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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 目的:原发性支气管肺癌,简称肺癌,可分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌。根据病理类型,非小细胞肺癌可分为腺癌、鳞癌、腺鳞癌和大细胞癌等。长链非编码 RNA(long non-coding RNA, lncRNA)、微小 RNA(microRNA,miRNA)和信使RNA(messengerRNA,mR... 展开 目的:原发性支气管肺癌,简称肺癌,可分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌。根据病理类型,非小细胞肺癌可分为腺癌、鳞癌、腺鳞癌和大细胞癌等。长链非编码 RNA(long non-coding RNA, lncRNA)、微小 RNA(microRNA,miRNA)和信使RNA(messengerRNA,mRNA)均为DNA转录产物,lncRNA和miRNA可共同参与mRNA的表达。本研究拟将TNM分期I期肺腺癌(Lung adenocarnoma,LUAD)肿瘤组织进行RNA测序,筛选出异常表达的lncRNA、miRNA和mRNA,构建三者的共表达网络,再进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能聚类分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)代谢通路聚类分析,从而筛选出具有生物学功能的lncRNA。最后进行基因表达水平的qRT-PCR验证,最终确定与LUAD相关的lncRNA。 方法:本研究选取2015年12月29日至2016年2月18日在河北医科大学第四医院东院区胸外科行肺癌根治术的肺腺癌患者18例,TNM分期均为I期,术前均未接受放化疗,术中采集其肺癌组织及癌旁正常组织标本。按照时间先后顺序选取前10例进行RNA高通量测序,后8例进行RNA表达水平的qRT-PCR验证。lncRNA和mRNA部分:首先分别从癌组织和癌旁正常组织标本中提取总 RNA,去除 rRNA,然后将剩余的mRNA和lncRNA片段化,再合成cDNA,最后应用Illumina Hiseq4000测序平台进行测序。miRNA部分:在总RNA中回收长度18-30 nt的RNA,通过 RT-PCR逆转录成 cDNA,扩增 cDNA,回收扩增产物用于构建小RNA文库,最后应用Illumina Hiseq2500测序平台进行测序。Illumina测序得到的原始图像数据经过Base Calling软件转化为序列数据,即FastQ格式。用TopHat软件将lncRNA和mRNA的纯净序列与人类参考基因组Ensemble GRCh38 v84(hg19)进行比对,将获得的序列进行拼接并获得lncRNA和mRNA在人参考基因组Ensemble GRCh38 v84中的位置。应用Bowtie软件将miRNA与hg19进行比对。应用Cuffdiff程序筛选出与相对应的癌旁正常组织相比在癌组织中差异表达的lncRNA(Differentially Expressed lncRNA,DEL)和差异表达的mRNA(Differentially Expressed mRNA,DEM)。使用 DEGseq程序选出癌组织中差异表达的miRNA(Differentially Expressed microRNA,DEMI)。应用miRWalk数据库对DEMI的靶基因进行预测,构建DEMI-DEM交互网络,分析DEMI和DEM之间的相互作用关系,此过程通过Cytoscape软件进行分析并展示。计算DEL和 DEM的表达水平之间的共表达相关性的Pearson相关系数(Pearson correlation coefficients,PCCs)。|PCC≥0.90|的DEL-DEM共表达对用来构建共表达网络。在GRCH38参考基因组中筛选出DEL附近的蛋白质编码基因,这些编码基因与LUAD中的DEM比对,并筛选出LUAD中DEL附近的DEM。然后,将DEL附近的DEM与DEMI负性调控的那些DEM取交集,由此构建DEL-DEMI-DEM共表达网络,由Cytoscape分析并呈现。然后进行GO分析和KEGG分析,以探究癌组织中DEL的潜在的生物学功能。最后,进行 DEL/DEMI/DEM的表达水平 qRT-PCR验证。 结果: 1.本研究确定15710个lncRNA和22528个mRNA在人参考基因组Ensemble GRCh38 v84中的位置。与相对应的癌旁正常组织相比在癌组织总共鉴定出了175个差异表达的lncRNA(DEL,63个上调和112个下调)和1321个差异表达的mRNA(DEM,587个上调和734个下调)。在肺癌组织中LOC80078和LOC101930114是最显著的上调和下调的DEL;EEF1A2和ANKRD1是最显著的上调和下调的DEM。与相对应的癌旁组织相比在癌组织中筛选出了94个DEMI,包括87个上调的DEMI和7个下调的DEMI。其中hsa-miR-194-5p、hsa-miR-135b-5p和hsa-miR-215-3p在癌组织中显著上调;hsa-miR-486-5p、hsa-miR-338-3p、hsa-miR-7641、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-486-3p和hsa-miR-139-3p在癌组织中显著下调。 2.通过miRWalk数据库预测了癌组织中前15个上调和下调的DEMI的靶基因,这些靶基因与1321个DEM重叠。通过Cytoscape分析并呈现的DEMI-DEM相互作用网由534个节点和1123个边组成,其中上调的DEMI与下调的DEM相互作用网络由395个节点和942个边组成,其涉及15个上调的DEMI和384个下调的DEM;hsa-miR-182-5p、hsa-miR-200b-3p和hsa-miR-429与下调的DEM关联性最高,分别与99、83和82个DEM相互作用。下调DEM/上调DEM由139个节点和181个边组成调节网络,其涉及7个下调的DEMI和132个上调的DEM;hsa-miR-486-3p、hsa-miR-138-5p和hsa-miR-338-3p与上调的DEM关联性最高,分别与61、45和41个下调的DEM相互作用。 3.在 GRCH38参考基因组中筛选出了距离175个 DEL分别<100kb的蛋白质编码基因,共筛选出了190个蛋白质编码基因。在癌组织中这190个基因与1321个DEM重叠,发现位于38个DEL附近的42个DEM是可用的。在 DEL-DEM共表达网络中,CDKN2B-AS1、FENDRR和LINC00312与DEM具有高度关联性,其分别与105、63和61个DEM共表达。DEL-DEMI-DEM共表达网络揭示了上述DEL,DEMI和DEM之间的联系。KEGG分析显示DEM在细胞粘附分子、粘着斑和紧密连接富集;GO分析显示DEM在细胞粘附、血管生成、细胞增殖调节等显著富集。 4.qRT-PCR验证8例I期LUAD患者癌组织和8例相对应的癌旁正常组织中的DEL/DEMI/DEM。和对照组相比,在癌组织中hsa-miR-200a-3p(P<0.01)、hsa-miR-200b-3p(P<0.05)、hsa-miR-200b-5p(P<0.05)、hsa-miR-200c-5p(P<0.05)和 hsa-miR-429(P<0.01)表现为上调, hsa-miR-338-3p(P<0.05)表现为下调;ADARB1(P<0.01),ADRB2(P<0.05)和ANKRD1(P<0.05)的表达水平显著下调;COL1A1(P<0.05)和MMP13(P<0.05)显著上调(图5G-5K);lncRNA FENDRR(P<0.01)和LINC00312(P<0.01)的表达水平显著下调,lncRNA CDKN2B-AS1具有上调趋势。 结论:本研究以TNM分期I期肺腺癌为研究对象,通过对癌组织及癌旁正常组织进行RNA测序,获得异常表达的RNA。研究表明lncRNA FENDRR、LINC00162、LINC00515和 LINC00312在早期肺腺癌中表达下调;CDKN2B-AS1在早期肺腺癌中表达上调,其表达水平可能与肺腺癌的发生发展存在联系,这可能对肺腺癌具有早期诊断价值。我们的研究可能为肺腺癌的发病机制的阐述奠定基础,并为肺腺癌患者确定潜在的治疗靶点和新的早期诊断生物标志物。 收起
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