中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 尚华大连医科大学 2008年硕士导师: 赵钢共31页

摘要 : 干细胞是一类具有无限或永生的自我更新能力的细胞，能产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。在个体发育的不同阶段及成体不同组织中均存在着干细胞，来源于各种组织的成体干细胞在适当的微环境中能分化为其他类型的细胞，即成体干细胞具有可塑性... 展开干细胞是一类具有无限或永生的自我更新能力的细胞，能产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。在个体发育的不同阶段及成体不同组织中均存在着干细胞，来源于各种组织的成体干细胞在适当的微环境中能分化为其他类型的细胞，即成体干细胞具有可塑性。人外周血单个核细胞包括单核细胞、干细胞和淋巴细胞，通过密度梯度离心法，收集外周血单个核细胞，利用单核细胞可粘着于塑料培养器皿表面的特性，可去除未贴壁细胞，进一步纯化单核细胞。巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)可促进单核细胞增殖分化，白细胞介素—3(interleukin-3，IL-3)可促进单核细胞分化及多能干细胞自我更新。这两种因子的联合应用对单核细胞的可塑性具有协同作用，可使外周血单核细胞产生部分未分化，具有重新分化能力并对刺激它们终末分化的因子反应下调，使这些单核细胞来源的细胞被诱导分化为肝样细胞成为可能。细胞的分化和再生受细胞因子或生长因子的控制，在大多数的研究中，肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、转化生长因子(transforming growthfactor,TGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)应用最多。曾有报道，在研究多潜能人祖细胞(hMAPCs)转分化实验时，分析比较了多种细胞因子的作用，如FGF、白血病抑制因子(1eukaemia inhibitory factor，LIF)、HGF、制瘤素M(oncostatin M,OSM)、EGF等，得出在HGF和FGF-4存在的情况下分化为肝样细胞的培养条件较好。目前对急性或晚期肝病引起的肝功能衰竭，最佳治疗方法是肝移植，原位肝移植由于供体器官紧缺，其应用受到限制。采用细胞移植技术来修复、治疗终末期肝病患者，帮助患者度过危险期等待肝移植或者直接修复衰竭肝脏，是一个理想的方法，因此寻找合适的肝细胞来源备受关注。外周血有收集方便、供体不需要麻醉、无骨髓穿刺痛苦、易于患者接受等优点，因此用外周血干细胞移植的方法来获得转分化后的肝样细胞，其临床应用前景非常突出。目的：探索人外周血单个核细胞在HGF及FGF-4诱导下分化为肝样细胞的可行性。方法： 1．采集正常健康志愿献血者的外周血，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。 2．用RPMI1640培养液对外周血单个核细胞培养2小时后，去除未贴壁细胞。 3．在含10％胎牛血清、140uM β-巯基乙醇、5ng/ml M-CSF、0.4ng/ml IL-3的RPMI1640培养液中对贴壁细胞培养6天。 4．6天后，用含10％胎牛血清、20ng/ml HGF、10ng/ml FGF-4的RPMI1640培养液继续诱导培养20天，即对外周血单个核细胞总共培养约26天。 5．观察细胞培养过程中的形态变化，加入HGF、FGF-4诱导前及诱导后的第6、10、14、20天采用免疫荧光法检测肝细胞标志物甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)、白蛋白(albumin，ALB)的表达情况。结果： 1．刚分离的单个核细胞形态上呈较为均一的圆形，台盼兰染色法测定活细胞率>95％，培养2小时后去除未贴壁细胞，贴壁细胞形态呈毛毛糙糙的圆形。 2．在M-CSF、IL-3存在的条件下，对贴壁细胞培养6天后，可见细胞呈集落样生长，细胞趋向融合。未用M-CSF、IL-3培养或单用M-CSF培养的对照组细胞呈单个细胞生长，随培养时间延长，贴壁伸展，培养2周后大部分呈纤维样或梭形，少部分呈圆形。 3．加入HGF、FGF-4培养后4天左右，可见部分细胞体积变大，向类圆形细胞转变，随培养时间延长，类圆形细胞比例增加。培养20天后，细胞数量较未加入HGF、FGF-4培养前减少。未加入HGF、FGF-4培养的对照组细胞，随培养时闻的延长，部分细胞贴壁伸展，培养20天后大部分呈梭形或纤维样，少部分呈圆形。 4．实验组加入HGF、FGF-4培养后第6、10、14、20天免疫荧光法检测AFP均为阳性表达。实验组未加入HGF、FGF-4培养前及对照组于实验组相应检测日期免疫荧光法检测AFP均为阴性表达。 5．实验组加入HGF、FGF-4培养后第10、14、20天免疫荧光法检测ALB均为阳性表达。实验组未加入HGF、FGF-4培养前及对照组于实验组相应检测日期免疫荧光法检测ALB均为阴性表达。结论：外周血单个核细胞在一定诱导条件下具有向肝样细胞分化的潜能，有可能成为干细胞移植治疗肝病的细胞来源。收起

关键词 : 体外诱导外周血单个核细胞

2. 肺癌患者外周血单个核细胞产生白细胞介素-6能力的初步研究

[学位论文] 何平中国医科大学 1997年硕士导师: 马宗生共14页

摘要 : 该文旨在探讨肺癌患者产生IL-6能力及组织分型、临床分期和手术治疗对其影响.该实验采用ELISA法对30例健康人,40例肺癌患者及10例肺癌患者行根治手术前后外周血单个核细胞(PBMCs)分泌IL-6活性进行检测.结果肺癌组IL-6活性为3.088±1.818比正常对照组4... 展开

关键词 : 肺癌外周血单个核细胞 IL-6

3. BAFF分子在肾移植受者外周血单个核细胞的表达

[学位论文] 钟敏苏州大学 2008年硕士导师: 何小舟共30页

摘要 : 目的：探讨BAFF分子在肾移植受者术后不同时期外周血单个核细胞的表达情况，并初步分析该分子表达的可能生物学意义。方法：分别采用免疫荧光标记法(IMF)和实时定量聚合酶链反应法(Real Time-PCR)从蛋白水平及RNA水平检测肾移植受者术后外周血单... 展开

关键词 : 分子肾移植受者外周血单个核细胞

4. 外周血单个核细胞中GRβmRNA的表达及血清中IL-4和IL-13的水平与激素低敏感型哮喘的研究

[学位论文] 刘振泸州医学院 2008年硕士导师: 熊瑛共67页

摘要 : 目的:支气管哮喘是一种发病率高，严重危害人们身体健康的慢性疾病，其发病的中心环节为气道炎症的形成，多种细胞因子相互作用并形成网络在慢性炎症的发生、发展中起到重要作用，糖皮质激素(glucocorticoid，GC)是治疗哮喘的主要药物，具有明显的抗炎... 展开目的:支气管哮喘是一种发病率高，严重危害人们身体健康的慢性疾病，其发病的中心环节为气道炎症的形成，多种细胞因子相互作用并形成网络在慢性炎症的发生、发展中起到重要作用，糖皮质激素(glucocorticoid，GC)是治疗哮喘的主要药物，具有明显的抗炎作用，但是，有部分患者对激素治疗反应不佳，出现激素低敏感(steroidinsensitive，SI)现象。众所周知，GC的作用由糖皮质激素受体(GR)所介导，GR属于类固醇激素受体超家族。GR有两种亚型分别称为GRa和GRβ，是由编码GR的基因在第九外显子处选择性剪接不同所致，其可造成GRa和GRβ在竣基端727位氨基酸以后的氨基酸序列不同。GC的主要生理功能由GRa介导，GC与GRa结合后，经过核转位，结合在相应的激素反应元件上从而调节有关基因的转录。GRβ的功能目前还不十分清楚，有文献报道GRβ可作为内源性的抑制因子来减弱GRa介导的GC发挥作用。在SI哮喘中GRβ可能有异常表达。支气管哮喘患者外周血中的T淋巴细胞和巨噬细胞活化后释放高水平的IL-2、IL-4、IL-13及TNF-a等细胞因子，这些细胞因子相互构成复杂的紊乱网络，使气道反应性增加，气道平滑肌收缩，黏液分泌增多，血管通透性增加。GRβ过度表达导致炎症细胞对激素抗炎作用的敏感性下降，引起大量外周血中的炎症细胞浸润并聚集于气道，同时释放更多的细胞因子形成恶性循环。在这种情况下常规剂量的糖皮质激素不能取得较好的疗效，导致SI现象。SI哮喘是一个具有挑战性的临床问题，其与患者的预后和疾病的转归密切相关。因此本研究目的在于探讨SI哮喘患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中糖皮质激素受体p(Glucocorticoid receptor beta，GRβ)的表达和血清中细胞因子白介素-4(interleukin-4，IL-4)、白介素-13(interleukin-13，IL-13)的水平及其在SI哮喘发病中的作用。方法:本研究按照2003年中华医学会呼吸病学分会哮喘组制定的哮喘防治指南，收集23例哮喘病人为实验组，分两组:激素敏感组(steroid sensitive SS组，16例，男10例，女6例，平均年龄43.3±10.4岁)和激素低敏感组(SI组，9例，男4例，女5例，平均年龄48.0±15.4岁)；10例健康者为对照组(10例，男6例，女4例，平均年龄36.8岁)。采集受试者外周静脉血，分离出单个核细胞PBMCs，分A、B、C三组，根据细胞计数，①A1组细胞(1×106/m1)，从PBMC中提取总RNA逆转录得到cDNA，然后用特异性GRβ引物通过PCR扩增得到目的片段，通过半定量分析测定GRβmRNA的相对表达量；A2组细胞(5x107/m1)涂片，应用免疫荧光技术检测受试者PBMCs中GRβ的表达，根据荧光强度进行分析；②B组细胞(1×106/ml)，于37℃，5％CO2体外培养48小时后，重复上述操作，B1组采用.RT-PCR检测，B2组行免疫荧光测定，观察PBMCs中GRβ的表达；③C组细胞(1×106/m1)加入受试者的10％的血清刺激，培养24小时，Cl组和C2组细胞同上，分别采用RT-PCR和免疫荧光方法检测受试者PBMCs中GRβ的表达。另外，应用液态芯片技术检测受试者外周血清中IL-4和IL-13的表达水平，以探讨其与GRβ表达的相关性和在SI哮喘发病中的的作用。结果:通过RT-PCR检测结果，SI哮喘组与SS哮喘组GRβmRNA的表达水平差异有显著性(P<0.05)，SI哮喘组与健康对照组GRβmRNA的表达水平差异有显著性(P<0.05)，而体外培养PBMC4.8小时后，三组GRβmRNA的表达水平差异无显著性(P>0.05)，GRβ下降到正常水平；但是加入血清刺激PBMC培养24小时，SI哮喘组与健康对照组GRβmRNA的表达水平差异有显著性(P<0.05)，可能与血清中的某些炎性细胞因子刺激有关。同样，我们应用免疫荧光技术检测了PBMC中GRβ的表达，出现上述同样的结果。通过应用液态芯片技术，研究发现哮喘组与健康对照组相比，外周血IL-13、IL-4表达水平增加，差异有显著性(P<0.05)，而IL-4在SI哮喘组中有高表达，高于SS哮喘组，差异有统计学意义(P<0.05)，IL-13的表达在SI哮喘组与SSn孝喘组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.SI哮喘患者外周血单个核细胞GRβmRNA异常高表达；2.PBMC体外培养48小时，SI哮喘患者的GRβmRNA的表达降低到正常水平，可能SI哮喘对激素敏感性呈可逆改变；3.PBMC加血清刺激培养后， GRβmRNA呈持续高表达；4.哮喘患者外周血细胞因子IL-4、IL-13的表达水平增加，而IL-4在SI哮喘患者表达显著高于SSn孝喘患者，可能与炎性细胞因子诱导SI哮喘患者外周血PBMC中GRβmRNA过量表达有关。收起

关键词 : 外周血单个核细胞表达血清激素敏感型

5. 超抗原SEB诱导人NK细胞杀伤肿瘤效应的体外研究

[学位论文] 裴银辉华北煤炭医学院 2003年硕士导师: 马立人;孙树勋共58页

摘要 : 目的：探讨超抗原葡萄球菌肠毒素B（Staphylococcal entertoxic B，SEB）刺激NK细胞后对其杀瘤活性的影响。方法：分别采用补体裂解法及绵羊红细胞法分离富集NK细胞，比较两种方法获得的NK细胞纯度及活性。用10-9g/ml、10-8g/ml、10-7g/ml、10-6g/m... 展开

关键词 : SEB NK细胞外周血单个核细胞杀瘤活性

6. 外周血单个核细胞miRNA作为梅毒诊断潜在标志物的筛选及验证

[学位论文] 杨结仪广东医科大学 2019年硕士导师: 郑和平;郑碧英共56页

摘要 : [目的] 1.芯片筛选及验证梅毒患者与健康人PBMCs中差异的miRNA表达谱。 2.分析差异表达的miRNA在梅毒早期诊断及监测中的效能和应用价值。 [方法] 收集29例健康人和151例梅毒患者外周血（包括一期梅毒、二期梅毒、潜伏梅毒、血清... 展开 [目的] 1.芯片筛选及验证梅毒患者与健康人PBMCs中差异的miRNA表达谱。 2.分析差异表达的miRNA在梅毒早期诊断及监测中的效能和应用价值。 [方法] 收集29例健康人和151例梅毒患者外周血（包括一期梅毒、二期梅毒、潜伏梅毒、血清固定和血清治愈），通过梯度密度离心法分离PBMCs。Trizol法提取总RNA，并检测RNA纯度及完整性。通过miRNA微阵列芯片分析6例健康人、6例早期未治疗梅毒（3例一期梅毒和3例二期梅毒）、6例血清固定及6例血清治愈PBMCs样本差异miRNA表达谱，并选取具有表达差异的miRNA，进一步采用实时荧光定量PCR验证差异表达的miRNA在各期梅毒患者中的表达水平，同时以健康人为对照组，最后筛选一组miRNA作为候选标志物分子。采用MedCalc对miRNA进行ROC曲线分析，明确差异miRNA在梅毒诊断中的曲线下面积、最佳临界值及其灵敏度和特异度，从而评价miRNA在梅毒诊断中的效能和价值。利用Pearsons相关性分析法对miRNA表达量与TRUST滴度相关性进行分析。 [结果] 1.miRNA微阵列芯片分析：与健康人相比，早期未治疗梅毒患者中42种miRNA表达上调，16种miRNA表达下调；血清固定患者中1种miRNA表达上调，3种miRNA表达下调；血清治愈患者中9种miRNA表达上调，22种miRNA表达下调。与血清治愈患者相比，血清固定患者中15种miRNA表达上调，1种miRNA表达下调。选取了8个具有较高差异表达的miRNA进行初步的临床验证：miR-101-3p、miR-195-5p、miR-223-3p、miR-589-3p、miR-342-3p、miR-31-5p、miR-6511a-3p、miR-6855-3p。 2.各期梅毒患者PBMCs中差异miRNAqPCR验证：miR-101-3p、miR-195-5p及miR-223-3p在初步的小样本临床验证中具有差异性表达；与健康人相比，miR-101-3p、miR-195-5p和miR-223-3p在梅毒患者PBMCs中均表达上调，差异具有统计学意义，其中miR-101-3p在血清治愈及现症梅毒组中均表达显著上调（P＜0.05），miR-195-5p和miR-223-3p表达极显著上调（P＜0.01）。血清治愈组中miR-223-3p表达水平与现症梅毒组相比呈下降趋势，但差异无统计学意义；与健康人相比，miR-101-3p、miR-195-5p及miR-223-3p均在潜伏梅毒、血清固定以及血清治愈患者中表达上调。另外，一期梅毒患者中miR-195-5p和miR-223-3p的表达水平极显著高于健康人（P＜0.001）。miR-223-3p在各期梅毒患者PBMCs较健康人呈高表达水平（P＜0.001），且经正规驱梅治疗后血清固定及血清治愈组中，miR-223-3p表达水平较其他梅毒组低，但差异无统计学意义。 3.miRNA表达与TRUST滴度相关性分析：miR-101-3p与TRUST滴度呈负相关（r=-0.2212，P＜0.05）；miR-223-3p（r=0.107，P=ns）、miR-195-5p（r=-0.059，P=ns）与TRUST滴度无明显相关性。 4.miRNAROC曲线分析：miR-223-3p单独在区分健康人与梅毒患者、早期梅毒、一期梅毒以及潜伏梅毒中具有较高的诊断准确性，AUC为0.913～0.983；在区分健康人与梅毒患者、一期梅毒以及潜伏梅毒中，miR-195-5p均具有较好的诊断准确性，AUC为0.728~0.854；miR-195-5p与miR-223-3p二者联合在鉴定健康人与梅毒患者、一期梅毒中较单独miRNA具有更高的诊断准确性（AUC0.942~0.9899），敏感性（90.5%~100%）以及特异性（88.9%~94.4%）。miR-101-3p单独在区分健康人与潜伏梅毒中具有较好的诊断准确性，AUC为0.712。三者联合在鉴定健康人与潜伏梅毒诊断价值优于单独miRNA，AUC为0.985，敏感性和特异性分别为92.3%、94.4%。但三者单独均不能很好的区分潜伏梅毒与血清固定患者，AUC为0.523～0.673。 [结论] 1.miRNA微阵列芯片筛选及qPCR验证发现miR-101-3p、miR-195-5p和miR-223-3p在各期梅毒患者中存在差异性表达。 2.miR-101-3p、miR-195-5p以及miR-223-3p单独或者联合在梅毒诊断中具有较好的诊断效能，且联合比单个miRNA诊断具有更高的可靠性，可作为梅毒诊断、监测新型的潜在分子标志物。miR-195-5p和miR-223-2p联合可以作为鉴定健康人与梅毒患者、一期梅毒的诊断标志物。可单独应用miR-223-3p鉴定早期梅毒与健康人。在区分潜伏梅毒与健康人可以应用miR-101-3p、miR-195-5p和miR-223-3p三者联合诊断。进一步的研究将为梅毒的实验室诊断提供更有价值的理论线索。收起

关键词 : 梅毒外周血单个核细胞 miRNA 分子标志物

7. 食管鳞癌手术前后外周血单个核细胞Th1/Th2漂移的变化及临床意义

[学位论文] 魏煜程山东大学 2001年博士导师: 王善政共53页

摘要 : 目的:1、探讨食管鳞癌患者外周血单个核细胞(PeripheralBloodMononuclearCell,PBMC)Th1和Th2类细胞因子的表达情况,及其与肿瘤分期、分化和预后的关系.2、探讨手术治疗对食管鳞癌患者PBMCTh1、Th2状态的影响.结论:1、食管鳞癌患者PBMC中Th2细胞优势,而... 展开

关键词 : 食管鳞癌外周血单个核细胞 Th1/Th2

8. ESRD非透析患者血清TNF-α水平及其血清对外周血单个核细胞TNF-α分泌的影响

[学位论文] 侯静泸州医学院 2007年硕士导师: 陈明共51页

摘要 : 目的:探讨终末期肾病(ESRD)非透析患者外周血清TNF-α水平与血红蛋白、红细胞压积、血压、血清甘油三酯、胆固醇、脂蛋白(a)、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白及血清白蛋白的水平的关系。探讨ESRD非透析患者血清对ESRD非透析患者及正常人外周单个核细胞(P... 展开目的:探讨终末期肾病(ESRD)非透析患者外周血清TNF-α水平与血红蛋白、红细胞压积、血压、血清甘油三酯、胆固醇、脂蛋白(a)、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白及血清白蛋白的水平的关系。探讨ESRD非透析患者血清对ESRD非透析患者及正常人外周单个核细胞(PBMCs)及ESRD非透析患者不同分子质量血清对其外周单个核细胞(pBMCs)ZHO肿瘤坏死因子-α（TNF-α)影响。方法:①取ESRD非透析患者15例清晨外周静脉血2ml，测定TNF-α水平及ESRD非透析患者血红蛋白、红细胞压积、血清甘油三酯、胆固醇、脂蛋白(a)、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白及血清白蛋白等水平，同时检测血压情况。另取ESRD非透析患者和正常人各10例清晨空腹外周静脉血2ml，分离血清待用。取部分ESRD非透析患者的血清，混匀后用超速过滤离心装置分离成<5000D，5000～10000D、>10000D三种不同分子质量的组分，用RPMI-1640对倍稀释成分子系数为50％待用。②取ESRD非透析患者15例和正常人10例清晨外周静脉血8ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离PBMCs，用1640培养基调整细胞密度为lxl07。分为两部分:第一部分对正常人及ESRD非透析患者PBMCs分别加入正常人血清及ESRD非透析患者血清；第二部分别对ESRD非透析患者PBMCs加入ESRD非透析患者<5000D，5000～10000D、>10000D不同分子质量的血清，把混有血清的培养板放在含5％一氧化碳的孵箱中37℃孵育72小时，收集培养液离心，吸取上清液用于检测TNF-α。血清及培养上清液TNF-α的含量由ELISA测定。结果:①ESRD非透析患者外周血TNF-α含量显著高于对照组，差别有显著意义(432.614±62.02 pg/mlvsl00.04±57.20pg/ml，p<0.001)；②ESRD非透析患者血清TNF-α水平与血红蛋白、红细胞压积呈明显负相关，相关系数r和P值分别为:r=0.526，P<0.05，r=0.20，P<0.05: 与脂蛋白(a)呈明显的正相关，r=0.577，p<0.05；与HDL-CH呈负相关，r=0.529，p<0.05；与收缩压和舒张压水平相关分析有明显的正相关，相关系数r和P值分别为:r=0.525，p<0.05， r=0.524，p<0.05;与血清白蛋白水平呈负相关，相关系数r和p值分别为:r=0.526，p<0.05。③在同种ESRD非透析患者或正常人血清刺激下，ESRD非透析患者PBMCs分泌的TNF-α水平比正常人PBMCs分泌的高，但差别无统计学意义p=0.058)；④正常人和ESRD非透析患者不同的血清刺激PBMCs分泌TNF-α的能力有差别，后者刺激PBMCs分泌TNF-α的水平较前者明显升高，差别有显著意义(p=0.005)；不同分子质量ESRD非透析患者血清刺激ESRD非透析患者PBMCs分泌TNF-α的能力有差别。含大分子质量尿毒症毒素的ESRD非透析患者血清刺激PBMCs分泌TYFoflt较高，差别有显著意义(p<0.05)。结论:①ESRD非透析患者外周血高水平TNF-α与其慢性并发症(贫血、动脉粥样硬化、高血压及营养不良)发生、发展有关；②ESRD非透析患者的PBMCs是预活化的，但活化程度不高，对于ESRD非透析患者的微炎症状态的发生、发展有协同作用；③ESRD非透析患者血清尤其是大分子质量尿毒症毒素的ESRD非透析患者血清可通过刺激PBMCs引起TNF-α的分泌增加，从而可能参与ESRD非透析患者微炎症状态的发生、发展。收起

关键词 : 透析患者血清外周血单个核细胞分泌

9. 牙鲆（Paralichthys olivaceus）外周血单个核细胞的离体培养和细胞学研究

[学位论文] 王彬天津师范大学 2008年硕士导师: 孙金生共39页

摘要 : 牙鲆(Paralichthys olivaceus)肉质鲜美、营养丰富，是我国北方沿海地区大规模养殖的经济海产鱼类之一。但随着近年来养殖规模的扩大，牙鲆腹水病、病毒性神经坏死症等各种病害的爆发和流行给生产企业造成了巨大的经济损失，严重阻碍了牙鲆养殖产业的... 展开牙鲆(Paralichthys olivaceus)肉质鲜美、营养丰富，是我国北方沿海地区大规模养殖的经济海产鱼类之一。但随着近年来养殖规模的扩大，牙鲆腹水病、病毒性神经坏死症等各种病害的爆发和流行给生产企业造成了巨大的经济损失，严重阻碍了牙鲆养殖产业的发展。由于对牙鲆免疫机理和机制的了解较少，尚无有效的免疫防治技术和方法，仍然采用化学药物和抗生素等传统的方式来控制病害的发生。但长期使用抗生素使病菌的抗药性越来越强，并且大量的药物残留严重破坏了生态环境,食用鱼的安全性也受到了影响。外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，是鱼类体液免疫的重要组成部分，在鱼类特异性免疫和非特异性免疫过程中起着重要作用。目前对于牙鲆单个核细胞的免疫功能研究尚属起步阶段，尚不清楚其作用机制。本研究以养殖牙鲆为材料，对外周血单个核细胞进行离体培养和细胞学观察，同时对单个核细胞的吞噬功能和细胞膜表达离子通道的电生理特征进行了观察。为建立牙鲆血细胞离体培养技术和探究细胞免疫功能奠定基础。通过对牙鲆外周血细胞的分离鉴定，确定单个核细胞的形态特征,用密度梯度离心的方法，分离出纯净的单个核细胞层细胞，分析不同因素对细胞离体存活和生长的影响，优化营养条件和培养条件，建立离体细胞培养方法。并对离体培养的淋巴细胞和单核细胞进行细菌吞噬实验和膜表达离子通道研究，主要研究结果和结论如下： 1.通过对牙鲆外周血进行染色，可在光镜下鉴别出红细胞、血栓细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、和嗜碱性粒细胞7种细胞。利用细胞分层液(比重为1.083)，20℃，水平离心3000r／min，15min，Hank's溶液洗涤，可得纯净的单个核细胞。 2.离体培养的单个核细胞在含20％胎牛血清、终浓度100U／ml青霉素和链霉素、终浓度为O．5mmol／L谷氨酰胺、添加PHA(30μg／ml)的M199培养液中，于25℃，24孔培养皿(Costar，美国)中能够贴壁生长传至6代，存活30天以上。贴壁生长的单核细胞形状不规则，长径11.05±0.91μm，短径9.55±1.39 μm；淋巴细胞近似呈圆形，长径7.31±1.05μ m，短径6.13±0.97μm。均呈鹅卵石状紧密排列，并有接触性抑制现象，长满单层时细胞会脱壁悬浮。 3.将离体培养传至第二代(7d)的单个核细胞用于金黄色葡萄球菌吞噬实验。单核细胞在发生吞噬时，细胞常通过变形运动把细菌包裹至细胞内，吞噬率(PP)和吞噬指数(PI)分别为(61.9±3.05)％和1.58±0.51。淋巴细胞常见到细菌粘到细胞表面，吞噬率(PP)和吞噬指数(PI)分别为(42.1±2.33)％和3.17±1.57。 4.单个核细胞膜上存在的离子通道，在控制细胞膜的静息电位，调节细胞体积和在细胞活化中均起着重要作用。膜片钳研究结果表明，牙鲆单核细胞适宜进行膜片钳研究，记录的细胞均表达电压门控钠、钾、钙离子通道。为今后开展单核细胞表达离子通道的种类和特征研究及其在细胞免疫中的作用奠定了基础。收起

关键词 : 牙鲆 Paralichthys 外周血单个核细胞离体培养

10. 单纯性肥胖儿童外周血单个核细胞OB-Rb、SOCS-3 mRNA表达的研究

[学位论文] 李楠大连医科大学 2008年硕士导师: 刘正娟共38页

摘要 : 背景：儿童单纯性肥胖是由于长期能量摄入超过人体消耗，体内脂肪过度聚集、体重超过一定范围的一种营养障碍性疾病。肥胖对儿童的心血管系统、内分泌系统、免疫系统、生长发育、智力、心理行为特点等都有影响[1-3]。已经成为当今社会影响儿童健康的一... 展开背景：儿童单纯性肥胖是由于长期能量摄入超过人体消耗，体内脂肪过度聚集、体重超过一定范围的一种营养障碍性疾病。肥胖对儿童的心血管系统、内分泌系统、免疫系统、生长发育、智力、心理行为特点等都有影响[1-3]。已经成为当今社会影响儿童健康的一个严重问题。随着分子生物学技术的发展，肥胖相关基因ob的成功克隆[4]及其编码的蛋白产物瘦素(leptin)，尤其是瘦素受体(OB-R)的发现使人们对肥胖的发病开始有了认识。目前国内外大量实验已经证实肥胖者体内存在瘦素抵抗[5.6]和胰岛素抵抗[6.7]，并被认为是肥胖发病的主要原因。近年发现的细胞因子信号抑制子3(SOCS-3)，使瘦素和胰岛素抵抗的研究进入到细胞信号转导水平，从而为肥胖产生机制的研究掀开了新的一页。OB-R和SOCS-3基因主要在下丘脑表达[8-10]，故临床实验受到限制，关于肥胖瘦素抵抗的基因水平研究较少，尤其是信号转导通路水平的研究更是罕有报导。目的：通过检测外周血单个核细胞内OB-Rb mRNA及SOCS-3 mRNA表达来反映机体内该两种基因表达水平，从而在受体基因表达水平和信号传导通路水平探讨瘦素抵抗和胰岛素抵抗可能的发生机制。方法：以4-6岁肥胖男童(BMI>23)33例为实验组，同年龄组正常男童(BMI=16-18)[11-13]21例为对照组，晨起抽取外周静脉血2ml，EDTA抗凝，分离血浆，放射免疫法测定血浆瘦素、胰岛素、C肽含量；全自动生化分析仪检测血糖，甘油三酯，胆固醇含量；人淋巴细胞分离液分离单个核细胞，并以TRlzol法抽提总RNA；SYBR(R)Green I real-time RT-PCR检测外周血单个核细胞OB-Rb mRNA、SOCS-3mRNA表达水平(GAPDH为内对照)。统计分析肥胖组与对照组各生化指标及基因表达差异，并分析肥胖儿童该两种基因与瘦素和胰岛素含量的相关性。结果: 1．血浆leptin、胰岛素、C肽及血糖、甘油三酯、胆固醇含量，肥胖组均明显高于正常对照组，各指标两组间差异均有显著统计学意义(p<0.005)。肥胖组血浆leptin与胰岛素浓度呈显著正相关(相关系数r=0.633，p<0.001)；与血浆C肽浓度呈显著正相关(相关系数r=0.619，p<0.005)。 2.肥胖组儿童外周血单个核细胞OB-Rb mRNA表达量明显低于对照组；SOCS-3 mRNA的表达肥胖组明显高于对照组。两指标组间差异均有显著统计学意义(p<0.005)。 3.肥胖组儿童血浆leptin与外周血单个核细胞OB-Rb mRNA表达水平呈显著负相关(相关系数r=-0.674，p<0.005)；与外周血单个核细胞SOCS-3 mRNA表达水平无明显相关性(相关系数r=0.221，p>0.05)。 4.肥胖组儿童血浆胰岛素与外周血单个核细胞OB-Rb mRNA表达水平里负相关，(相关系数r=-0.532，p<0.01)；与外周血单个核细胞SOCS-3 mRNA表达水平无明显相关性(相关系数r=0.347，p>0.05)。 5.肥胖儿童外周血单个核细胞OB-Rb mRNA与SOCS-3 mRNA表达水平无明显相关性(相关系数r=-0.186，p>0.05)。结论： 1.肥胖儿童血浆胰岛素、血糖、甘油三酯、胆固醇浓度均明显高于对照组，提示肥胖儿童存在胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱。 2.肥胖儿童血浆瘦素明显增高，且与胰岛素、C肽浓度呈正相关关系，提示存在瘦素抵抗，高瘦素血症可能参与胰岛素抵抗过程。 3.肥胖儿童外周血单个核细胞OB-Rb rnRNA表达明显低于正常对照组，且与血浆瘦素、胰岛素水平均呈显著负相关关系，提示瘦素受体基因沉寂与瘦素抵抗和胰岛素抵抗的发生有关。 4.肥胖儿童外周血单个核细胞SOCS-3 mRNA表达明显高于正常对照组，提示SOCS-3基因表达上调可能性参与了瘦素抵抗和胰岛素抵抗的发生。收起

关键词 : 单纯性肥胖儿童外周血单个核细胞