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1. Bmtop3-alpha对家蚕四龄幼虫致死突变体l-4i表型的影响机制研究

[学位论文] 杨琛杰江苏科技大学 2022年博士导师: 赵巧玲共192页

摘要 : 在自然界中有一类最古老的酶，它是伴随DNA的产生而产生的，这就是DNA拓扑异构酶（topoisomerase，topo）。Topo是一类控制和修改双螺旋DNA复制和转录过程中的拓扑结构的酶，此酶最基本的细胞学功能是参与DNA复制、转录、染色质与染色体的转变以及基因... 展开在自然界中有一类最古老的酶，它是伴随DNA的产生而产生的，这就是DNA拓扑异构酶（topoisomerase，topo）。Topo是一类控制和修改双螺旋DNA复制和转录过程中的拓扑结构的酶，此酶最基本的细胞学功能是参与DNA复制、转录、染色质与染色体的转变以及基因组的稳定性。在生命体中此酶的活性发生变化会导致一系列生命过程的异常从而造成不能完成其生活史。在对二化性家蚕P33的自然突变体l-4i的相关突变性状分析中前人已表明：l-4i食桑少，生长发育缓慢，不能完成整个生活史；遗传统计学分析认为常染色体上隐性纯合致死型单基因突变，图位克隆出突变基因为家蚕topo。在已初步认定topo基因突变为l-4i的形成原因时，关于拓扑异构酶（Bmtop3-alpha）的功能及l-4i形成的机制还有诸多亟待解决的问题： 1.突变基因（Bmtop3α）的序列分析和蛋白表达。本文克隆出该基因完整序列，ORF长3051bp，并与突变体作对比，发生突变的位点为第7外显子上有48bp的缺失，且没有造成移码突变。将Bmtop3α基因插入原核表达载体中，经过诱导表达检测出有目的蛋白。 2.Bmtop3-alpha蛋白的性质分析和纯化及其体外酶活性测定。经生理生化性质预测认为，Bmtop3-alpha蛋白为亲水性蛋白，有一定的可溶性，没有跨膜结构域和信号肽，在C端有一小肽的核定位信号。这些都与此酶的功能相符合——在细胞核中执行DNA解螺旋松弛和细胞复制等相关过程。经结构分析后截取核心功能区的表达并从包涵体中纯化出活性酶，解决了Bmtop3-alpha在多种原核和真核表达系统中均难以纯化出目的蛋白的难题。纯化的酶在体外松弛pBR322质粒，缺失16个氨基酸残基后的酶活性大大下降。 3.突变体的组织细胞形态学分析。鉴于突变体形体小，发育缓慢，不能完成世代更替，由此认为突变体存在大量细胞凋亡事件。通过组织冷冻切片和tunel荧光，分析了平均光密度、累积光密度（IOD）、面积和直径这四个参数与凋亡率之间的关系，并进行了相关性分析。结果认为：在实验范围内对凋亡信号的检测，野生型家蚕没有明显的变化趋势，而突变体则越来越强，相关性分析结果得出IOD与凋亡率之间的皮尔逊相关性最大。 4.利用RNA-Seq对突变体进行比较转录组学分析。突变体由于16氨基酸残基的缺失造成酶活性下降，并且检测有大量的细胞凋亡事件发生，仅凭这些还不能全面解释其表型机理。利用RNA-Seq的方法通过比较转录组学的分析，进行GO和KEGG代谢通路富集。在突变体中2013个下调表达的基因中显著富集了剪接体snRNP组装、蛋白折叠和蛋白质分解代谢过程等多个生物学过程。2405个上调表达的基因中显著富集了排名靠前的若干个生物学过程，包括嘌呤碱基代谢过程、核苷代谢过程和从头合成IMP生物合成过程等。另外还在l-4i和P33之间发现了大量的差异RNA选择性剪接事件。分析表明，多种生物学过程和途径的失衡以及选择性剪接产生的异常蛋白可能导致突变体的差异表型。 5.Bmtop3-alpha蛋白的两个重要通路和氨基酸进化同源性分析。通过对Bmtop3α基因的交并集分析，映射的KEGG通路中找到了突变体在范可尼贫血通路和同源重组两个通路中相关因子的表达量发生了明显的上下调变化。选择具有代表性的三个基因，对P33进行了RNAi分析后实验组家蚕中有出现了类似l-4i的生理性状发生，统计分析经多重比较得出实验组的体重也有达到了极显著差异变化（p＜0.0001），qRT-PCR验证了相关基因的表达量下调表达。通过对基因结构变化、转录表达和蛋白水平这三个不同维度的研究，辅以组织形态学分析结果和RNAi技术，本文以比较系统的方式初步阐明了由于Bmtop3-alpha酶活性下降所引起的DNA复制、重组、转录和修复等过程异常，导致的基因组不稳定性，进而产生的一系列连锁反应累积造成l-4i突变体发育迟缓，进食少，机体衰竭而不能完成整个生活史的机制。收起

关键词 : 家蚕突变体 RNA测序拓扑异构酶基因突变 l-4i表型细胞凋亡生物学功能

2. 简单半序约束下,位置参数非参的一个估计方法

[学位论文] 孙旭东北师范大学 2000年硕士导师: 史宁中共21页

摘要 : 这篇文章主要讨论在简单半序约束下,k个来自对称分布类的总体的位置参数的估计问题.反单个总体位置参数的非参Hodges-Lehmann估计(简单H-L估计)的想法应用到多个总体的情况,定义了多个总体位置参数在半序约束下的一个估计:加权保序H-L估计.求出了k=... 展开

关键词 : Hodges-Lehmann估计简单半序第i总体保序H-L估计加权保序H-L 次保序H-L估计

3. L-拓扑空间和I-fuzzy拓扑空间的次分离公理

[学位论文] 姜翠美中国海洋大学 2007年硕士导师: 方进明共39页

摘要 : 分离性是拓扑学中的一个基本的概念．具有各种不同分离性的拓扑空间，不仅从理论上形成不同的空间类，同时，因具有其它应用学科的应用背景而倍受关注．本文分别研究了L-拓扑学和 I-fuzzy拓扑学的分离性．在L-拓扑学中，本文引入了称之为次分离的分离... 展开

关键词 : L-拓扑 I-fuzzy拓扑次分离公理拓扑学

4. CD137-CD137L信号调控巨噬细胞表型转化及血管新生的作用研究

[学位论文] 王伦平江苏大学 2021年硕士导师: 刘培晶共69页

摘要 : 目的：探讨CD137-CD137L信号在调控巨噬细胞表型转化和血管新生中的作用。方法： 1.诱导原代骨髓源性巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages，BMDM）。使用巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage Colony Stimulating Factor，M-CSF... 展开目的：探讨CD137-CD137L信号在调控巨噬细胞表型转化和血管新生中的作用。方法： 1.诱导原代骨髓源性巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages，BMDM）。使用巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage Colony Stimulating Factor，M-CSF）诱导骨髓细胞（Bone marrow cells，BMCs）分化，6-7天后利用倒置相差显微镜动态观察细胞形态学变化、瑞氏染色法鉴定细胞的结构、墨汁吞噬实验检测细胞的吞噬能力、流式细胞仪定量测定巨噬细胞的特征性标志物F4/80、CD86、CD206的表达水平。 2.分组干预BMDM的CD137-CD137L信号后[对照组（无菌PBS）、CD137-CD137L信号激动组（CD137L重组蛋白）、CD137-CD137L信号抑制组（抑制性CD137抗体+CD137L重组蛋白）]，倒置相差显微镜下观察各组细胞的形态学变化，采用Western Blot检测各组细胞中肌成纤维细胞（MF）的特征性标记物αSMA、Collagen I和Vimentin的表达水平。 3.分组干预[分组同上]BMDM的CD137-CD137L信号后利用免疫荧光技术检测各组细胞中CD206、αSMA的表达水平和定位分布。 4.分组干预[分组同上]BMDM的CD137-CD137L信号后，提取各组细胞上清用以培养内皮细胞，通过内皮细胞划痕实验和内皮细胞管腔形成实验分别检测内皮细胞迁移能力和成管能力。 5.制备离体小鼠主动脉环，事先分组干预[分组同上]BMDM的CD137-CD137L信号后，提取各组细胞上清用以培养主动脉环，通过主动脉环血管新生实验观察干预BMDM的CD137-CD137L信号对离体动脉环血管新生的影响。结果： 1.瑞氏染色、墨汁吞噬实验和流式细胞术结果显示：M-CSF诱导产生的是具有高吞噬活性和高纯度的BMDM。 2.Western Blot检测结果显示，CD137-CD137L信号激动组细胞中肌成纤维细胞特征性标记物αSMA、Vimentin和Collagen I蛋白表达水平较对照组显著升高，采用抑制性CD137抗体处理组细胞中αSMA、Vimentin和Collagen I表达水平较激动组显著下调。 3.CD206、αSMA免疫荧光结果显示，与对照组相比，CD137-CD137L信号激动组中细胞的αSMA绿色荧光强度增强、CD206+αSMA+细胞百分比明显增加。与激动组相比，CD137-CD137L信号抑制组中细胞的绿色荧光强度减弱、CD206+αSMA+细胞百分比显著下调。 4.内皮细胞迁移实验结果显示，与对照组相比，利用CD137-CD137L信号激动组细胞上清进行培养的内皮细胞愈合面积百分比显著增加，利用CD137-CD137L信号抑制组细胞上清进行培养的内皮细胞愈合面积百分比显著下调。 5.离体主动脉环血管新生实验结果显示，利用CD137-CD137L信号激动组细胞上清进行培养的主动脉环有血管出芽表现，利用对照组和CD137-CD137L信号抑制组细胞上清进行培养的动脉环未见血管出芽。结论： 1.激动CD137-CD137L信号可以调控巨噬细胞向肌成纤维细胞表型转化（Macrophage to Myofibroblast Transition，MMT） 2.激动CD137-CD137L信号可以通过调控MMT增强内皮细胞迁移和成管能力，并促进血管新生。收起

关键词 : 巨噬细胞表型转化血管新生 CD137-CD137L信号调控功能

5. IL-35基因修饰的间充质干细胞通过c-Abl途径影响CD4+T细胞表型的体外研究

[学位论文] 赵向楠天津医科大学 2020年硕士导师: 章志翔共61页

摘要 : 研究目的使用IL-35基因修饰的间充质干细胞(Mesenchymal stromal cells，MSCs)与CD4+T细胞体外共培养，探索IL-35基因修饰的MSCs(IL-35-MSCs)在体外对CD4+T细胞的调节作用是否依赖分泌型IL-35，并探究IL-35-MSCs是否通过c-Abl途径发挥调节作用。... 展开研究目的使用IL-35基因修饰的间充质干细胞(Mesenchymal stromal cells，MSCs)与CD4+T细胞体外共培养，探索IL-35基因修饰的MSCs(IL-35-MSCs)在体外对CD4+T细胞的调节作用是否依赖分泌型IL-35，并探究IL-35-MSCs是否通过c-Abl途径发挥调节作用。研究方法 1.本课题第一部分，使用胶原酶消化法从小鼠腹股沟脂肪组织中提取原代MSCs，通过流式细胞术(FCM)对MSCs表面标记物进行鉴定，使用过表达IL-35基因的慢病毒载体在合适的慢病毒感染复数(MOI)下对MSCs进行转染实现MSC的基因修饰，通过荧光成像、FCM，鉴定转染效率，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清中分泌型IL-35的表达量。然后，应用嘌呤霉素进行筛选，对阳性克隆进行传代培养，由此获得高纯度稳定表达IL-35的MSCs(IL-35-MSCs)。 2.本课题第二部分，使用磁珠分选法分离C57BL/6J小鼠脾脏来源淋巴细胞，在体外培养环境中，与基因修饰的MSCs或者对照组细胞进行共培养，具体分组如下：(1)IL-35-MSCs组，IL-35-MSCs与CD4+T细胞共培养；(2)IL-35中和抗体组，IL-35-MSCs与CD4+T细胞，同时加入IL-35中和抗体进行阻断；(3)MSCs对照组，未转染的MSCs与CD4+T细胞共培养；(4)空白对照组，单纯CD4+T细胞。共培养72h后，FCM检测共培养体系中CD4+T细胞的Ki67表达水平判断CD4+T细胞的增殖情况；FCM检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例，判断CD4+T细胞向Treg方向分化情况；ELISA法测定各共培养体系上清中细胞因子IL-10、IL-17A的表达水平，判断CD4+T细胞的细胞因子分泌功能；qRT-PCR检测共培养体系中CD4+T细胞IL-10与IL-17AmRNA的表达水平；蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测各组中CD4+T淋巴细胞c-Abl的表达情况，探索IL-35-MSCs调控CD4+T细胞功能及分化的信号通路。研究结果 1.从小鼠脂肪中成功分离提纯出MSCs并进行增殖传代，MSCs表面高表达CD29、CD44、SCA-1，低表达或不表达CD34、CD45。采用过表达IL-35基因的慢病毒(在MOI=100的条件下)转染MSCs后，72小时后转染效率可达84.5%，慢病毒转染72小时后IL-35-MSCs组中IL-35表达量为406.7±6.615pg/ml，MSCs组未检测到IL-35，IL-35-MSCs组分泌IL-35的量较MSCs明显增加(P＜0.001)。经过嘌呤霉素药筛后成功获得稳定表达IL-35的IL-35-MSCs。 2.在MSCs与CD4+T细胞体外共培养实验中，IL-35-MSCs组和IL-35中和抗体阻断组中细胞因子IL-10和IL-17A表达水平无显著性差异，其中，两组IL-10水平均显著高于MSCs对照组和空白对照组，而IL-17A表达水平均显著低于MSCs对照组和空白对照组。IL-35-MSCs与CD4+T细胞共培养组Ki67的表达水平显著低于MSCs对照组和空白对照组(P＜0.05)，而CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例则显著升高(P＜0.05)，提示IL-35-MSCs与单纯的MSC相比具有更强的抑制CD4+T细胞增殖、促进其向CD4+CD25+Foxp3+Treg方向分化的能力。IL-35中和抗体组Ki67的表达水平也显著低于MSCs对照组和空白对照组，但是与IL-35-MSCs组相比明显升高(P＜0.05)，提示IL-35-MSCs对CD4+T细胞增殖的抑制作用可以被IL-35中和抗体部分阻断。IL-35中和抗体组CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例显著高于MSCs对照组和空白对照组，但是与IL-35-MSCs组相比明显降低(P＜0.05)，提示IL-35-MSCs诱导CD4+T细胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg方向分化的作用也可以被IL-35中和抗体部分阻断。免疫印迹实验结果显示IL-35-MSCs组c-Abl蛋白表达水平显著高于MSCs对照组和空白对照组(P＜0.05)，而IL-35中和抗体阻断组c-Abl蛋白表达水平较IL-35-MSCs组相比明显降低(P＜0.05)，但是仍显著高于MSCs对照组和空白对照组(P＜0.05)。结论在此研究中，首先成功构建IL-35基因修饰的MSCs，并应用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞株。将IL-35-MSCs与小鼠脾脏来源的CD4+T细胞共培养，证实IL-35-MSCs相比未修饰的MSCs免疫抑制能力明显增强，促进CD4+T细胞表达更多的免疫抑制因子IL-10，更低水平的炎症因子IL-17A；同时，IL-35-MSCs能更强地抑制CD4+T细胞的增殖，并促进其向Treg分化。采用IL-35中和抗体阻断分泌型IL-35后，IL-35-MSC在抑制CD4+T细胞增殖以及促进其向CD4+CD25+Foxp3+Treg分化的能力被部分抑制，提示IL-35-MSCs可能还存在不依赖分泌型IL-35的途径发挥免疫调节作用，但其发挥作用具体的机制尚不明确，有待于进一步的研究。另外，在与IL-35-MSCs共培养的CD4+T细胞中检测到更高表达的c-Abl蛋白，并且IL-35中和抗体阻断后c-Abl蛋白表达水平显著降低，说明IL-35-MSCs通过c-Abl途径对CD4+T细胞发挥增殖抑制和诱导Treg分化的功能。收起

关键词 : L-35基因间充质干细胞 c-Abl途径 CD4+T细胞表型

6. L-精氨酸对动脉球囊损伤后外膜成纤维细胞增殖和表型转化影响的实验研究

[学位论文] 高波华中科技大学 2004年硕士导师: 马业新共29页

摘要 : 目的:观察大鼠颈动脉球囊损伤后外膜成纤维细胞增殖和表型变化,研究L-精氨酸对外膜成纤维细胞的影响.方法:24只大鼠随机分成A组(假手术组)、B组(左颈总动脉球囊损伤后7天处死动物)、C组(左颈总动脉球囊损伤后14天处死动物)和D组(左颈总动脉球囊损伤前... 展开

关键词 : L-精氨酸球囊损伤外膜成纤维细胞增殖表型

7. 格值模糊拓扑空间中若干问题的研究

[学位论文] 谷敏强陕西师范大学 2004年硕士导师: 赵彬共47页

摘要 : L-拓扑空间与一般拓扑空间的差异来源于前者比后者多了个层次结构,对这类层次结构的深入研究是L-拓扑空间理论展开的基础.分离性与仿紧性是拓扑学中基本且重要的概念,相对拓扑性质与相对拓扑空间概念的提出,更加丰富了拓扑学的内容.该论文首先讨论了分... 展开 L-拓扑空间与一般拓扑空间的差异来源于前者比后者多了个层次结构,对这类层次结构的深入研究是L-拓扑空间理论展开的基础.分离性与仿紧性是拓扑学中基本且重要的概念,相对拓扑性质与相对拓扑空间概念的提出,更加丰富了拓扑学的内容.该论文首先讨论了分子生成格的构造,然后以分子生成格作为格值模糊集的值域,研究了相应的L-拓扑空间的层分离性和层仿紧性.最后对LF拓扑空间的相对良紧性和相对仿紧性作了探讨.该文内容要点如下:一、进一步研究了分子生成格的构造:利用分配的分子生成格满足第二无限分配律这一特点,给出了分配的分子生成格的等价刻划;揭示了分配的分子生成格与拓扑空间的基本关系,证明了分配的分子生成格与某一拓扑空间的闭集格同构,任一拓扑空间的闭集格必是分配的分子生成格;给出了分子生成格是完全分配格的充要条件,证明了具有逆合对应的分配的分子生成格是Fuzzy格.二、在L-拓扑空间中,用截拓扑的办法,给出了一套新的分离性公理一层分离性公理,找到了诸条层分离性公理的远域式刻划和层T<,2>的网式刻划.讨论了诸条分离性公理的遗传性、可乘性和同胚不变性.接着在LF拓扑空间中,把层分离性公理和常用的另外一套分离性公理-王国俊教授在他的专著《L-Fuzzy拓扑空间论》中提出的第一套分离性公理作了细致的比较,表明前者比后者弱.接下来我们讨论了Hutton单位区间I(L)和H(λ)单位区间的层分离性,结果表明I(L)满足最强形式的层分离性-层T<,4>分离性,而I(L)则连层T<,0>也不满足.作为该章的最后一部分,我们把层分离性进一步弱化,提出了超分离性公理.三、同样在L-拓扑空间中,用截拓扑的办法给出了一种新的仿紧性一层仿紧性的定义,得到了层仿紧性的一系列性质.经比较表明,对F拓扑而言,Ⅰ型仿紧性蕴含层仿紧性;对LF拓扑而言,Ⅱ型仿紧性蕴含层仿紧性.但一般而言,层仿紧不能推出仿紧,也不能推出Ⅱ型仿紧,Ⅰ型仿紧也不一定能推出层仿紧.四、把一般拓扑学中关于相对紧和相对仿紧的若干结果推广到了LF拓扑空间理论中,对LF拓扑空间相对良紧性与相对仿紧性作了细致研究,得到了一些有趣的结果. 收起

关键词 : 分子生成格 L-拓扑空间层T< i> 分离性超T< i> 分离性 Hutton单位区间I(L) H(&lambda )单位区间I(L) 层仿紧性相对良紧性相对仿紧性

8. miR-466i-5p促进血管平滑肌细胞增殖

[学位论文] 崔妍河北医科大学 2019年硕士导师: 韩梅共49页

摘要 : 目的：血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)属于非终末分化细胞，在血管损伤等病理因素刺激下发生表型转化，即由分化型转变为合成型。我室之前的研究发现，miR-466i-5p可能参与血管平滑肌细胞表型重塑。本实验利用体内和体外实验，... 展开目的：血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)属于非终末分化细胞，在血管损伤等病理因素刺激下发生表型转化，即由分化型转变为合成型。我室之前的研究发现，miR-466i-5p可能参与血管平滑肌细胞表型重塑。本实验利用体内和体外实验，探讨miR-466i-5p对平滑肌细胞表型转化的影响，以期为血管平滑肌细胞增殖性疾病的发病机制提供新思路。方法：构建小鼠颈总动脉内膜增生模型和血管平滑肌细胞增殖模型，运用免疫组织化学染色、Westernblot和荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、平滑肌22α(smoothmuscle22alpha，SM22α)和miR-466i-5p的表达变化。结果: 1.血管内膜增生过程中miR-466i-5p表达上调颈总动脉结扎14d，HE染色结果显示，血管内膜明显增厚，管腔狭窄，内膜中大量增生的血管平滑肌细胞排列紊乱；免疫组化染色和Westernblot显示，与假手术组比较，增殖标志物PCNA表达高于对照组(P＜0.05)，分化标志物SM22α表达低于对照组(P＜0.05)；qRT-PCR结果显示miR-466i-5p表达显著高于对照假手术组(P＜0.05)。 2.血管平滑肌细胞增殖过程中miR-466i-5p表达上调体外以10ng/mLPDGF-BB刺激血管平滑肌细胞12、24、48h，细胞计数结果显示血管平滑肌细胞在24、48h增殖活性明显升高(P＜0.05)；Westernblot结果显示，与静息状态细胞相比，PCNA在24、48h表达高于对照组(P＜0.05)，SM22α在24、48h表达低于对照组(P＜0.05)；qRT-PCR结果显示各时间点miR-466i-5p表达均显著上调(P＜0.05)，其中24h上调最明显。 3.抑制miR-466i-5p表达后血管平滑肌细胞的增殖能力下降以20μMAnti-miR-466i-5p转染血管平滑肌细胞后，给予10ng/mLPDGF-BB刺激12、24、48h，细胞计数和Westernblot结果显示，与转染Anti-miR-ctl的对照组比较，抑制miR-466i-5p表达后，各时间点血管平滑肌细胞增殖能力均明显降低(P＜0.05)，PCNA表达下调(P＜0.05)，SM22α表达上调。结论: 1.miR-466i-5p促进血管平滑肌细胞的表型转化和增殖； 2.抑制miR-466i-5p表达可降低血管平滑肌细胞增殖活性。收起

关键词 : 血管平滑肌细胞 miR-466i-5p 表型转化发病机制

9. 家蚕新突变体4龄幼虫致死基因的定位克隆及功能研究

[学位论文] 康乐群江苏科技大学 2015年博士导师: 赵巧玲共100页

摘要 : 家蚕是一种完全变态昆虫，幼虫期是其整个生活史中生长发育和储存能量的重要阶段，因此幼虫期致死对家蚕生命周期的影响无疑是巨大的，同时也会对养蚕生产造成严重的经济损失。4龄幼虫致死突变（lethal mutant in the fourth instar larvae，l-4i）是... 展开家蚕是一种完全变态昆虫，幼虫期是其整个生活史中生长发育和储存能量的重要阶段，因此幼虫期致死对家蚕生命周期的影响无疑是巨大的，同时也会对养蚕生产造成严重的经济损失。4龄幼虫致死突变（lethal mutant in the fourth instar larvae，l-4i）是一种新的幼虫期致死的突变体，本研究在对l-4i突变体遗传分析的基础上，采用图位克隆技术对l-4i的突变基因进行了定位克隆，构建了遗传连锁图，采用qRT-PCR、RNAi、酶活测定和添食特异性抑制剂方法对突变基因进行表达分析和功能验证，证实了家蚕拓扑异构酶基因Bmtop的突变是导致l-4i突变体的主要原因，为进一步研究l-4i突变体致死的分子机制奠定了基础。主要研究成果如下：一、l-4i突变体的表型特征与遗传分析 4龄幼虫致死突变（lethal mutant in the fourth instar larvae，l-4i）是在对家蚕品种P33的饲养过程中发现的一种新的幼虫期致死型突变体，其特征为l-4i突变体幼虫在3龄第2天就表现出体型较正常个体小，活力较差，生长发育缓慢的特征，3龄期延长约2天，4龄起蚕后极少进食，生长发育基本停滞，并于4龄第3~4天陆续死亡。遗传分析初步判断该突变体由常染色体上的一个隐性遗传基因控制，且为同质型（l-4il-4i）致死。二、l-4i突变基因的连锁及定位分析根据l-4i突变体的遗传规律可以得出该突变性状是由隐性纯合基因控制的，由于l-4i/l-4i有致死性，我们采用基因型为+/l-4i的雄蛾亲本（P2）与C108的雌性亲本（P1）杂交，通过一雄交二雌的方法组配并筛选杂合型F1代群体；筛选出的F1代个体进行自交或与4龄幼虫致死突变体系统中有性状分离的蛾区的亲本进行正反交回交分别组配F2代，BC1F和BC1M群体。然后用P1、F1和P2筛选了家蚕28个连锁群上具有多态性的SSR分子标记；用约400个BC1F、BC1M和F2代群体确定l-4i突变基因所在的连锁群并进行精细定位。连锁分析结果显示l-4i的突变基因位于家蚕第17连锁群；定位结果显示突变基因位于S2865-204和S2865-148两个多态性标记之间，相距约320kb，包含有18个候选基因。三、l-4i突变基因的鉴定采用RT-PCR方法对位于目标区域内候选基因的转录水平进行了检测但没有找到有明显表达差异的基因，继而又对区域内18个基因的ORF采取克隆测序以期查找差异基因，结果发现大部分基因的ORF没有差异，只有BMgn007081基因的ORF在突变体l-4i中存在两处缺失：在1430-1477位置处缺失48个碱基，在2566位置发生单碱基缺失。 RNAi初步对BMgn007081基因进行功能验证，结果显示干扰该基因后家蚕出现生长缓慢，食桑少，蚕体较小，活力较差的表型，进入眠期的时间比对照组晚约24小时左右，且后期有的家蚕幼虫陆续开始死亡，这与l-4i突变体的表型类似，因此初步判断BMgn007081基因突变是导致l-4i突变体的主要原因。利用荧光定量PCR对BMgn007081基因即家蚕拓扑异构酶基因（Bmtop）在家蚕不同组织和不同发育时期的转录水平进行了检测，获得了该基因的组织表达谱和龄期表达图谱，发现该基因在家蚕体内几乎所有组织和发育时期都有表达，这说明该基因是家蚕体内的重要功能基因，这也从侧面为突变基因的鉴定提供了有力证据。四、l-4i突变基因的功能验证家蚕基因组数据库中对BMgn007081基因的注释为该基因编码一种家蚕拓扑异构酶III，属于拓扑异构酶IA家族。为了进一步验证该突变基因的功能，通过对野生型家蚕在不同发育龄期添食40 mg/kg、80 mg/kg和160 mg/kg浓度的拓扑异构酶I抑制剂喜树碱（Camptothecin，CPT），观察家蚕生长发育状况。实验结果显示，添食喜树碱后家蚕表现出生长迟缓，蚕体较小，且后期开始陆续死亡，这与l-4i突变体的自然突变表型非常一致。此外我们考察拓扑异构酶在野生型家蚕和l-4i突变体体内的酶活力差异，同时也了检测添食不同浓度CPT的家蚕体内酶活力的变化情况。实验结果显示，l-4i突变体中拓扑异构酶活性远低于野生型家蚕，添食CPT家蚕体内的酶活力也低于对照组家蚕，且随着CPT浓度的增加家蚕体内拓扑异构酶酶活力呈现出递减的趋势。综合上述实验结果判定家蚕l-4i突变体体内的拓扑异构酶编码区缺失而导致酶活力降低是导致l-4i突变体发生并死亡的主要原因。上述研究证实了家蚕拓扑异构酶基因Bmtop的突变是导致l-4i突变体产生的主要原因，该研究不仅为阐明4龄幼虫致死突变体的分子机制的阐明提供了重要的理论依据，同时也有助于揭示家蚕生长发育调控机制，而且对预防家蚕突变死亡也具有重要的现实意义。收起

关键词 : 家蚕 l-4i突变体致死基因定位克隆功能验证

10. 中国成都地区散发2型糖尿病与HNF-1alpha I27L基因多态性关系的研究

[学位论文] 陈涛四川大学 2006年硕士导师: 田浩明共45页

摘要 : 了解中国成都地区汉族人群散发T2DM的与HNF-lalphaI27L／exonl多态性的关系。研究方法：本研究共设立2个研究组。(1)散发2型糖尿病组(ST2DM)：无明确糖尿病家族史的2型糖尿病患者92例，其中男性46名，女性46名，平均年龄61.09±11.6岁；2)老年非... 展开了解中国成都地区汉族人群散发T2DM的与HNF-lalphaI27L／exonl多态性的关系。研究方法：本研究共设立2个研究组。(1)散发2型糖尿病组(ST2DM)：无明确糖尿病家族史的2型糖尿病患者92例，其中男性46名，女性46名，平均年龄61.09±11.6岁；2)老年非糖尿病对照组(NDC)：糖耐量正常或既往无糖尿病史、空腹血糖小于5.6mm01／L且HbAlc<6.2％、无明确糖尿病家族史的个体96例，其中男性54名，女性42名，平均年龄70.72±6.71岁。测量研究对象一般临床指标、糖代谢和脂代谢相关指标，如身高、体重、腰围、血压、血糖、糖化血红蛋白、血脂等。应用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术，对两组共计188例研究对象的HNF-lalpha基因127L／exonl多态性进行筛查。结果：1．HNF-lalpha基因I27L／exonl符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ=0.26，P>0.5。三种基因型在ST2DM的频率为：AA 38％、AC 53.3％、CC 8.7％，在NDC组的频率为AA 42.7％、AC 49％、CC 8.3％；χ=4.85，P=0.028。两组共有MS患者30例、NDC组NMS有83例，在MS组和NMS组中：A等位基因频率分别为55％、68.1％，C等位基因频率为45％、31.9％，x=4.18，P=0.041，有统计学意义。4．AA、AC、CC基因型个体的TG、TC平均值分别为TG：1.37±O.70、1.67±1.13、2.61±3.61 mmol／L；TC：4.24±1.22、4.75±1.23、5.35±2.64mmol／L。单因素方差分析示三组间的差异具有统计学意义(TG:F=4.99，P=0.008；TC：F=4.89P=0.009)。用LSD(1east significant difference)法两两比较发现，CC型TG、TC平均值较AA型高(P=0.002，P=0.006)。AC型与AA型比较，TC平均值的差异有统计学意义(P=0.025)，TG的差异无统计学意义(P=0.17)。HDL平均值在三种基因型间的差异无统计学意义。结论：在四川成都地区汉族人群中，散发T2DM与老年非糖尿病对照组相比，A等位基因频率与C等位基因频率的差异以及AA、AC、CC基因型频率差异均无统计学意义，HNF-1alpha基因：127L／exonl多态性与散发2型糖尿病的关系不大；在代谢综合征组和非代谢综合征组之间，等位基因频率差异无统计学意义，基因型频率分布差异虽有统计学意义，但P=O.041，且MS组只有30例，尚需扩大样本量进一步研究。此外，L27等位基因者有较高的TG和TC水平，由于LL型样本量小，二者的关系须进一步研究。收起

关键词 : MODY3 I27L 肝细胞核转录因子-1alpha 糖尿病代谢综合征