中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 刘骏武华中农业大学 2015年硕士导师: 陈玲玲共56页

摘要 : 环状RNA是一类特殊的RNA分子，其形成方式与正常的mRNA不同，它是经过反向剪接首尾相连而成的。正是由于这种结构的特殊性，使它容易在经典分离过程中被丢弃，这也是环状RNA一直被科学家们忽视的主要原因。随着高通量测序技术和生物信息学的发展，环状... 展开环状RNA是一类特殊的RNA分子，其形成方式与正常的mRNA不同，它是经过反向剪接首尾相连而成的。正是由于这种结构的特殊性，使它容易在经典分离过程中被丢弃，这也是环状RNA一直被科学家们忽视的主要原因。随着高通量测序技术和生物信息学的发展，环状RNA在多种真核生物体中被大量鉴定出来。线虫作为模式生物，同时具有真核生物和原核生物的特点，其环状RNA虽有报导但没有深入分析。另外，植物中也尚无大规模的环状RNA研究。本课题中，我们利用经过不同处理条件下的RNA-seq数据，对线虫中存在的环状RNA进行了深入的研究，分析了线虫中环状RNA的特征以及表达量同线性RNA的关系，同时，我们预测和分析了水稻及拟南芥中的环状RNA，并比较动植物间环状RNA的差异。主要研究结果如下: 1)利用线虫多个生长发育阶段且经过核酸外切酶处理后的RNA-seq数据，共预测出1452个环状RNA，对它们进行分类，并选取典型的1112个外显子环状RNA作为后续的分析。 2)根据环状RNA的位点信息，我们发现线虫环状RNA多数是由两个且处于中间位置的外显子构成;有第一个外显子参与环化的比例比人类中要高;单个外显子成环时外显子的长度会更长。根据环状RNA上下游内含子序列信息，发现线虫环状RNA两侧具有较长的内含子序列，并且内含子间多含有反向互补配对序列。根据线虫环状RNA和线性RNA的表达量信息，发现环状RNA的表达具有生长发育阶段特异性，两者不存在直接的相关性关系。 3)利用水稻、拟南芥的RNA-seq数据和多种生物信息学方法，分别预测出213个和24个环状RNA。通过比较我们发现植物中环状RNA两侧的内含子序列长度比动物中要短，不含有的反向互补配对比例远高于动物。我们推测:植物环状RNA的形成方式与动物不同，还有与内含子互补配对驱动环化模型不一样的机制。 4)环状RNA可作为miRNA分子海绵的能力十分有限。在本研究的三个模式物种中，我们仅发现在线虫中有一个环状RNA具有潜在的分子海绵特性。收起

关键词 : 水稻环状RNA 外显子环化 RNA测序线虫

2. microRNA海绵TP73-AS1的进化与功能

[学位论文] 杨孝德中国科学院大学 2018年硕士导师: Philipp Khaitovich 共99页

摘要 : 通过转录组的研究有助于揭示人特异性表型调控的分子机制，包括RNA高通量测序技术在内的出现及高速发展，为此提供了极好的机会。在我硕士期间，我和同事找出了miR-941的重要调控介质mi R-941海绵TP73-AS1，通过进化研究解析了它在序列以及表达水平的... 展开

关键词 : microRNA 转录组 RNA测序技术小RNA 非编码RNA 肿瘤抑制因子高通量测序

3. 植物mRNA前体剪切位点的大规模检测及应用平台构建

[学位论文] 王双双山东农业大学 2016年硕士导师: 王玉军;杨龙共46页

摘要 : 转录过程产生的信使 RAN前体的剪切作用在基因表达过程中扮演着至关重要的角色，因此，对剪切作用的研究具有非常重要的意义。在已测序物种中，从21个植物物种的基因组注释文件中提取了3,199,967个剪切位点。随着测序技术的日新月异，测序的精确性越来... 展开转录过程产生的信使 RAN前体的剪切作用在基因表达过程中扮演着至关重要的角色，因此，对剪切作用的研究具有非常重要的意义。在已测序物种中，从21个植物物种的基因组注释文件中提取了3,199,967个剪切位点。随着测序技术的日新月异，测序的精确性越来越高，成本迅速降低。以上原因使物种基因组测序迅速普及。但是，与已经测序的物种数量相比，还有更多的未测序物种。未测序物种没有完善的基因组数据，只有一定数量的表达序列标签序列。在这些未测序物种中，本研究应用EST-CDS多序列联配的方法查找剪切位点，共得到4,678,710个剪切位点。本研究结果显示，剪切位点上下游特征序列的规律在各植物物种中显示出一致性。在拟南芥中，剪切位点下游3端’第一个位点碱基出现频率最大的为 G，占所有碱基的0.49289。这一数据在水稻中为0.478398。第二个位点碱基出现频率最大的为 T，在所有碱基中占比达到0.43761，这一数据在水稻中是0.43594。在第三个和第四个位点中碱基分布倾向于平均分布，即四个碱基的出现概率呈现大小规律不明显的情况。这一规律在不编码的3’UTR区段也不明显。在剪切位点的上游，即5’端，规律和3’端同样明显。从5’到3’的位置编号为1-4，即4号位点为靠近剪切位点最近的第一个碱基。这个位点上，碱基G占有绝对优势，在所有四种碱基中的出现频率最高，达到了0.726213。这一数据在水稻中为0.69928。在3号位上，即剪切位点上游的第二个碱基位点，出现频率最大的事碱基A，频率远远大于其他三个碱基的出现频率之和。在拟南芥中，这个位点上碱基 A出现的频率为0.618294。这一数据在水稻中是0.591047。1号位和2号位，即剪切位点上游的第三个碱基和第四个碱基位点上碱基出现频率规律性逐渐减小，呈现出平均分布的倾向。以上规律在不编码的5’UTR区段也不明显。为了排除其中的假阳性结果，计算了剪切位点上下游的碱基分布频率，根据计算出的碱基分布频率构建了剪切位点打分系统。为了验证剪切位点预测的准确性，以水稻和拟南芥作为样本，在拟南芥基因组中设计内含子多态性引物，多态性引物上下游100bp设计引物。以水稻基因组为模板，进行 e-PCR扩增。结果显示，77.4%的预测结果是准确的。基于以上参考植物注释文件提取的剪切位点和非模式植物的预测，构建了一个综合的数据平台 PSJ。PSJ提供剪切位点的搜索查询和在线预测。本研究为在未测序植物中查找剪切位点提供了方法，使剪切位点的跨物种预测得以实现。收起

关键词 : 信使RNA 剪切位点测序技术

4. 鼠疫耶尔森菌体内外sRNAs的鉴定与毒力相关sRNAs初步筛选

[学位论文] 孟祥荣江苏大学 2013年硕士导师: 黄新祥;韩延平共78页

摘要 : 目的: 随着高通量测序技术的发展，越来越多细菌中的非编码小RNA(smallnon-codingRNAs，sRNAs)被发现。这些sRNAs不编码蛋白质，而作为基因表达关键调控因子，有利于宿主-细菌之间的相互作用，并在病原体生存的转录后调控中起着关键作用。本研究... 展开目的: 随着高通量测序技术的发展，越来越多细菌中的非编码小RNA(smallnon-codingRNAs，sRNAs)被发现。这些sRNAs不编码蛋白质，而作为基因表达关键调控因子，有利于宿主-细菌之间的相互作用，并在病原体生存的转录后调控中起着关键作用。本研究旨在发现鼠疫耶尔森菌体新的sRNAs及其对毒力影响，揭示鼠疫菌在体外生长和体内感染期间相关sRNAs的表达模式，便于将来研究鼠疫耶尔森菌的sRNAs及其功能。方法: 1.RNA测序和信息学分析:分别提取四种条件，TMH培养基、BHI培养基、肺鼠疫模型小鼠肺和小鼠脾内的鼠疫耶尔森菌总RNA，回收50～500ntRNA片段，进行Solexa测序。经过生物信息学分析，筛选位于基因间区或反义链上，且存在于两个及两个以上样品的转录本，作为候选sRNAs。 2.候选sRNAs特征的证实:针对上述获得的候选sRNAs信息，设计相应的特异性引物，经体外转录制备地高辛标记的RNA探针，通过Northernblot实验检测候选sRNAs存在、大小和稳定性;通过引物延伸实验来确定这些高丰度表达sRNAs的转录起始位点。 3.候选sRNAs差异表达的证实:每个RNA样品，用特异性引物逆转录成cDNA后进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，分析比较候选sRNAs在体内外条件下差异表达情况;通过Northernblot实验检测候选sRNAs在体外条件下差异表达情况。 4.鼠疫菌sRNAs缺失突变株的构建:我们筛选部分高表达的sRNAs，采用λRed同源重组技术制备鼠疫耶尔森菌sRNAs缺失突变株。 5.表型实验和小鼠感染实验:通过观察菌落形态和体外生长，比较鼠疫菌野生株和sRNAs突变株的体外生长相关的表型变化;鼠疫菌野生株和sRNAs突变株分别接种于BHI培养基26℃培养至对数中期，37℃继续培养1hr。大约100个CFU鼠疫菌皮下注射感染6周龄的BALB/c小鼠，观察14天的死亡情况。结果: 1.经RNA测序和数据分析，最终发现了104个鼠疫耶尔森菌的非编码sRNAs，包括26个在其他基因组中已经注释的和78个新发现的sRNAs。 2.Northernblot实验结果验证了14个新的小RNA存在，转录本长度与RNA测序得到的长度基本吻合，并对sR034等6个sRNAs的大小和稳定性进行了初步验证;引物延伸实验结果表明，成功确定了两个sRNAs(sR034和sR035)的转录起始位点，与RNA测序结果基本一致。 3.经qRT-PCR证实，发现CsrB，CsrC，4.5SRNA和sR027等4个sRNAs在感染小鼠肺脏中表达下调。 4.成功构建了sR035等9个鼠疫菌sRNAs缺失突变株。 5.表型实验证实sRNAssR084、sR035和sR088缺失株菌落呈现光滑表型;小鼠毒力实验证实，已知毒力相关sRNAssrA缺失突变株的毒力减弱，其他5个sRNAs缺陷变异株没有减毒。结论: 本研究发现了104个sRNAs，对其基本特征和体内外表达情况进行了初步鉴定。sRNAssrA是鼠疫菌经由皮下途径感染小鼠时毒力调节必需的。但是，其他检测sRNAs对毒力没有明显影响。收起

关键词 : 鼠疫耶尔森菌 RNA测序非编码RNA 毒力调节

5. 基于组织表达谱的早期肺腺癌相关长链非编码RNA的筛选与验证

[学位论文] 石新强河北医科大学 2017年硕士导师: 田子强共63页

摘要 : 目的：原发性支气管肺癌，简称肺癌，可分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌。根据病理类型，非小细胞肺癌可分为腺癌、鳞癌、腺鳞癌和大细胞癌等。长链非编码 RNA(long non-coding RNA， lncRNA)、微小 RNA（microRNA，miRNA）和信使RNA（messengerRNA，mR... 展开目的：原发性支气管肺癌，简称肺癌，可分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌。根据病理类型，非小细胞肺癌可分为腺癌、鳞癌、腺鳞癌和大细胞癌等。长链非编码 RNA(long non-coding RNA， lncRNA)、微小 RNA（microRNA，miRNA）和信使RNA（messengerRNA，mRNA）均为DNA转录产物，lncRNA和miRNA可共同参与mRNA的表达。本研究拟将TNM分期I期肺腺癌（Lung adenocarnoma，LUAD）肿瘤组织进行RNA测序，筛选出异常表达的lncRNA、miRNA和mRNA，构建三者的共表达网络，再进行基因本体论（Gene Ontology，GO）功能聚类分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代谢通路聚类分析，从而筛选出具有生物学功能的lncRNA。最后进行基因表达水平的qRT-PCR验证，最终确定与LUAD相关的lncRNA。方法：本研究选取2015年12月29日至2016年2月18日在河北医科大学第四医院东院区胸外科行肺癌根治术的肺腺癌患者18例，TNM分期均为I期，术前均未接受放化疗，术中采集其肺癌组织及癌旁正常组织标本。按照时间先后顺序选取前10例进行RNA高通量测序，后8例进行RNA表达水平的qRT-PCR验证。lncRNA和mRNA部分：首先分别从癌组织和癌旁正常组织标本中提取总 RNA，去除 rRNA，然后将剩余的mRNA和lncRNA片段化，再合成cDNA，最后应用Illumina Hiseq4000测序平台进行测序。miRNA部分：在总RNA中回收长度18-30 nt的RNA，通过 RT-PCR逆转录成 cDNA，扩增 cDNA，回收扩增产物用于构建小RNA文库，最后应用Illumina Hiseq2500测序平台进行测序。Illumina测序得到的原始图像数据经过Base Calling软件转化为序列数据，即FastQ格式。用TopHat软件将lncRNA和mRNA的纯净序列与人类参考基因组Ensemble GRCh38 v84（hg19）进行比对，将获得的序列进行拼接并获得lncRNA和mRNA在人参考基因组Ensemble GRCh38 v84中的位置。应用Bowtie软件将miRNA与hg19进行比对。应用Cuffdiff程序筛选出与相对应的癌旁正常组织相比在癌组织中差异表达的lncRNA（Differentially Expressed lncRNA，DEL）和差异表达的mRNA（Differentially Expressed mRNA，DEM）。使用 DEGseq程序选出癌组织中差异表达的miRNA（Differentially Expressed microRNA，DEMI）。应用miRWalk数据库对DEMI的靶基因进行预测，构建DEMI-DEM交互网络，分析DEMI和DEM之间的相互作用关系，此过程通过Cytoscape软件进行分析并展示。计算DEL和 DEM的表达水平之间的共表达相关性的Pearson相关系数（Pearson correlation coefficients，PCCs）。|PCC≥0.90|的DEL-DEM共表达对用来构建共表达网络。在GRCH38参考基因组中筛选出DEL附近的蛋白质编码基因，这些编码基因与LUAD中的DEM比对，并筛选出LUAD中DEL附近的DEM。然后，将DEL附近的DEM与DEMI负性调控的那些DEM取交集，由此构建DEL-DEMI-DEM共表达网络，由Cytoscape分析并呈现。然后进行GO分析和KEGG分析，以探究癌组织中DEL的潜在的生物学功能。最后，进行 DEL/DEMI/DEM的表达水平 qRT-PCR验证。结果： 1.本研究确定15710个lncRNA和22528个mRNA在人参考基因组Ensemble GRCh38 v84中的位置。与相对应的癌旁正常组织相比在癌组织总共鉴定出了175个差异表达的lncRNA（DEL，63个上调和112个下调）和1321个差异表达的mRNA（DEM，587个上调和734个下调）。在肺癌组织中LOC80078和LOC101930114是最显著的上调和下调的DEL；EEF1A2和ANKRD1是最显著的上调和下调的DEM。与相对应的癌旁组织相比在癌组织中筛选出了94个DEMI，包括87个上调的DEMI和7个下调的DEMI。其中hsa-miR-194-5p、hsa-miR-135b-5p和hsa-miR-215-3p在癌组织中显著上调；hsa-miR-486-5p、hsa-miR-338-3p、hsa-miR-7641、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-486-3p和hsa-miR-139-3p在癌组织中显著下调。 2.通过miRWalk数据库预测了癌组织中前15个上调和下调的DEMI的靶基因，这些靶基因与1321个DEM重叠。通过Cytoscape分析并呈现的DEMI-DEM相互作用网由534个节点和1123个边组成，其中上调的DEMI与下调的DEM相互作用网络由395个节点和942个边组成，其涉及15个上调的DEMI和384个下调的DEM；hsa-miR-182-5p、hsa-miR-200b-3p和hsa-miR-429与下调的DEM关联性最高，分别与99、83和82个DEM相互作用。下调DEM/上调DEM由139个节点和181个边组成调节网络，其涉及7个下调的DEMI和132个上调的DEM；hsa-miR-486-3p、hsa-miR-138-5p和hsa-miR-338-3p与上调的DEM关联性最高，分别与61、45和41个下调的DEM相互作用。 3.在 GRCH38参考基因组中筛选出了距离175个 DEL分别<100kb的蛋白质编码基因，共筛选出了190个蛋白质编码基因。在癌组织中这190个基因与1321个DEM重叠，发现位于38个DEL附近的42个DEM是可用的。在 DEL-DEM共表达网络中，CDKN2B-AS1、FENDRR和LINC00312与DEM具有高度关联性，其分别与105、63和61个DEM共表达。DEL-DEMI-DEM共表达网络揭示了上述DEL，DEMI和DEM之间的联系。KEGG分析显示DEM在细胞粘附分子、粘着斑和紧密连接富集；GO分析显示DEM在细胞粘附、血管生成、细胞增殖调节等显著富集。 4.qRT-PCR验证8例I期LUAD患者癌组织和8例相对应的癌旁正常组织中的DEL/DEMI/DEM。和对照组相比，在癌组织中hsa-miR-200a-3p(P<0.01)、hsa-miR-200b-3p(P<0.05)、hsa-miR-200b-5p(P<0.05)、hsa-miR-200c-5p(P<0.05)和 hsa-miR-429(P<0.01)表现为上调， hsa-miR-338-3p(P<0.05)表现为下调；ADARB1（P<0.01），ADRB2（P<0.05）和ANKRD1（P<0.05）的表达水平显著下调；COL1A1（P<0.05）和MMP13（P<0.05）显著上调（图5G-5K）；lncRNA FENDRR（P<0.01）和LINC00312（P<0.01）的表达水平显著下调，lncRNA CDKN2B-AS1具有上调趋势。结论：本研究以TNM分期I期肺腺癌为研究对象，通过对癌组织及癌旁正常组织进行RNA测序，获得异常表达的RNA。研究表明lncRNA FENDRR、LINC00162、LINC00515和 LINC00312在早期肺腺癌中表达下调；CDKN2B-AS1在早期肺腺癌中表达上调，其表达水平可能与肺腺癌的发生发展存在联系，这可能对肺腺癌具有早期诊断价值。我们的研究可能为肺腺癌的发病机制的阐述奠定基础，并为肺腺癌患者确定潜在的治疗靶点和新的早期诊断生物标志物。收起

关键词 : 肺腺癌 RNA测序长链非编码RNA 组织表达谱

6. 海岛棉microRNA及其靶标的鉴定和功能分析

[学位论文] 刘念华中农业大学 2016年博士导师: 张献龙共134页

摘要 : microRNA(miRNA)作为一类长度在21-24 nucleotide(nt)的非编码RNA，在植物的生长发育，形态建成，激素信号转导，逆境胁迫响应方面起着重要的作用。目前，miRNA在棉花领域的研究不多，特别是在棉花纤维发育的功能研究几乎没有，而棉花纤维这种单细胞类... 展开 microRNA(miRNA)作为一类长度在21-24 nucleotide(nt)的非编码RNA，在植物的生长发育，形态建成，激素信号转导，逆境胁迫响应方面起着重要的作用。目前，miRNA在棉花领域的研究不多，特别是在棉花纤维发育的功能研究几乎没有，而棉花纤维这种单细胞类型是研究细胞伸长和细胞壁合成的良好模型。故我们利用小RNA测序和降解组测序的手段，鉴定了一批在棉花纤维中表达的miRNAs和大量的miRNA靶标基因，并且我们利用转基因手段对miRNA157及其靶标在纤维发育和调控花器官大小的功能做了一定的阐述。具体结果简述如下: 1.纤维发育相关microRNAs的挖掘与鉴定我们构建了七个纤维发育文库，覆盖纤维的起始，伸长和次生壁加厚期。七个文库一共检测到了78万到209万条序列，注释到47个保守miRNA家族，同时预测了34条保守miRNA前体。此外，还鉴定了七个新的候选miRNAs。这些小RNA的长度主要集中在21nt到24nt之间，miRNA的5'首位碱基更偏好为尿嘧啶。聚类分析和Northern blot的结果显示大部分的miRNAs在纤维发育的不同时期变化非常剧烈。转基因和组织化学染色的方法进一步证明miR156/157，miR165/166和miR172在纤维和胚珠中具有生物活性。 2.miRNA靶标基因调控纤维发育网络的挖掘和鉴定利用降解组测序的手段，共有140个保守miRNAs靶标和38个新的候选miRNAs靶标被检测到。这些保守靶标中有很多是转录因子，还有一些跟生长素信号，钙离子信号，双氧水信号相关。另外还发现许多靶标和细胞壁、细胞骨架相关或者是能量代谢相关。RLM-RACE技术也证实了microRNA的确能够诱导靶标基因转录本被剪切降解，证明降解组测序的结果是可靠的。我们挑选了七个感兴趣的靶标，分析了靶标和对应miRNAs表达模式的负相关性，据此推测Gb-miR156/157，390，399可能通过参与到信号转导、转录调控来影响纤维发育，而Gb-miR159，164，167和nmiR3可能直接调控细胞骨架的合成、细胞壁的合成与修饰，以及能量代谢来调控纤维的发育。 3.miRNA157可能正调控纤维伸长分析野生种和驯化种棉花差异表达基因，发现miR157的靶标SBP转录因子表达水平在棉花野生种纤维细胞整体上要高于驯化种，而Gb-miR157相反地在驯化种中表达量更高。通过转基因手段，降低miR157在纤维细胞的活性，可以提高miR157靶标SBP转录因子的表达量，而转基因材料的纤维长度则变短。由此推测，SBP转录因子可能抑制纤维细胞的发育。推测棉花驯化过程中，通过提高miR157的表达量来间接抑制SBP转录因子，最终达到促进纤维伸长的目的。 4.miRNA157参与调控花器官的发育 Real-time PCR和Northern blot结果显示miR157的表达量的确在超量表达miRNA157转基因材料中显著提高了，但是转基因材料的纤维长度并没有如预期的变长。转基因材料植株营养生长特别旺盛，叶枝明显增多，而花器官相反却明显变小，子房内胚珠数目明显减少，导致最终棉桃成熟的种子数目减少，收获的单铃籽棉产量显著降低。利用RLM-RACE技术技术在棉花花蕾中鉴定了miR157的靶标基因，它们是5个SBP-like(SPL)转录因子。利用RNA sequencing技术，我们也发现这5个SPLs基因的表达量在超量表达植株里面下调表达，进一步证明miRNA157可能通过负调控这5个SPLs基因来影响花器官的发育。另外，RNA sequencing测序的结果显示和花器官发育相关的两个MADS-box基因，AtAGL6和SITDR8的同源基因也下调表达。把检测生长素信号的DR5∷GUS报告基因通过杂交的方式导入到超量表达miR157转基因材料后，发现转基因材料的生长素信号和阴性对照相比明显减弱。这些结果说明，miRNA157可能通过靶标基因SPLs激活MADS-box基因和生长素信号的转导来调控花器官的大小和胚珠的形成。收起

关键词 : 海岛棉 RNA测序降解组测序纤维发育器官大小

7. 小鼠磨牙间充质成牙潜能的关键分子

[学位论文] 黄峰福建师范大学 2015年博士导师: 张彦定共135页

摘要 : 小鼠磨牙是研究哺乳动物上皮与间充质之间相互作用机制的重要模型。牙发育依赖于来自外胚层的牙上皮和神经嵴来源的牙间充质之间的相互诱导和作用，这种作用是通过两者之间一系列交互而有序的旁分泌生长因子信号传导而实现的。这些信号分子能调控牙胚... 展开小鼠磨牙是研究哺乳动物上皮与间充质之间相互作用机制的重要模型。牙发育依赖于来自外胚层的牙上皮和神经嵴来源的牙间充质之间的相互诱导和作用，这种作用是通过两者之间一系列交互而有序的旁分泌生长因子信号传导而实现的。这些信号分子能调控牙胚中基因的表达以及组织细胞的功能，决定牙间充质与牙上皮的牙向分化命运。牙器官的发育过程中，不同时期的牙胚组织还具备诱导牙齿发育潜能，通过特定的分泌型信号分子，可诱导非牙组织牙向分化。深入分析诱导牙齿发育潜能的关键分子组成，对利用干细胞及牙器官的发育原理进行牙齿再生的研究将具有重要的提示，可为干细胞牙向的定向分化提供理论基础。经典重组实验证明，在E9.5天，诱导成牙潜能存在于牙上皮之中，E12.5天之后诱导成牙潜能转移至牙间充质中。E13.5天的牙间充质能诱导E10.5天第二腮弓上皮（非牙源性上皮）发育成为牙齿。但利用这样的重组体系进行牙间充质的诱导成牙潜能的研究效率低下，需要同时收获两个不同时期的胚胎进行重组实验，而且E10.5天第二腮弓上皮较难分离。为了高效地开展牙间充质诱导成牙潜能的研究，本研究将探究在小鼠同期胚胎中是否存在其他的能被牙间充质诱导的非牙源性上皮组织，为牙间充质诱导成牙潜能的研究提供充足而方便制备的非牙源性上皮来源。以小鼠相同胚胎时期的头上皮组织、下颌上皮组织、肢芽上皮组织和背部上皮组织为非牙源性上皮来源，通过大量的重组实验，发现E14.5磨牙间充质组织与E14.5下颌上皮组织的重组组合成牙效率最高(61.9%)。进一步探究E14.5天下颌表皮组织与磨牙间充质组织重组体的发育模式，发现能完全模拟小鼠磨牙的发育模式，E14.5天下颌表皮组织能正常分化成为成釉组织，并分泌釉质。说明E14.5天下颌表皮组织完全可以替代E10.5天的第二腮弓上皮组织用于牙间充质的诱导成牙潜能研究，并具快捷方便性。近年来，干细胞在牙再生研究中的应用越来越广泛。已有研究报道诱导多能干细胞，表皮干细胞以及牙龈上皮干细胞都能够被间充质诱导牙向分化。在本实验室的前期研究中发现人的表皮干细胞也是可以作为一种非牙源性上皮的来源进行小鼠牙间充质的诱导成牙潜能研究，但是也存在成牙效率低下的不足。本研究将在此基础上，将不同比例的表皮干细胞与E13.5天小鼠牙间充质进行重组，探究成牙率最高的细胞比率。通过不同细胞比例的实验，本研究发现人表皮干细胞与E13.5天小鼠牙间充质细胞的比例为1∶9时，重组体具有最高的成牙率，达到92.6%，同时也能完全模拟牙齿的发育模式，人表皮干细胞也能分化成为成釉细胞，分泌釉质。本研究建立了一套高效的牙间充质诱导成牙潜能的体系，为后续的诱导成牙潜能的功能研究奠定了基础。许多生长因子在小鼠牙发育过程中各个阶段的表达模式已经得到了充分的研究。生长因子在不同组织的不同发育阶段的诱导成牙潜能中承担非常重要的作用。寻找成牙潜能的分子构成，是揭示成牙潜能的关键所在。本研究为了探究小鼠磨牙诱导成牙潜能的分子构成，首先通过体外器官培养体系，建立了小鼠磨牙间充质诱导成牙潜能的丢失模型。将E14.5天的小鼠磨牙间充质体外分别培养24h，48h小时后，分别与非牙源性表皮重组，发现在培养24小时后，小鼠磨牙间充质诱导成牙能力大幅下降，成牙率仅为19.2%。而在培养48小时后，诱导成牙潜能完全则完全丧失。通过细胞染色发现，培养24小时和48小时后的牙间充质组织未发生坏死和凋亡，因此我们推测在牙间充质体外器官培养过程中，是由于某些基因的表达变化导致了诱导成牙潜能的丢失。本研究进一步利用RNA-Seq分析的方法，将体外培养 0h，24h，48h三个时间的E14.5小鼠磨牙间充质提取总RNA，进行RNA测序，通过系统生物信息学分析，筛选出基因表达量显著下调的基因有99个，同时基因表达量上调的基因有409个。通过GO功能富集分析，最显著富集的GO功能类别为oxygen binding、oxygen transport、oxygen transporter activity、 organ development、 binding、 cytosolic part、Multicellular organismal development。共富集包含39个基因，其中可能与诱导成牙潜能丢失相关的基因为Fgf3和．Sfrp4。因此筛选得到Fgf3、Sfrp4作为诱导成牙潜能相关的候选关键分子。其中，Fgf3的表达水平随间充质组织在体外培养时间的增长而显著下调，Sfrp4在间充质组织在体外培养过程中显著上调。本研究利用CRISPR/Cas9介导的基因功能缺失技术和琼脂糖微球外源蛋白吸附手段，进一步探究Fgf3和Sfrp4是否是调控小鼠牙间充质诱导成牙潜能的关键信号分子。本研究首先选取了与牙齿发育相关的Msx1和Pax9作为阳性对照，筛选了一组脱靶率低，敲除效果好的sgRNA。在细胞水平上建立了一套快速筛选sgRNA的方法，并在牙胚重组体系中建立了CRISPR/Cas9介导的慢病毒干扰表达体系。在 E13.5天小鼠磨牙间充质细胞中沉默Msx1和Pax9的表达，不能诱导非牙源性的上皮细胞牙向分化，证明我们建立的CRISPR/Cas9介导的基因功能沉默体系有效可行。在E13.5天小鼠磨牙间充质细胞中沉默Fgf3的表达，与非牙源性的上皮细胞重组，探究Fgf3的功能缺失是否导致诱导成牙潜能的丧失，通过慢病毒感染小鼠牙间充质组织，并与非牙源性上皮组织重组。研究表明牙间充质细胞中Fgf3的表达缺失并不会明显下调诱导成牙潜能。在14.5磨牙间充质中敲除sFrp4后体外培养48h，与非牙源性上皮重组，未能挽救诱导成牙潜能。然而，本研究通过琼脂糖微球外源蛋白吸附手段，在E14.5天牙间充质组织中添加外源蛋白FGF3后，与非牙源性上皮组织重组，结果表明外源添加FGF3生长因子能显著挽救牙间充质丢失的诱导成牙潜能，成牙率达到43.8%。综上所述，本研究通过将小鼠磨牙间充质与同时期的不同非牙源性组织重组，以及不同比例人表皮干细胞与小鼠牙间充质细胞的重组，建立了简便研究牙间充质诱导成牙潜能的重组体发育模型。其中E14.5磨牙间充质与E14.5下颌上皮组织的重组成牙率达到61.g%，E13.5磨牙间充质细胞与人表皮干细胞的重组成牙率达到92.6%。利用小鼠牙间充质体外器官培养体系，建立了牙间充质诱导成牙潜能的丢失模型，发现小鼠E14.5磨牙间充质在体外培养24h诱导成牙潜能显著下降，48h后则完全丧失诱导成牙潜能。通过对诱导成牙潜能存在显著差异的间充质组织进行RNA-Seq分析，筛选出了牙间充质诱导成牙潜能的关键分子Fgf3和Sfrp4。最后通过基因的功能缺失和琼脂糖外源蛋白吸附手段，探究筛选得到的关键分子在小鼠磨牙间充质诱导成牙潜能中的作用。成功建立由CRISPR/Cas9介导的慢病毒沉默体系，在磨牙间充质细胞中对Fgf3和Sfrp4分别进行功能沉默，对成牙潜能并无明显影响。而在已丢失诱导成牙潜能的间充质中添加外源蛋白FGF3，能够明显挽救诱导成牙潜能，证明Fgf3是小鼠磨牙间充质诱导成牙潜能的关键分子。收起

关键词 : 磨牙间充质 RNA测序成牙潜能

8. 桑树钙胁迫转录组和miRNA分析及相关基因功能鉴定

[学位论文] 郑丹艳江苏科技大学 2021年硕士导师: 赵卫国共97页

摘要 : 钙（Ca）是植物生长发育中必不可少的元素。不仅作为基本元素，为植物提供并且储存养分；同时作为“第二信使”，调控体内生理及代谢活动的进行，保证植物正常生长。土壤中含钙量的巨大差异以及植物对钙素的吸收程度都对植物自身生长发育和生理活动有... 展开钙（Ca）是植物生长发育中必不可少的元素。不仅作为基本元素，为植物提供并且储存养分；同时作为“第二信使”，调控体内生理及代谢活动的进行，保证植物正常生长。土壤中含钙量的巨大差异以及植物对钙素的吸收程度都对植物自身生长发育和生理活动有极大影响。以桑树为研究对象，分析不同浓度钙胁迫下的相关生理生化指标、转录组测序及small RNA测序的结果；并对差异表达基因进行克隆、microRNA及其靶标基因进行鉴定分析。研究结果有助于阐述植物对钙的高效利用，为植物抗钙胁迫提供一定的分子机理及依据。研究结果如下： 1、桑树钙胁迫的生理生化指标测定、测序数据分析及差异基因的表达鉴定桑苗以4个浓度的CaCl2·2H2O（含0mg/L、220mg/L、440mg/L、660mg/L的CaCl2·2H2O的MS液体培养基，以440mg/L的CaCl2·2H2O作为对照组，其余三组为实验组）处理，每组3个重复，测定其生理生化指标：可溶性蛋白（Cpr）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）及脯氨酸（PRO）。结果显示，五种指标均有不同程度的变化趋势，证明钙对桑树的生长发育有影响。选择4个钙胁迫的桑叶样本进行转录组和小RNA测序；转录组测序结果中，经过滤、GC含量分布检测等一系列处理后得到可用的clean reads为94.89G，其中各样品的Q20、Q30碱基数占92.44％以上。钙胁迫下桑叶样本中3个比较组合依次有6134、11169和1870个差异基因。从差异基因中选取12个基因进行qRT-PCR，验证转录组数据。GO注释发现差异基因在生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）中都有富集；KEGG通路中，3组差异基因比较组合主要集中在核糖体、光合作用、蛋白酶体等代谢通路上。小RNA测序，3个比较组合共得到原始数据8.208G；鉴定出53个已知miRNA和61个前体发夹结构。文库同时预测到42种新型miRNA和51种新型发夹结构。3个比较组合中，差异miRNA一共鉴定到36个。选择上调和下调的7个差异miRNA进行qRT-PCR验证，显示7个miRNA均有显著性表达，与测序结果一致。候选靶基因的GO注释和KEGG通路分析：GO注释中，0vs440及660vs440的靶基因富集在在分子功能（MF）上；220vs440的候选靶基因在生物过程（BP）和细胞组分（CC）上更为集中。KEGG通路中，淀粉和蔗糖代谢途径、α-亚麻酸代谢途径和甘油磷脂代谢途径上富集了较多靶基因。 2、桑树转录因子MYB30基因的克隆及表达桑树中克隆得到MmMYB30基因（GenBank：MZ343300），cds区为867bp，编码蛋白质为288个氨基酸，预测质量为32.53KD，等电点为6.47，属于MYB转录因子家族。预测其三级结构并利用生物信息学方法与其他植物物种进行同源性及亲缘关系分析。定量分析结果表明，MmMYB30基因在不同钙胁迫下表达量增加，与转录组结果一致。SDS-PAGE技术可在大肠杆菌中成功表达MmMYB30蛋白。 3、桑树类钙调素CML37基因的克隆及功能验证桑树中克隆得到MmCML37基因（GenBank：MZ343301），cds区为435bp，编码144个氨基酸，预测蛋白质分子质量为16.36KD，等电点为4.53，属于类钙调素CML（calmodulin-like）家族。分析与其他物种的同源性及亲缘性。定量结果表明不同浓度钙胁迫下MmCML37基因表达量上调，与转录组中结果一致。利用VIGS技术在桑树中沉默MmCML37基因。经鉴定，桑叶中的丙二醛（MDA）、脯氨酸（PRO）含量、过氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性以及可溶性蛋白（Cpr）含量在钙胁迫下均出现不同程度的变化。沉默MmCML37基因后，引起桑苗体内与钙胁迫相关酶活性的变化，影响桑苗应对外界钙胁迫，进一步说明MmCML37基因在桑苗的逆境胁迫中起正向作用。 4、桑树miR156g瞬时转化过表达鉴定其钙胁迫应答功能获得miR156g前体序列后，预测二级茎环结构，发现成熟体序列位于5’臂上。成功构建miR156g瞬时过表达转化体系，在桑树幼苗中瞬时过表达miR156g后，miR156g及其对应靶基因表达量有相反的变化趋势，推测miR156g在桑苗应对钙胁迫中发挥重要作用。收起

关键词 : 桑树钙胁迫转录组测序小RNA测序基因克隆

9. IGF2BP3通过转录后可变剪切调控肺癌A549细胞的分子机制

[学位论文] 黄雪晴华中科技大学 2020年硕士导师: 殷铁军共75页

摘要 : 目的： 1.探明胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3(Insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 3，IGF2BP3)的重要靶基因，并通过生信分析方法探寻可能参与的信号传导路径； 2.通过转录组数据分析探究IGF2BP3调控可变剪切的分子机制。... 展开目的： 1.探明胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3(Insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 3，IGF2BP3)的重要靶基因，并通过生信分析方法探寻可能参与的信号传导路径； 2.通过转录组数据分析探究IGF2BP3调控可变剪切的分子机制。内容与方法： 1.靶基因的寻找及鉴定： (1)为了解IGF2BP3与癌症的关系，首先通过TCGA和Oncomine数据库获取了IGF2BP3在多种恶性肿瘤中的表达水平数据； (2)为深入探究IGF2BP3在A549中对靶基因的调控机制，将A549细胞分为IGF2BP3质粒转染组和对照组，通过质粒转染技术过表达A549细胞中的IGF2BP3，利用q-PCR和Westernblot检测两组IGF2BP3的表达水平； (3)然后利用改良的RNA免疫共沉淀测序(iRIP)技术，分析IGF2BP3转染组和对照组与IGF2BP3相互作用的转录本； (4)通过对结合峰数据进行GO和KEGG富集分析生物信息学方法，揭示其主要富集的信号通路； (5 )利用定量RIP-PCR鉴定IGF2BP3的结合靶点； 2.转录组数据分析： (1)为探究IGF2BP3对A549细胞中基因调控的影响，利用转录组测序(RNA-seq)技术分别对质粒转染组和对照组分析A549细胞中的基因表达差异； (2)基于对差异表达基因作GO和KEGG富集分析，了解这些基因参与的信号调控通路； (3)为进一步探究IGF2BP3是否在可变剪接中发挥重要作用，我们通过对转录组数据进行可变剪切分析，对A549细胞中靶点基因发生的差异可变剪切情况进行分析； (4)通过对发生可变剪切事件的基因作GO和KEGG富集分析，了解其参与的信号通路； 3.RNA-seq与iRIP-seq数据的整合分析：通过对发生可变剪切事件的基因作reads分布的分析以及q-PCR实验，对过表达IGF2BP3后A549细胞中关键调控基因的可变剪切事件变化情况进行进一步探究。结果： 1.靶基因的寻找及鉴定： (1)IGF2BP3在多种癌症中高表达，尤其是肺腺癌、肺鳞癌中出现显著高表达； (2)在A549细胞中，相比于对照组，IGF2BP3转染组的表达水平显著升高，过表达，提示IGF2BP3转染成功; (3)在A549细胞中，IGF2BP3与mRNA结合紧密，且与IGF2BP3作用的靶点基因富集分布在CDS区、3’UTR区及5’UTR区，提示编码多种蛋白产物并广泛参与RNA水平及翻译水平的调控； (4)IGF2BP3结合靶点参与RNA剪切、剪接体等多条信号通路，提示靶点基因对信号通路有重要作用; (5)IGF2BP3对BTF3、PKM等基因有调控作用，提示IGF2BP3可能通过靶基因参与A549细胞的增殖凋亡过程； 2.转录组数据分析： (1)在A549细胞中，IGF2BP3过表达后引起了1216个基因表达改变，提示IGF2BP3广泛调控A549中的基因表达； (2)差异表达的基因主要富集在Notch信号通路和Ras信号通路等多个信号通路，提示差异表达基因可能对增殖凋亡有关信号通路具有调控作用； (3)过表达IGF2BP3后，检测到121个可变剪切事件发生显著改变，提示IGF2BP3广泛调控A549细胞中的可变剪切事件； (4)发生可变剪切的基因多富集于细胞调控和信号通路(如NF-κB信号通路、RNA聚合酶II启动子的转录负调控、翻译后蛋白质修饰等)，提示可变剪接基因在A549细胞多个调控过程中广泛存在； 3.RNA-seq与iRIP-seq数据的整合分析： reads分布和q-PCR实验结果表明，过表达IGF2BP3后BTF3的可变剪切事件数量增多、PKM可变剪切事件减少，提示A549细胞中IGF2BP3可调控BTF3及PKM的可变剪接事件。结论：本研究探明并鉴定了IGF2BP3多个重要的靶基因，证实了IGF2BP3可通过转录后的可变剪切调控多个信号通路中的关键基因，从而调控A549细胞的演进过程，这些为肺癌的防治提供新的理论。收起

关键词 : 肺癌免疫共沉淀测序 RNA高通量测序

10. 一种不依赖于spike-in的mRNA定量测序技术siqRNA-seq

[学位论文] 王珍珍郑州大学 2023年硕士导师: 李亚兵；徐炜共69页

摘要 : 转录组是指特定组织或细胞在一定生理条件下的全部转录本。对转录组的解析可以全面地检测生物样本基因组中活跃基因的表达水平变化情况，揭示其功能。RNA-seq是目前最常用的转录组检测技术，其中绝对定量RNA-seq可以直接反映每个基因的RNA绝对数量，可... 展开转录组是指特定组织或细胞在一定生理条件下的全部转录本。对转录组的解析可以全面地检测生物样本基因组中活跃基因的表达水平变化情况，揭示其功能。RNA-seq是目前最常用的转录组检测技术，其中绝对定量RNA-seq可以直接反映每个基因的RNA绝对数量，可以更加真实地反映基因表达水平，是基因定量转录组研究的关键技术。目前转录组定量方法主要有两种:一是以管家基因作为内参;二是依靠掺入外源spike-in。然而这两种方法有其局限性:当细胞处于不同的生长阶段或生长条件下，其管家基因的表达并不能保持绝对稳定，导致了依赖管家基因的转录组定量技术准确性和稳定性不足;基于外源spike-in的方法虽然可以提供RNA分子的绝对量，但在大多数研究中，研究人员关注的是每个细胞的RNA含量，因此还需要对样本中的细胞进行计数，耗时费力且很多样本因质地坚硬、包埋等原因导致其细胞数难以精准统计。这些技术缺陷限制了定量转录组研究的开展。针对上述问题，本研究开发出了一种新的绝对定量转录组的测序技术——siqRNA-seq。作为一种不依赖于spike-in的RNA定量测序方法，该方法可以评估每个细胞或每套基因组中表达出的mRNA的拷贝数，且无需细胞计数或RNA定量。为了量化mRNA的表达水平，siqRNA-seq构建了纯RNA文库和总核酸文库，并建立量化模型计算出mRNA拷贝数。基于这项新技术检测了HEK293T、IOSE-80和HCT116这三种细胞系每套基因组中表达的总mRNA拷贝数，并通过RT-qPCR技术验证了siqRNA-seq定量的准确可靠。接下来，将siqRNA-seq技术应用在放线菌素D对HEK293T细胞基因表达影响的研究中，准确识别出了处理后总体mRNA水平的变化情况，并且还发现mRNA的降解速率主要与是否存在m6A修饰有较强关联。该方法可以使研究者能够便捷且准确地评估每套基因组或每个细胞的mRNA拷贝数，并且通过该技术可以避免相对定量导致的基因表达差异被错误估计或低估的现象。该技术提供了一套简洁通用的方法来定量分析各种类型样本中的mRNA情况，大幅度拓展定量转录组的研究领域。收起

关键词 : 转录组基因表达 RNA测序二代测序 spike-in