摘要: 目的: KLF2与GATA2是脂肪细胞生成的重要负调控因子，经课题组前期研究结果显示在鸡腹部脂肪组织中KLF2和GATA2均有表达，在体外细胞水平过表达KLF2或GATA2均可以抑制PPARγ和油酸诱导的鸡前脂肪细胞分化，但关于KLF2和GATA2是否相互作用尚未见报道... 展开 目的: KLF2与GATA2是脂肪细胞生成的重要负调控因子，经课题组前期研究结果显示在鸡腹部脂肪组织中KLF2和GATA2均有表达，在体外细胞水平过表达KLF2或GATA2均可以抑制PPARγ和油酸诱导的鸡前脂肪细胞分化，但关于KLF2和GATA2是否相互作用尚未见报道，本研究将鸡作为实验的模式动物，探究了KLF2对脂肪细胞形成的功能影响以及转录因子KLF2调控GATA2在鸡腹部脂肪沉积中的功能作用及机制。 方法: 1.采用Spearman相关分析方法研究脂肪组织中KLF2与GATA2表达水平的相关性。 2.油红O染色技术、细胞流式技术以及细胞增殖实验研究KLF2对鸡前脂肪细胞增殖和分化的影响。 3.半定量PCR、Real-timeqPCR技术以及蛋白质印迹法检测分析KLF2、GATA2、GATA3、KLF7、PPARγ、C/EBPα在鸡前脂肪细胞中的mRNA和蛋白表达量。 4.PCR克隆的方法获得鸡GATA2转录起始位点上(-2000/+1)的序列，并构建报告基因重组载体。 5.双荧光素酶报告基因技术研究过表达KLF2、KLF3、KLF7、GATA2,GATA3对GATA2基因5''侧翼区(-2000/+1)启动子活性，过表达KLF2对鸡前脂肪细胞重要功能基因PPARγ、C/EBPα、LPL、FASN、PLIN和FABP4启动子活性的影响，过表达KLF2对脂肪生成调控网络基因GATA2、KLF7、GATA3、C/EBPZ、CCNB1启动子活性的影响以及过表达KLF2对GATA2、KLF7不同长度片段的启动子活性的影响。 6.转染干扰KLF2片段，通过半定量PCR、Real-timeqPCR技对GATA2、KLF2基因内源性miRNA检测，Westernblot检测GATA2、KLF7、PPARγ、KLF2、C/EBPZ蛋白表达量以及双荧光素酶技术转染KLF2siRNA片段对GATA2不同长度的启动子活性的影响。 7.ChIP-PCR技术研究KLF2调控GATA2表达的作用机制。 结果: 1.在脂肪组织中KLF2与GATA2的表达模式 Spearman秩相关分析结果显示无论是腹部脂肪组织还是皮下脂肪组织人KLF2和GATA2的表达数据均存在显著正相关(r＞0.3,P＜0.05)。 2.KLF2调控鸡前脂肪细胞增殖和分化 油红O染色分析显示，经油酸诱导的0h,24h,48h,72h,96h,120h鸡前脂肪细胞，存在自分化现象并且细胞内脂滴的含量随着诱导时间的增加而增多，其KLF2的内源性mRNA和蛋白表达量逐渐降低;转染过表达KLF2抑制油酸诱导的鸡前脂肪细胞分化(P＜0.01),促进鸡前脂肪细胞增殖。流式细胞周期实验结果显示:过表达KLF2的鸡前脂肪细胞在G0期细胞G2期和S期细胞的比例没有显著差异(P＞0.05),但在细胞增殖实验中显示过表达KLF2分别在48h、72h和96h促进鸡前脂肪细胞增殖，效应显著。此外，荧光素酶报告基因显示:过表达KLF2显著抑制鸡PPARγ、C/EBPα、FABP4的启动子活性(P＜0.05),显著促进FASN、LPL、GATA2、C/EBPZ、CCNB1、KLF7启动子活性(P＜0.05)以及对KLF7不同长度启动子活性促进显著(P＜0.05),对GATA3启动子活性也具有促进趋势(P=0.07)。Real-timePCR和Westernblot显示:过表达KLF2显著抑制鸡前脂肪细胞中PPARγ的表达(P＜0.05)。 3.KLF2对GATA2的转录调控研究 鸡GATA2的5''侧翼序列pGL4.10-GATA2(-2000/+1)有明显的启动子活性(P＜0.01)。将pGL4.10-GATA2(-2000/+1)启动子报告基因质粒与GATA2、GATA3、KLF2和KLF3过表达质粒共转染,荧光素酶报告基因结果显示:与EV组相比，过表达KLF2显著促进鸡GATA2(-2000/+1)启动子活性(P＜0.01),过表达KLF3抑制鸡GATA2(-2000/+1)启动子活性(P＜0.05),过表达GATA2和GATA3对鸡GATA2(-2000/+1)启动子活性没有显著影响(P＞0.05),过表达KLF7对GATA2(-2000/+1)启动子活性没有显著影响(P＞0.05)。 鸡GATA2的5''侧翼区域的(-2000/+1)、(-1290/+1)、(-864/+1)、(-580/+1)、(-296/+1)、(-168/+1)、(-157/+1)、(-109/+1)、(-58/+1)的荧光素酶报告基因显示:GATA2所有长度启动子均有荧光素酶活性(P＜0.01)。 GATA2启动子报告基因质粒与KLF2过表达质粒共转染鸡前脂肪细胞后的荧光素酶报告基因分析，结果显示:KLF2对GATA2(-58/+1)启动子活性的促进作用最明显(P＜0.01)。将不同质量浓度的KLF2过表达质粒与pGL4.10-GATA2(-296/+1)启动子共转染，结果显示:随着pCMV-Myc-KLF2质粒质量的不断增加，GATA2荧光素酶活性逐渐升高，存在明显的剂量效应(P＜0.001)。Real-timePCR和半定量PCR结果显示:KLF2上调GATA2的mRNA表达(P＜0.01)。蛋白质印迹结果显示:过表达KLF2促进GATA2的蛋白表达。 KLF2siRNA与鸡GATA2的5''侧翼区域的(-2000/+1)、(-1290/+1)、(-864/+1)、(-580/+1)、(-296/+1)、(-168/+1)、(-157/+1)、(-109/+1)、(-58/+1)以及pCMV-Myc共转染的报告基因显示:GATA2所有长度启动子均有荧光素酶活性(P＜0.01)。Real-timePCR和半定量PCR结果显示:转染KLF2siRNA片段上调PPARγ和C/EBPα的mRNA表达，下调GATA2、KLF2、KLF7的mRNA表达(P＜0.01)。此外，蛋白质印迹结果显示:转染KLF2siRNA片段促进PPARγ的表达，抑制GATA2的蛋白表达; ChIP-PCR结果显示:在GATA2启动子(-2001/+1)区域内设计引物对(1784F-1985R、430F-590R、269F-448R),均可检测到符合预期大小的特异条带，以翻译起始位点附近的(-296/+1)区间(1784F-1985R)效应最明显，在实验组KLF2中，c-Myc抗体IP组在250bp处左右的条带亮度强于IgG组，与预测大小269bp接近，表明了KLF2可以通过与GATA2启动子的多个结合位置点调控其转录活性KLF2与GATA2启动子区存在多个核苷酸序列结合位点。 结论: 1.KLF2抑制脂肪细胞分化，促进脂肪细胞增殖，影响鸡脂肪细胞形成。 2.KLF2可以调控脂肪细胞肥大。 3.GATA2和KLF7可能是鸡KLF2的下游靶基因。 收起