摘要: 围脂滴蛋白1(PLIN1)是脂滴表面最丰富的结构蛋白，对脂质的合成和脂解起到重要的调控作用。本研究小组前期利用不同猪种模型开展猪体型发育、肌肉发育差异研究，筛选出包括PLIN1基因在内的一批不同肌肉组织中表达差异显著的基因。本研究拟从细胞层面研... 展开 围脂滴蛋白1(PLIN1)是脂滴表面最丰富的结构蛋白，对脂质的合成和脂解起到重要的调控作用。本研究小组前期利用不同猪种模型开展猪体型发育、肌肉发育差异研究，筛选出包括PLIN1基因在内的一批不同肌肉组织中表达差异显著的基因。本研究拟从细胞层面研究PLIN1基因对骨骼肌卫星细胞(skeletalmusclesatellitecells,SMSCs)成肌和成脂分化功能的影响，并且构建骨骼肌组织中特异性敲除PLIN1基因的条件性敲除小鼠模型研究PLIN1基因对骨骼肌发育的表型变化及功能影响。从而全面研究PLIN1基因对肌肉发育和肉质的具体影响，有助于推进家猪产肉性状改良工作。 研究一利用细胞模型研究PLIN1基因对成肌及成脂分化功能的影响 本研究以姜曲海猪SMSCs为对照组(NC),以PLIN1基因表达敲低(PLIN1-KO)及PLIN1基因过表达(PLIN1-EX)SMSCs为实验组，3组细胞成肌诱导后检测各组细胞中成肌分化标志因子MYH1和MyoD1的表达变化来研究PLIN1基因对成肌分化的影响;各组细胞成脂诱导分化后，通过检测各组细胞中成脂分化标志基因PPARγ和成脂分化抑制基因PRKAG2的表达;利用油红O染色及定量检测细胞中脂肪量;测定细胞中甘油三脂(TG)含量等方法检测PLIN1基因对成脂分化的影响。结果表明，各组细胞成肌分化诱导4天后，NC组细胞中MYH1和MyoD1的mRNA表达均极显著高于PLIN1-KO及PLIN1-EX组(P＜0.01);NC组细胞中MYH1和MyoD1蛋白表达也极显著高于PLIN1-KO及PLIN1-EX组(P＜0.01);细胞免疫荧光检测MYH1和MyoD1的结果和上述趋势一致。各组细胞成脂分化后，NC组细胞中油红O染色及定量水平均显著高于PLIN1-KO及PLIN1-EX组(P＜0.01),NC组细胞中PPARγ基因的表达显著高于PLIN1-KO及PLIN1-EX组(P＜0.05);NC组PRKAG2基因的表达极显著低于PLIN1-KO及PLIN1-EX组(P＜0.01),NC组细胞TG水平显著高于PLIN1-KO及PLIN1-EX组(P＜0.01)。综上所述，PLIN1基因稳定表达对骨骼肌卫星细胞分化功能非常重要，PLIN1基因过表达或者敲低后均会导致SMSCs成肌、成脂分化能力显著下降。 研究二利用小鼠模型研究PLIN1基因对肌肉发育的影响 本研究在小鼠PLIN1基因第3外显子两端设计2个sgRNA序列，构建含PLIN1exon3两端带loxp序列的同源臂的Donor载体，通过原核期胚胎显微注射制备PLIN1Flox小鼠，通过和骨骼肌组织中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠交配，筛选出骨骼肌组织中PLIN1基因特异性敲除的基因编辑小鼠。以野生型C57BL/6J小鼠为对照（WT）,首先在DNA、RNA和蛋白水平对PLIN1基因编辑小鼠进行分子生物学鉴定;通过绘制生长曲线、测定8周龄小鼠股四头肌和腓肠肌脏器系数及肌肉形态进行小鼠表型检测。采集两组小鼠腓肠肌，通过索氏抽提检测腓肠肌总脂肪含量、制备冰冻切片后通过油红O测定肌肉组织脂质含量、利用试剂盒测定肌肉组织中TG的含量、HE染色观察肌肉组织中肌纤维横截面积;分别通过qRT-PCR及WB检测骨骼肌组织中成肌标志基因MyoD1、MYH和成脂标志基因PPARγ、LPLmRNA及蛋白表达以检测PLIN1基因对肌肉组织分化功能的影响。提取两组小鼠骨骼肌组织线粒体，检测线粒体膜电位、活性氧和ATP水平，以全面检测PLIN1基因对肌肉代谢的影响。 结果表明，PLIN1cKO组小鼠PLIN1mRNA在心肌、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮肤、脂肪中表达和WT组小鼠差异不显著，在骨骼肌极中显著低于WT组小鼠（P＜0.01）,PLIN1cKO组小鼠骨骼肌中PLIN1蛋白相对表达量极显著低于WT组（P＜0.01）。测量小鼠出生后8周的生长体重，从第2周后WT组较PLIN1cKO组有显著上升（P＜0.05）;WT组小鼠腓肠肌和股四头肌脏器系数显著高于PLIN1cKO组（P＜0.05）;组织学切片HE染色结果表明，WT组肌纤维横截面积极显著高于PLIN1cKO组（P＜0.01）;腓肠肌组织冰冻切片油红O染色结果表明，WT组肌肉组织中脂类物质相对量极显著高于PLIN1cKO组（P＜0.01）;WT组小鼠腓肠肌内的脂肪含量显著高于PLIN1cKO组（P＜0.05）;WT组肌肉组织中MYH、MyoD1、PPARγ和LPLmRNA表达水平均显著高于PLIN1cKO组（P＜0.01）,WB检测成肌分化标志蛋白MyoD1、Myog、MYH及成脂分化标志蛋白PPARγ和LPL表达，WT组均显著高于PLIN1cKO组（P＜0.05）。和WT组相比，PLIN1cKO组小鼠骨骼肌膜电位下降42％,活性氧上升22％,ATP水平下降29％。上述结果说明，本研究成功制备了骨骼肌中PLIN1基因特异性敲低的小鼠模型，证明了PLIN1基因敲低后对肌肉组织肌纤维和脂肪的产生和代谢有显著的抑制作用。 全文结论:本研究首次利用细胞及小鼠模型，证明了PLIN1基因对骨骼肌发育及代谢有重要影响。其中细胞水平证明了PLIN1基因的稳态表达有助于维持猪SMSCs的正常分化功能，PLIN1基因表达过高或者过低均会抑制SMSCs分化功能;小鼠模型中证明了骨骼肌组织中PLIN1基因敲除后直接抑制骨骼肌组织中脂肪及肌纤维生成，抑制肌肉组织代谢。本研究后续将在不同猪种群体中进行PLIN1表达水平和肌肉发育的关联分析，有助于推进我国猪种的遗传选育工作。 收起