摘要: 目的: 探讨PBMC母.胎转运与HBV宫内感染的关系，了解其作用的生物学基础；探讨胎盘细胞凋亡对胎盘通透性的影响，了解其与PBMC母-胎转运及新生儿HBV感染的关系；探讨PBMC作为HBV的载体，将孕妇体内HBV转运至胎儿体内导致HBV宫内感染的作用机制。 ... 展开 目的: 探讨PBMC母.胎转运与HBV宫内感染的关系，了解其作用的生物学基础；探讨胎盘细胞凋亡对胎盘通透性的影响，了解其与PBMC母-胎转运及新生儿HBV感染的关系；探讨PBMC作为HBV的载体，将孕妇体内HBV转运至胎儿体内导致HBV宫内感染的作用机制。 方法: 1.人群研究 连续收集2005年1月至2009年2月间太原市区各省市级医院筛检，并在太原市传染病院（太原市第三人民医院）妇产科进行产前检查并分娩的HBsAg阳性孕妇为研究队列，从产前检查追踪观察至分娩，排除孕期有其他感染性疾病或接受免疫治疗的孕妇，共收集HBsAg阳性孕妇及其新生儿共450对作为研究对象。收集孕妇孕期及产后新生儿的流行病学基线资料：采集孕妇分娩前肘静脉血及其新生儿出生24小时内注射乙肝疫苗和乙肝高效价免疫球蛋白(HBIG)前的股静脉血；无菌条件下采集孕妇足月分娩时胎盘组织。进行下述研究： (1)采用等位基因特异性PCR(As-PCR)法检测HBsAg阳性孕妇及其新生儿PBMC中HUMGSTM1、ACE基因多态性，筛选母亲为GSTM1基因表达型(GSTM1+)和/或为ACE基因杂合子（ID型），且其新生儿为GSTM1基因缺失型（GSTM1-）和/或为ACE基因纯合子（纯合插入Ⅱ型或纯合缺失DD型）者作为信息病例对。将GSTM1和ACE基因作为母亲的特异性等位基因，从信息病例对的新生儿外周血PBMC中检测母亲基因，判定是否发生PBMC母—胎转运。 (2)采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上述方法确定的信息病例对中孕妇及其新生儿外周血HBeAg、HBe-Ab、HBc-Ab及新生儿外周血HBsAg。 (3)采用荧光定量聚合酶联反应(FluorescenceQuantitativePCR，FQ-PCR)检测信息病例对中母儿外周血血清、PBMC中HBVDNA含量及PBMCHBVcccDNA含量。 (4)采用FQ-PCR检测新生儿PBMC中的母亲信息，用△Ct值（Ct目的基因/Ctβ-globin）表示PBMC母-胎转运量。 (5)采用免疫组织化学ABC法检测胎盘组织HBsAg。 (6)采用脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)介导的核苷酸(dUTP)缺口末端标记法，原位末端标记技术（Tunel法）检测胎盘组织凋亡指数(AI)，采用免疫组化SP法检测胎盘组织Caspase3蛋白表达，采用real-timeRT-PCR检测胎盘组织Caspase3mRNA表达。 (7)采用巢式病例对照研究分析母-胎细胞转运及新生儿PBMCHBV感染复制及宫内感染的危险因素研究。 (8)采用免疫荧光双标技术检测PBMC涂片上HBsAg和GST，判断感染HBV的PBMC转运情况。 2.体外实验 (1)采用100μlHBVDNA含量为5.0×106(copies/ml)的病人血清感染PBMC，用CCK-8试剂盒检测不同共培养时间点12h、24h、48h和72h细胞的生长状况。将共培养的细胞清洗4次，用荧光定量PCR法检测PBMC和洗液中的HBVDNA的含量。 (2)在1μm孔径Transwell小室共培养模型中，用流式细胞技术(FACS)检测Transwell小室上室感染HBV的PBMC与Bewo的融合现象。再用8μm孔径Transwell小室共培养模型观察PBMC的迁移，用流式细胞技术(FACS)检测下室中标记有绿色荧光的PBMC。 (3)共培养时设立三个组：正常对照组(Bewo)、Bewo+HBV血清共培养组、Bewo+感染HBV的PBMC共培养组，在共培养0h、12h、24h、48h后分别收集各组Bewo细胞，通过流式细胞技术(FACS)检测Bewo的凋亡情况。 (4)用FQ-PCR法检测感染HBV的PBMC与Bewo共培养组不同时间点(0h、12h、24h、48h)的Bewo细胞caspases3mRNA的表达情况。 (5)用FQ-PCR法检测感染HBV的PBMC与Bewo共培养组下室中的PBMC的HBVDNA和HBVcccDNA含量。 3.统计分析 资料核实后输入数据库，采用SPSS16.0forwindows软件进行统计分析。计数资料采用X2-test，计算各指标阳性率、x2值、OR值及其95％可信区问；计量资料采用t检验、方差分析及相关性分析。 结果: 1.HBsAg阳性孕妇PBMC母.胎转运与孕妇HBV感染及新生儿HBV感染的关系 (1)对连续收集的450对HBsAg阳性孕妇及其新生儿的PBMC采用等位基因特异性PCR检测GSTM1、ACE基因多态性：检出86对母亲GSTM1+基因型且其新生儿GSTM1-基因型的信息病例对，84对母亲ID基因型且其新生儿II/DD基因型的信息病例对，合计将GSTM1、ACE基因作为母亲的特异性等位基因时，共检出155对信息病例对。 (2)孕妇HBsAg、HBeAg双阳性组△Ct值（PBMC转运Ct/β-globinCt值）低于非双阳性组，但差异无统计学意义（r=0.81，P=0.42）；孕妇大、小三阳组△Ct值（PBMC转运Ct/β-globinCt值）均分别低于非大、小三阳组（t=1.42，P=0.16；t=0.02，P=0.98），但差异均无统计学意义。HBsAg阳性孕妇血清HBVDNA各组△Ct值（PBMC转运Ct/β-globinCt值）差别无统计学意义（F=0.37，P＞0.05）。 (3)HBsAg阳性孕妇PBMCHBVDNA阳性组△Ct值（PBMC转运Ct/β-globinCt值）低于阴性组，差异有统计学意义（t=6.42，P=0.00）；HBsAg阳性孕妇PBMCHBVcccDNA阳性组△Ct值（PBMC转运Ct/P-globinCt值）高于阴性组，差异有统计学意义(t=2.13，P=0.04)。 (4)将新生儿血清HBsAg、HBVDNA任一项阳性作为判断新生儿宫内感染的指标，则宫内感染组△Ct值（PBMC转运Ct/β-globinCt值）高于非宫内感染组，但差异无统计学意义(t=0.34，P=0.73)。将新生儿血清HBsAg、HBVDNA及PBMCHBVDNA任一项阳性作为判断新生儿宫内感染的指标，则宫内感染组△Ct值（PBMC转运Ct/β-globinCt值）低于非宫内感染组，差异有统计学意义(t'=6.25，P=0.00)。 2.胎盘HBV感染与HBsAg阳性孕妇母-胎细胞转运及新生儿HBV感染的关系 (1)胎盘HBV感染组△Ct值（PBMC转运Ct/β-globinCt值）高于非感染组，但差异无统计学意义（t=0.38，P=0.70）；胎盘各型细胞HBV感染组△Ct值（PBMC转运Ct/β-globinCt值）除母体面的蜕膜细胞高于非感染组外其它均分别低于非感染组，但差异均无统计学意义（t=0.38,P=0.70；t=0.49,P=0.63；t=0.17,P=0.87；t=1.72，P=0.09）。 (2)胎盘HBV感染与新生儿血清HBsAg有关（x2=4.88，P=0.03）而与新生儿HBVDNA无关（x2=0.10，P=0.76）。将新生儿血清HBsAg、HBVDNA任一项阳性作为判断宫内感染的标准，胎盘HBV感染组的新生儿HBV宫内感染率高于非胎盘HBV感染组，但差异无统计学意义（x2=2.71，P=0.10）。胎盘HBV感染与新生儿PBMCHBVDNA、PBMCHBVcccDNA均无关(x2=1.89、0.76，P=0.17、0.38)。将新生儿血清HBsAg、HBVDNA及PBMCHBVDNA任一项阳性作为判断宫内感染的标准，胎盘HBV感染组的新生儿HBV宫内感染率高于非胎盘HBV感染组，但差异无统计学意义（x2=2.09，P=0.15）。 3.胎盘细胞凋亡与HBsAg阳性孕妇母一胎细胞转运及新生儿HBV感染的关系 (1)采用Tunel法检测155例HBsAg阳性孕妇胎盘的凋亡情况。胎盘细胞胞核出现棕黄色颗粒为凋亡阳性信号表达。从母体面至胎儿面的蜕膜细胞(DC)、滋养层细胞(TC)、绒毛间质细胞(VMC)和绒毛毛细血管内皮细胞(VCEC)凋亡指数分别为4.53±0.07,5.56±0.06,4.66±0.05,4.05±0.06，合计胎盘细胞凋亡指数为4.75±0.05。凋亡指数在HBsAg阳性孕妇胎盘各层细胞上的分布总体上有统计学差异(F值为102.60，P=0.00)，其中以滋养层细胞的凋亡为主，绒毛毛细血管内皮细胞的凋亡少见。采用SNK法进一步比较胎盘各层细胞凋亡指数，结果显示：蜕膜细胞(DC)凋亡指数与滋养层细胞(TC)、绒毛毛细血管内皮细胞(VCEC)的凋亡指数差异均有统计学意义（P值均小于0.05），DC的凋亡指数低于TC而高于VCEC；TC与DC、VMC及VCEC的凋亡指数差异均有统计学意义，TC的凋亡指数高于DC、VMC和VCEC；DC的凋亡指数低于VMC的凋亡指数，但差异无统计学意义。 (2)发生PBMC母-胎转运组的胎盘细胞凋亡指数高于未发生转运组的胎盘细胞凋亡指数，差异有统计学意义（t=3.44，P=0.00）。发生PBMC母-胎转运组的胎盘各层细胞凋亡指数均高于未发生转运组，差异均有统计学意义(t=2.86，P=0.01；t'=4.86，P=0.00；t=2.53，P=0.01；t=2.23,P=0.03)。 (3)将新生儿血清HBsAg、HBVDNA任一项阳性作为判断新生儿HBV宫内感染的标准，宫内感染组的胎盘细胞凋亡指数高于非宫内感染组，但差异无统计学意义（t=1.97，P=0.05）。将新生儿血清HBsAg、HBVDNA和/或PBMCHBVDNA任一项阳性作为判断新生儿HBV宫内感染的标准，宫内感染组的胎盘细胞凋亡指数高于非宫内感染组，差异有统计学意义(t=3.22，P=0.00)。 (4)新生儿外周血PBMCHBVDNA阳性组的胎盘蜕膜细胞(DC)、滋养层细胞(TC)的凋亡指数高于阴性组，差异均有统计学意义(t=2.08，P=0.04；F3.47，P=0.00)。绒毛间质细胞(VMC)、绒毛毛细血管内皮细胞(VCEC)的凋亡指数均高于阴性组，但差异无统计学意义(t'=0.92，P=0.36；t=0.77，P=0.44)。 (5)用免疫组织化学SP法检测155例HBsAg阳性孕妇胎盘Caspase3的表达，胎盘细胞细胞浆和/或细胞膜出现棕黄色染色为Caspase3阳性信号表达。从母体面的蜕膜细胞至胎儿面的蜕膜细胞(DC)、滋养层细胞(TC)、绒毛间质细胞(VMC)和绒毛毛细血管内皮细胞(VCEC)Caspase3阳性表达的灰度值分别为98.40±1.86，82.05±1.39，86.41±1.57，89.10±1.70，合计胎盘Caspase3阳性表达的灰度值为88.99±1.47；积分光密度值分别为15.58±0.33，18.59±0.29，17.67±0.31，17.31±0.35，合计胎盘Caspase3阳性表达的积分光密度值为17.29±0.29。Caspase3蛋白在HBsAg阳性孕妇胎盘各层细胞上的分布总体上有统计学差异(F值分别为17.81、15.54，P值均小于0.05)。进一步采用SNK法进行两两比较，结果显示：蜕膜细胞(DC)Caspase3阳性表达的灰度值与滋养层细胞(TC)、绒毛间质细胞(VMC)和绒毛毛细血管内皮细胞(VCEC)的灰度值差异均有统计学意义（P值均小于0.05），DC的Caspase3阳性表达灰度值均高于TC、VMC和VCEC，TC的Caspase3灰度值最小，即TC凋亡率最高，其次VMC、VCEC，DC凋亡率最低；TC与VMC、VMC与VCEC的Caspase3阳性表达的灰度 收起