摘要: 目的： 1.探明胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3(Insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 3，IGF2BP3)的重要靶基因，并通过生信分析方法探寻可能参与的信号传导路径； 2.通过转录组数据分析探究IGF2BP3调控可变剪切的分子机制。 ... 展开 目的： 1.探明胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3(Insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 3，IGF2BP3)的重要靶基因，并通过生信分析方法探寻可能参与的信号传导路径； 2.通过转录组数据分析探究IGF2BP3调控可变剪切的分子机制。 内容与方法： 1.靶基因的寻找及鉴定： (1)为了解IGF2BP3与癌症的关系，首先通过TCGA和Oncomine数据库获取了IGF2BP3在多种恶性肿瘤中的表达水平数据； (2)为深入探究IGF2BP3在A549中对靶基因的调控机制，将A549细胞分为IGF2BP3质粒转染组和对照组，通过质粒转染技术过表达A549细胞中的IGF2BP3，利用q-PCR和Westernblot检测两组IGF2BP3的表达水平； (3)然后利用改良的RNA免疫共沉淀测序(iRIP)技术，分析IGF2BP3转染组和对照组与IGF2BP3相互作用的转录本； (4)通过对结合峰数据进行GO和KEGG富集分析生物信息学方法，揭示其主要富集的信号通路； (5 )利用定量RIP-PCR鉴定IGF2BP3的结合靶点； 2.转录组数据分析： (1)为探究IGF2BP3对A549细胞中基因调控的影响，利用转录组测序(RNA-seq)技术分别对质粒转染组和对照组分析A549细胞中的基因表达差异； (2)基于对差异表达基因作GO和KEGG富集分析，了解这些基因参与的信号调控通路； (3)为进一步探究IGF2BP3是否在可变剪接中发挥重要作用，我们通过对转录组数据进行可变剪切分析，对A549细胞中靶点基因发生的差异可变剪切情况进行分析； (4)通过对发生可变剪切事件的基因作GO和KEGG富集分析，了解其参与的信号通路； 3.RNA-seq与iRIP-seq数据的整合分析： 通过对发生可变剪切事件的基因作reads分布的分析以及q-PCR实验，对过表达IGF2BP3后A549细胞中关键调控基因的可变剪切事件变化情况进行进一步探究。 结果： 1.靶基因的寻找及鉴定： (1)IGF2BP3在多种癌症中高表达，尤其是肺腺癌、肺鳞癌中出现显著高表达； (2)在A549细胞中，相比于对照组，IGF2BP3转染组的表达水平显著升高，过表达，提示IGF2BP3转染成功; (3)在A549细胞中，IGF2BP3与mRNA结合紧密，且与IGF2BP3作用的靶点基因富集分布在CDS区、3’UTR区及5’UTR区，提示编码多种蛋白产物并广泛参与RNA水平及翻译水平的调控； (4)IGF2BP3结合靶点参与RNA剪切、剪接体等多条信号通路，提示靶点基因对信号通路有重要作用; (5)IGF2BP3对BTF3、PKM等基因有调控作用，提示IGF2BP3可能通过靶基因参与A549细胞的增殖凋亡过程； 2.转录组数据分析： (1)在A549细胞中，IGF2BP3过表达后引起了1216个基因表达改变，提示IGF2BP3广泛调控A549中的基因表达； (2)差异表达的基因主要富集在Notch信号通路和Ras信号通路等多个信号通路，提示差异表达基因可能对增殖凋亡有关信号通路具有调控作用； (3)过表达IGF2BP3后，检测到121个可变剪切事件发生显著改变，提示IGF2BP3广泛调控A549细胞中的可变剪切事件； (4)发生可变剪切的基因多富集于细胞调控和信号通路(如NF-κB信号通路、RNA聚合酶II启动子的转录负调控、翻译后蛋白质修饰等)，提示可变剪接基因在A549细胞多个调控过程中广泛存在； 3.RNA-seq与iRIP-seq数据的整合分析： reads分布和q-PCR实验结果表明，过表达IGF2BP3后BTF3的可变剪切事件数量增多、PKM可变剪切事件减少，提示A549细胞中IGF2BP3可调控BTF3及PKM的可变剪接事件。 结论： 本研究探明并鉴定了IGF2BP3多个重要的靶基因，证实了IGF2BP3可通过转录后的可变剪切调控多个信号通路中的关键基因，从而调控A549细胞的演进过程，这些为肺癌的防治提供新的理论。 收起