3启动子活性也具有促进趋势(P=0.07)。Real-timePCR和Westernblot显示:过表达KLF2显著抑制鸡前脂肪细胞中PPARγ的表达(P＜0.05)。 3.KLF2对GATA2的转录调控研究鸡GATA2的5''侧翼序列pGL4.10-GATA2(-2000/+1)有明显的启动子活性(P＜0.01)。将pGL4.10-GATA2(-2000/+1)启动子报告基因质粒与GATA2、GATA3、KLF2和KLF3过表达质粒共转染,荧光素酶报告基因结果显示:与EV组相比，过表达KLF2显著促进鸡GATA2(-2000/+1)启动子活性(P＜0.01),过表达KLF3抑制鸡GATA2(-2000/+1)启动子活性(P＜0.05),过表达GATA2和GATA3对鸡GATA2(-2000/+1)启动子活性没有显著影响(P＞0.05),过表达KLF7对GATA2(-2000/+1)启动子活性没有显著影响(P＞0.05)。鸡GATA2的5''侧翼区域的(-2000/+1)、(-1290/+1)、(-864/+1)、(-580/+1)、(-296/+1)、(-168/+1)、(-157/+1)、(-109/+1)、(-58/+1)的荧光素酶报告基因显示:GATA2所有长度启动子均有荧光素酶活性(P＜0.01)。 GATA2启动子报告基因质粒与KLF2过表达质粒共转染鸡前脂肪细胞后的荧光素酶报告基因分析，结果显示:KLF2对GATA2(-58/+1)启动子活性的促进作用最明显(P＜0.01)。将不同质量浓度的KLF2过表达质粒与pGL4.10-GATA2(-296/+1)启动子共转染，结果显示:随着pCMV-Myc-KLF2质粒质量的不断增加，GATA2荧光素酶活性逐渐升高，存在明显的剂量效应(P＜0.001)。Real-timePCR和半定量PCR结果显示:KLF2上调GATA2的mRNA表达(P＜0.01)。蛋白质印迹结果显示:过表达KLF2促进GATA2的蛋白表达。 KLF2siRNA与鸡GATA2的5''侧翼区域的(-2000/+1)、(-1290/+1)、(-864/+1)、(-580/+1)、(-296/+1)、(-168/+1)、(-157/+1)、(-109/+1)、(-58/+1)以及pCMV-Myc共转染的报告基因显示:GATA2所有长度启动子均有荧光素酶活性(P＜0.01)。Real-timePCR和半定量PCR结果显示:转染KLF2siRNA片段上调PPARγ和C/EBPα的mRNA表达，下调GATA2、KLF2、KLF7的mRNA表达(P＜0.01)。此外，蛋白质印迹结果显示:转染KLF2siRNA片段促进PPARγ的表达，抑制GATA2的蛋白表达; ChIP-PCR结果显示:在GATA2启动子(-2001/+1)区域内设计引物对(1784F-1985R、430F-590R、269F-448R),均可检测到符合预期大小的特异条带，以翻译起始位点附近的(-296/+1)区间(1784F-1985R)效应最明显，在实验组KLF2中，c-Myc抗体IP组在250bp处左右的条带亮度强于IgG组，与预测大小269bp接近，表明了KLF2可以通过与GATA2启动子的多个结合位置点调控其转录活性KLF2与GATA2启动子区存在多个核苷酸序列结合位点。结论: 1.KLF2抑制脂肪细胞分化，促进脂肪细胞增殖，影响鸡脂肪细胞形成。 2.KLF2可以调控脂肪细胞肥大。 3.GATA2和KLF7可能是鸡KLF2的下游靶基因。收起

关键词 : 脂肪组织 KLF2 GATA2 转录调控

10. 肺癌特异性DKK1基因转录调控元件的分析预测及活性筛选

[学位论文] 李文茂华侨大学 2014年硕士导师: 许瑞安共89页

摘要 : DKK1是经典 wnt信号通路的拮抗剂。它可以与 Lrp5/6受体结合,对 wnt信号通路产生竞争性抑制作用。此外DKK1还能够与亲和受体Kremen及Lrp6受体结合,诱导产生内吞作用,从而减少细胞膜表面 Lrp6受体的数量。DKK1能够在肺癌中特异性、高水平表达。DKK1主要... 展开 DKK1是经典 wnt信号通路的拮抗剂。它可以与 Lrp5/6受体结合,对 wnt信号通路产生竞争性抑制作用。此外DKK1还能够与亲和受体Kremen及Lrp6受体结合,诱导产生内吞作用,从而减少细胞膜表面 Lrp6受体的数量。DKK1能够在肺癌中特异性、高水平表达。DKK1主要在胚胎组织中表达,在正常细胞中不表达。但是 DKK1在多种非小细胞细胞系、组织中均高水平表达。与其它恶性肿瘤、良性肺疾病和健康对照组相比,肺癌患者血清中 DKK1浓度显著升高,可作为肺癌诊断的一种血清标志物。目前关于肺癌中 DKK1特异性高表达的调控机制研究鲜有报道。我们的研究发现 DKK1启动子在肺癌细胞中的活性并不是很高,说明可能存在增强子等元件调控DKK1的表达。因此DKK1增强子元件的筛选将有助于DKK1的肺癌特异性调控机制研究。本研究的关键难点在于对 DKK1基因增强子等转录调控元件在基因组中的分布进行预测及定位。为此,本文将四段不同长度的 DKK1启动子片段构建到pGL3-basic载体中。我们将构建得到的重组载体转染A549、H460、H446、Eca-109、Chang liver和 HEK293细胞,并通过双荧光素酶报告基因系统检测不同长度DKK1启动子片段活性,最终我们确定 DKK1-5片段活性较好,可作为 DKK1基因近端启动子片段。然后通过 UCSC人类基因组浏览器获取 A549细胞中DKK1基因位点的DNase I超敏性、组蛋白修饰等表观遗传信息。通过对这些信息的分析,预测得到12条候选增强子元件片段。最后将候选片段分别插入到DKK1-5近端启动子上游,成功构建了12种重组质粒。并在细胞水平上通过双荧光素酶报告基因检测系统验证相关候选元件的增强子活性。本文首次获得六段候选元件: TRE3、TRE4、TRE6、TRE7、TRE8、TRE12在A549细胞中对DKK1启动子具有显著增强作用。TRE3、TR4、TRE12在H460中具有显著增强作用。且TRE3、TRE4、TRE7、TRE8对DKK1启动子的增强作用具有非小细胞肺癌特异性。收起

关键词 : 肺癌 DKK1基因转录调控元件活性筛选