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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 目的: 随着高通量测序技术的发展,越来越多细菌中的非编码小RNA(smallnon-codingRNAs,sRNAs)被发现。这些sRNAs不编码蛋白质,而作为基因表达关键调控因子,有利于宿主-细菌之间的相互作用,并在病原体生存的转录后调控中起着关键作用。本研究旨... 展开 目的: 随着高通量测序技术的发展,越来越多细菌中的非编码小RNA(smallnon-codingRNAs,sRNAs)被发现。这些sRNAs不编码蛋白质,而作为基因表达关键调控因子,有利于宿主-细菌之间的相互作用,并在病原体生存的转录后调控中起着关键作用。本研究旨在发现鼠疫耶尔森菌体新的sRNAs及其对毒力影响,揭示鼠疫菌在体外生长和体内感染期间相关sRNAs的表达模式,便于将来研究鼠疫耶尔森菌的sRNAs及其功能。 方法: 1.RNA测序和信息学分析:分别提取四种条件,TMH培养基、BHI培养基、肺鼠疫模型小鼠肺和小鼠脾内的鼠疫耶尔森菌总RNA,回收50~500ntRNA片段,进行Solexa测序。经过生物信息学分析,筛选位于基因间区或反义链上,且存在于两个及两个以上样品的转录本,作为候选sRNAs。 2.候选sRNAs特征的证实:针对上述获得的候选sRNAs信息,设计相应的特异性引物,经体外转录制备地高辛标记的RNA探针,通过Northernblot实验检测候选sRNAs存在、大小和稳定性;通过引物延伸实验来确定这些高丰度表达sRNAs的转录起始位点。 3.候选sRNAs差异表达的证实:每个RNA样品,用特异性引物逆转录成cDNA后进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR),分析比较候选sRNAs在体内外条件下差异表达情况;通过Northernblot实验检测候选sRNAs在体外条件下差异表达情况。 4.鼠疫菌sRNAs缺失突变株的构建:我们筛选部分高表达的sRNAs,采用λRed同源重组技术制备鼠疫耶尔森菌sRNAs缺失突变株。 5.表型实验和小鼠感染实验:通过观察菌落形态和体外生长,比较鼠疫菌野生株和sRNAs突变株的体外生长相关的表型变化;鼠疫菌野生株和sRNAs突变株分别接种于BHI培养基26℃培养至对数中期,37℃继续培养1hr。大约100个CFU鼠疫菌皮下注射感染6周龄的BALB/c小鼠,观察14天的死亡情况。 结果: 1.经RNA测序和数据分析,最终发现了104个鼠疫耶尔森菌的非编码sRNAs,包括26个在其他基因组中已经注释的和78个新发现的sRNAs。 2.Northernblot实验结果验证了14个新的小RNA存在,转录本长度与RNA测序得到的长度基本吻合,并对sR034等6个sRNAs的大小和稳定性进行了初步验证;引物延伸实验结果表明,成功确定了两个sRNAs(sR034和sR035)的转录起始位点,与RNA测序结果基本一致。 3.经qRT-PCR证实,发现CsrB,CsrC,4.5SRNA和sR027等4个sRNAs在感染小鼠肺脏中表达下调。 4.成功构建了sR035等9个鼠疫菌sRNAs缺失突变株。 5.表型实验证实sRNAssR084、sR035和sR088缺失株菌落呈现光滑表型;小鼠毒力实验证实,已知毒力相关sRNAssrA缺失突变株的毒力减弱,其他5个sRNAs缺陷变异株没有减毒。 结论: 本研究发现了104个sRNAs,对其基本特征和体内外表达情况进行了初步鉴定。sRNAssrA是鼠疫菌经由皮下途径感染小鼠时毒力调节必需的。但是,其他检测sRNAs对毒力没有明显影响。 收起
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