摘要: 目的：血小板的主要功能是参与止凝血和炎症反应等生理代谢过程，近年有大量研究发现血小板和肿瘤细胞之间会发生相互作用，形成一个有利于肿瘤生长的肿瘤微环境，帮助肿瘤细胞有效逃避机体免疫系统的监视，进行恶性生长或远处转移。血小板内含有丰富... 展开 目的：血小板的主要功能是参与止凝血和炎症反应等生理代谢过程，近年有大量研究发现血小板和肿瘤细胞之间会发生相互作用，形成一个有利于肿瘤生长的肿瘤微环境，帮助肿瘤细胞有效逃避机体免疫系统的监视，进行恶性生长或远处转移。血小板内含有丰富的mRNA，可以作为早期泛癌发生发展的潜在生物标志物，而实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）一直是量化样本中mRNA转录水平的关键。为了最大程度地减少实验误差并获得更准确的肿瘤教化血小板内转录本表达水平的差异，需要筛选出最稳定的参考基因来作为定量分析的参照标准。 方法：在GEO数据库下载血小板转录组的表达谱数据集，并对其进行生物信息学分析、GO和KEGG富集功能分析，根据制定的过滤标准筛选出稳定表达的候选参考基因，并通过系统的方法对表达的稳定性进行评估，验证其临床价值。收集64例癌症患者、19例肺良性病变患者和38例健康受试者的血小板样本，分成三组，采用实时荧光定量PCR技术分别对候选参考基因验证。第一组验证纳入5位非小细胞肺癌患者、6位肝癌患者、6位乳腺癌患者、6位结肠癌患者和7位健康受试者，通过对血小板RNA表达量的平均值、标准差和变异系数的综合评估后，选取表达最稳定的3个参考基因进行第二组验证。第二组验证纳入了50位受试者，包括非小细胞肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和健康受试者各10例，通过Delta CT,BestKeeper,geNorm和NormFinder四种算法对候选参考基因的表达稳定性进行系统性地分析，选择出最适合用于泛癌RNA定量分析的参考基因。第三组验证纳入了21例非小细胞肺癌患者、19例肺良性病变患者和21例健康受试者，将最终筛选的基因作为参考基因，验证FLNA基因在肺癌、肺良性病变患者和健康受试者中的差异表达，评估该参考基因的临床价值。 结果：在数据集GSE68086中选出符合条件的候选基因，通过优化了均值＞1和变异系数<1后筛选出95个候选基因，结合目前73个已知的参考基因，最终筛选出了7个候选基因：YWHAZ，GNAS，GAPDH，OAZ1，PTMA，B2M和ACTB。GO和KEGG富集功能分析发现这些候选基因与人体血小板的活化，细胞的胞吞作用，肌动蛋白细胞骨架调控等多种因素有关。这7个候选基因在30个研究对象中进行第一步验证后发现：CV最低的参考基因B2M是高度稳定的，表达水平更高，其Mean=25.40，Median=25.19，SD=1.33，CV=0.052；B2M在肝癌（CV=0.03，SD=0.75）和乳腺癌（CV=0.04，SD=1.13）中比其他基因更稳定。GAPDH在结肠癌（CV=0.05，SD=1.41）内的表达更稳定，PTMA在健康对照（CV=0.04，SD=1.17）和非小细胞肺癌（CV=0.05，SD=1.59）中的表达也较高；最终选择表达稳定性综合分析最好的3个基因：GAPDH，ACTB和B2M，在50例受试对象中进行下一步RT-qPCR和算法验证，通过算法稳定性排序，筛选出GAPDH是最适合做泛癌RNA定量分析的参考基因，并进一步通过RT-qPCR实验验证其作为参考基因，在验证肺癌差异基因FLNA的表达的临床应用价值。 结论：我们从癌症和正常人的RNA的表达谱中，筛选出了最适合作为泛癌血小板RNA定量分析的参考基因：GAPDH。从四种算法的评估结果中看出，本研究入选的参考基因在不同的癌症中是表达稳定性是不完全相同的，也可根据不同的研究对象选择最合适的参考基因。 收起