中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 韦伟洋江苏科技大学 2018年硕士导师: 赵巧玲共88页

摘要 : 家蚕（Bombyx mori）身为鳞翅目昆虫良好的模型生物，不仅经济价值高，而且具有十分重要的研究意义，目前已被众多的生物学研究者们当做研究生物遗传的首选研究材料，在家蚕的遗传特性研究以及对家蚕各种突变体的突变控制基因的功能研究方面取得了丰硕... 展开家蚕（Bombyx mori）身为鳞翅目昆虫良好的模型生物，不仅经济价值高，而且具有十分重要的研究意义，目前已被众多的生物学研究者们当做研究生物遗传的首选研究材料，在家蚕的遗传特性研究以及对家蚕各种突变体的突变控制基因的功能研究方面取得了丰硕的成果。家蚕是完全变态发育的昆虫，在家蚕变态发育的过程中，每个生长阶段都需经历一次蜕皮，这是家蚕在其整个生命过程之中的非常重要的成长过程，是每个家蚕从卵孵化至化蛹都必须要具备的条件。家蚕四龄不眠蚕突变体（non-molting in the 4thinstar,nm4）和袖珍蚕突变体（mini）是在家蚕品种资源S8V中同时发现的两种新型的家蚕的突变体，其中，nm4突变体生长到四龄将眠期之后便会出现无法蜕皮而致其死亡；mini突变体体型远远小于相同生长阶段中野生型家蚕的体型，4龄期仍只有正常2龄蚕大小，突变体2龄开始就能分辨，发育整齐但迟缓，发育到4龄后半期陆续死亡。本课题进行nm4突变体和mini突变体遗传学分析，确定了两个突变基因属于独立遗传。继而对突变基因做出定位分析，建立了突变基因的遗传连锁图谱。主要内容如下：一、四龄不眠蚕的遗传分析选择家蚕S8V品种有四龄不眠蚕突变体（nm4）分离的蛾区进行调查，正常型与nm4之间的分离比表现为3∶1；突变个体在1-3龄期可以与野生型家蚕一样入眠，生长至四龄将眠期持续一周左右便会出现无法蜕皮而相继死去。因此，该突变体采用杂合体进行继代。用杂合型（+nm4）个体与正常型家蚕进行杂交，得到以下结果：不管是正交还是反交，得到的F1代都表现为正常型家蚕，F2代有的蛾区出现了性状分离，有正常型家蚕和nm4突变体两种，其中，正常型与nm4之间的分离比表现为3∶1；用正常型亲本，分别与正交和反交得到的F1代进行回交实验，结果得到的后代都是正常的表型，用杂合型（+nm4）个体作为回交的亲本，同样与正交和反交得到的F1进行回交，结果有的蛾区也出现了出现家蚕和nm4家蚕两种表型，并且它们的分离比是3∶1。由上述实验结果可以得出，nm4突变体是由位于常染色体上的一个隐性的基因控制的。二、四龄不眠蚕突变基因定位配制两种亲本种群（P1、P2），杂交一代种群（F1），两种回交一代种群（BC1F、BC1M），利用两种亲本种群以及杂交一代种群进行实验，找到28对家蚕染色体上的多态性SSR分子标记，然后以BC1F群体分离的正常型和突变型各10头蚕为材料进行连锁验证实验，实验结果四龄不眠蚕（nm4）的突变基因位于家蚕第12号染色体上；以BC1M群体中分离的340个四龄不眠蚕（nm4）个体来进行定位实验，最后将四龄不眠蚕（nm4）突变基因精细定位在两个具有多态性SSR标记引物S2990-82与S2990-157区间内，这两个多态性标记相距0.4cM,物理距离大约320.3kb，区间内包含了12个候选的基因。通过查阅NCBI数据库找到了这12个候选基因的功能。利用蜕皮激素20E添食突变体，使突变体能蜕皮发育到5龄。说明该突变体是蜕皮激素水平有缺陷，使突变体不能正常蜕皮发育。三、袖珍蚕突变体的遗传分析和基因定位与家蚕四龄不眠蚕（nm4）突变体遗传分析相同的方法分析袖珍蚕突变体（mini），结果显示袖珍蚕突变体（mini）也是由家蚕常染色体上的一个隐性基因所控制的突变，表现纯合致死。两个杂合基因型的个体自交，后代出现3∶1分离。但与野生型的杂交分离后代中袖珍蚕突变体较少，达不到3∶1的比例，不明因子影响着杂交世代中突变体的分离。同样基因定位结果袖珍蚕突变体（mini）的突变基因位于家蚕第22号染色体上。家蚕四龄不眠蚕突变体（nm4）和袖珍蚕突变体（mini）虽然是同时在家蚕品种资源S8V中发现，它们的共同点都表现为生长发育异常，本课题研究明确了它们是独立的突变体，受控于不同的基因。进一步挖掘基因的功能，以其作为靶标基因应用到鳞翅目害虫种群控制具有积极意义。收起

关键词 : 家蚕 nm4突变体 mini突变体遗传分析基因克隆

2. 家蚕无鳞片翅突变体scaleless产生机理的研究

[学位论文] 周庆祥中国农业科学院 2007年博士导师: 张志芳共107页

摘要 : 翅面被覆鳞片是鳞翅目昆虫的主要特征之一;鳞片对于鳞翅目昆虫具有重要的生理意义,而鳞片构成的各种翅面图案具有特定的发育机制和进化模式,因此鳞翅目昆虫的鳞片在昆虫生理学、发育生物学以及生物进化,甚至害虫防治上都具有重要的研究价值.本文以家蚕... 展开翅面被覆鳞片是鳞翅目昆虫的主要特征之一;鳞片对于鳞翅目昆虫具有重要的生理意义,而鳞片构成的各种翅面图案具有特定的发育机制和进化模式,因此鳞翅目昆虫的鳞片在昆虫生理学、发育生物学以及生物进化,甚至害虫防治上都具有重要的研究价值.本文以家蚕无鳞片翅突变体scaleless (sl)为材料,从形态学、细胞生物学和分子生物学角度对突变体的产生机理进行了研究,力图阐明无鳞片翅突变表型的发生机理;并为鳞翅目昆虫鳞片的发育机制提供理论参考. 首先从探明家蚕翅的生长发育机制入手,调查了五龄幼虫及蛹期翅原基(翅)的大小和形态变化,并建立了翅原基摘除和移植技术,为论文的深入研究提供实验和理论基础.翅原基在五龄前期生长缓慢,变态前生长最快;蛹期翅芽大小基本不变,但伴随有鳞片的形成和色素沉积过程.家蚕幼虫期的造血器官紧密附着在翅原基上,形成造血器官一翅原基复合体.五龄早期将4个造血器官一翅原基复合体全部摘除,家蚕幼虫仍能正常生长并发育成蛹和具有交配及产卵能力的蛾;同时其发育过程中血球总数仍呈增长趋势,但是明显低于正常蚕,由此推测化蛹变态中造血器官的崩解是变态的结果而不是其必要因素.全部造血器官一翅原基复合体摘除后配合使用MH或JHA均会增加熟蚕体内的血球数量,认为保幼激素在造血器官一翅原基复合体全部摘除的蚕体内有促进血球有丝分裂的作用. 运用建立的翅原基(翅)解剖技术,分析了家蚕突变体scaleless的表型性状,发现其成虫翅面鳞片明显比野生型(WT)的少,并且所具有的少量鳞片比野生型的小且分叉少.五龄幼虫翅原基的相互移植实验证明决定这一突变性状的调控因子不存在于体液中,而是存在于翅原基自身内部.化蛹前scaleless的翅原基与WT的在形态和结构上没有明显差异,化蛹后WT家蚕的翅脉开始出现气管分叉并延伸进入翅面,2 d蛹时已经可以看到翅脉之间的气管相互交织形成网状;但是scaleless家蚕蛹的翅脉中气管分叉少并且延伸不良.蛹期经过高氧分压处理可以部分挽回scaleless家蚕翅面的鳞片,使其成虫翅面鳞片明显增多.在幼虫五龄早期的翅原基表面划一道浅的刻痕使翅脉受伤,亦可形成成虫翅面鳞片少的表型.因此我们推测翅原基的翅脉中气管发育异常致使翅面细胞缺氧是导致scaleless鳞片变少的一个重要原因. 进一步实验阐明了 scaleless 突变体家蚕细胞生物学方面的产生机理.AO/EB染色及Caspase-3/7活性分析结果显示在蛹的早期,翅面鳞片的发育伴随有细胞凋亡的参与.2 d时大量翅面细胞凋亡,存活的细胞则整齐地排列在翅的表面.scaleless家蚕不同于野生型,其翅面大量细胞凋亡现象比WT出现的晚1天,且翅面细胞几乎全部死亡;并且Caspase-3/7的最大活性相当于WT的近10倍.同时有关凋亡小体和DNA片段化的实验结果也说明scaleless蛹期翅面细胞过度凋亡,从而产生了成虫翅面少鳞片的突变性状. AS-C基因与果蝇背板刚毛的发育有关;AS-C的同源体基因(ASH)B-ASH,也控制着蝴蝶翅面鳞片的形成.为了从分子生物学角度阐明家蚕scaleless突变体的产生机理,克隆并鉴定了家蚕的AS-C同源体基因.发现家蚕至少有四个ASH基因,分别命名为Bm-ASH1、Bm-ASH2、Bm-ASH3和Bm-ase四个基因均具有明显的bHLH基序,并且前三个基因编码的蛋白质的C-端也具有16～17个氨基酸组成的保守区,这些都符合AS-C同源体基因的特点.同源性比较和进化分析说明三个原神经基因中Bm-ASHl是最早分化形成的一个;Bm-ASH2和Bm-ASH3同源性最高,推测相对于Bm-ASH1形成较晚.用RT-PCR和实时荧光定量PCR检测了家蚕ASH基因在幼虫期不同组织器官及胚胎发育过程中的表达情况,发现Bm-ASH1和Bm-ASH2表达范围最广,胚胎发育过程中也有较高的表达量;而Bm-ASH3表达特异性相对较高,因此推断其形成较Bm-ASH2为晚,即Bm.ASH.;是四个家蚕ASH基因中最晚形成的一个.ase基因主要在神经前体细胞中表达,因此Bm-ase表达范围较窄,组织中总体表达量较低.但同源比较和功能分析都不能将家蚕的三个原神经基因和果蝇的一一对应,因此其命名依然按照发现的先后顺序进行. 通过半定量RT-PCR发现家蚕的吐丝期和蛹期,Bm-ASH1和Bm-ASH3基因在scaleless和WT家蚕中的表达时相几乎一致;Bm-ASH2只在0 d～2 d的WT蛹翅中表达,而scaleless中没有检测到表达信号.原位杂交结果也证明Bm-ASH2在scaleless蛹翅中不能正常表达.将WT及 scaleless的Bm-ASH2基因起始密码子上游的启动子序列克隆并测序,发现scaleless的ATG上游1027 bp处有一段连续26 bp的缺失突变.利用家蚕细胞瞬时表达系统分析了Bm-ASH2基因启动子活性,发现scaleless比WT低得多,只与截去了其缺失的26 bp的979 bp WT启动子片段的活性相当.EMSA结果显示scaleless缺失的26 bp序列可以特异性结合某种核蛋白.遗传学实验则证明26 bp序列缺失与无鳞片翅突变表型紧密连锁.这些都说明.scaleless的Bm-ASH2基因因启动子突变而使其不能正常转录和表达.利用瞬时表达系统使Bm-ASH2基因在scaleless早期蛹翅中表达,可以使翅面鳞片明显增多,进一步说明Bm-ASH2是家蚕翅面鳞片产生的关键因子.从而初步阐明了家蚕无鳞片翅突变体scaleless产生的分子机理. 收起

关键词 : 家蚕 scaleless突变体翅原基鳞片产生机理

3. 家蚕TILLING技术的优化及其在丝素基因突变体筛选中的初步应用

[学位论文] 陈冬妹西南大学 2008年硕士导师: 夏庆友共65页

摘要 : 随着基因组测序工作的不断推进，人类已经进入了以功能基因组研究为主题的后基因组时代，其中一个显著的特点就是，发现新基因和认识基因的生物学功能成为最为紧迫的任务。突变体是功能基因组学研究的重要材料，受到人们越来越广泛的重视。在这样的大... 展开随着基因组测序工作的不断推进，人类已经进入了以功能基因组研究为主题的后基因组时代，其中一个显著的特点就是，发现新基因和认识基因的生物学功能成为最为紧迫的任务。突变体是功能基因组学研究的重要材料，受到人们越来越广泛的重视。在这样的大背景下，大规模突变体库的构建就成为了功能基因组研究的一个重要内容。获得突变体的方法很多，除了收集自然突变体以外，还有采用人工诱变的方法，如物理化学诱变、基因敲除(knock-out)、基因沉默(gonesilence)、插入突变(insertionalmutagenesis)等，每种方法都各有其优缺点。定向诱导基因组局部突变——TILLING(TargetingInducedLocalLesionsInGenomes)是近年发展起来的一种全新的反向遗传学方法。它的基本原理是：采用特异基因引物对应用化学诱变剂所产生的突变群体进行PCR放大突变信号，经变性和复性过程得到异源双链DNA分子，再用能特异切割错配位点的核酸内切酶(如CELⅠ)切割异源双链，并用变性电泳检测酶切产物，最后筛选出目的基因突变体。该技术具有通量高、操作简单、成本低等优点，可以有效克服其它获得突变体方法的繁琐、费时等不足，因此被广泛应用于多种生物的功能基因组学研究。我们有理由相信，TILLING技术在家蚕中也能充分体现其潜在的优势并发挥其重要的作用。本研究在前人研究的基础上，应用化学诱变剂N-甲基N-亚硝基脲(MNU)对家蚕进行诱变处理，构建了化学诱变的家蚕突变体库；同时优化了家蚕TILLING技术的检测体系；并在此基础上，以家蚕重要的功能基因之一即丝素基因作为研究对象，初步应用TILLING技术筛选了目标区域的点突变，以期验证该技术在家蚕中应用的可行性并获得丝素基因突变体。主要结果如下：(1)首先调查了诱变剂MNU对家蚕第五天蛹的半致死剂量(LD50)，结果表明，注射体积为50μL，的情况下，MNU在雌雄蛹中半致死浓度分别为：雌蛹1730μg/mL、雄蛹1416.7μg/mL；即LD50(雌蛹)=86.5μg/头、LD50(雄蛹)=70.8μg/头。其次用MNU对家蚕进行诱变，构建了家蚕突变体库，同时调查了M0代化蛾率和M1代卵的孵化率，结果发现MNU诱变浓度为1000μg/mL时，M0代化蛾率低且M1代卵胚胎致死现象严重；MNU诱变浓度为100μg/mL时，M0代化蛾率及M1代卵的孵化率都明显提高，并获得了较多存活的诱变后代；另外，通过观察诱变后代的可视表型，发现在100μg/mLMNU诱导家蚕第5天蛹的M2代中有一编号为M18-21蛾区的家蚕在幼虫发育到三眠时出现1/4致死现象，且M3代仍呈1/4致死，推测该突变体是MNU诱变产生的隐性致死突变。(2)应用改进后的家蚕基因组DNA提取方法，提取到815个M1代基因组DNA样品；将这些样品排列于96孔微量板上，以单向构池法构建了2个可供TILLING检测筛选的4×DNA池，为家蚕TILLING技术的应用奠定了基础。(3)对家蚕TILLING检测体系中PCR模板量和酶切反应体系进行了优化，结果表明：家蚕TILLING检测过程中用于PCR模板的基因组DNA最适用量为～20ng；用CELⅠ酶切消化异源双链核酸分子时最适孵育时间为15min，最佳酶用量为每20μL反应体系中加入0.5μL本实验室提取的CELⅠ酶的10倍稀释液。(4)以丝素基因fib-l和P25为研究对象，初步应用TILLING技术对815个家蚕MNU诱变个体进行检测，其中对fib-l基因检测的碱基数量共计约为810kb，初步筛选到1个突变样C3-2和1个突变体M18-21；对P25基因检测的碱基数量共计约为1500kb，目前暂未检测到突变样。测序结果显示，在样品M18-21中，扩增子Fib-L-C的第107bp处有T和C两个信号的杂合峰，认为是碱基转换突变，即T＞T/C；由于该位点位于内含子区，不会影响编码氨基酸序列；且该突变位点与TILLING凝胶图片中酶切片段大小反映出的信息基本相符。而突变样C3-2中的具体突变个体和突变情况还有待进一步检测和验证。这些结果表明TILLING技术在家蚕中的应用是可行的。综上所述，本研究首先建立了一个MNU诱导家蚕突变库，为TILLING技术在家蚕基因突变体筛选中提供了材料；同时，优化了家蚕TILLING技术的检测体系，为该技术进一步应用奠定了基础；另外，初步应用该技术对丝素基因突变体进行检测并测序验证，获得了1个化学诱导突变体。通过本研究，我们相信TILLING技术将为家蚕功能基因组研究提供更多有效的化学诱导突变体材料，从而推动家蚕基因功能的研究，促进蚕业科学的发展。收起

关键词 : 家蚕 TILLING 优化丝素基因突变体筛选初步

4. 家蚕后部丝腺特异表达丝素重链相似蛋白基因Hp1对丝腺发育的影响机制

[学位论文] 梁馨尹苏州大学 2021年硕士导师: 徐世清共112页

摘要 : 家蚕(Bombyxmori)是中国特色的畜牧化养殖昆虫，也是重要的无脊椎模式动物，鳞翅目模式昆虫。家蚕丝腺作为高度特化的专一性合成和分泌丝蛋白的器官，其卓越的蛋白质合成与分泌调控机制是一个引人入胜，而又扑朔迷离、备受行业关注的研究课题。 ... 展开家蚕(Bombyxmori)是中国特色的畜牧化养殖昆虫，也是重要的无脊椎模式动物，鳞翅目模式昆虫。家蚕丝腺作为高度特化的专一性合成和分泌丝蛋白的器官，其卓越的蛋白质合成与分泌调控机制是一个引人入胜，而又扑朔迷离、备受行业关注的研究课题。本文利用实验室创制的后部丝腺(PSG)特异表达丝素重链(Fib-H)相似蛋白编码序列Hpl的突变体TBH资源，聚焦TBH家蚕低龄幼虫丝腺细胞的蛋白质合成能力和胚胎期丝腺细胞发育变化和相关调控机制，进一步解释了TBH代表的丝腺转基因家蚕普遍出现的丝腺发育和功能影响的机制。主要结果如下: (1)转基因后部丝腺特异表达Hpl基因影响幼虫丝蛋白合成与分泌通过转基因技术在正常泌丝的家蚕N4品种PSG组织特异表达Hpl的突变体TBH家蚕，成熟幼虫无法正常结茧。突变体在丝蛋白质旺盛合成的整个5龄幼虫期，PSG细胞中虽然外源蛋白基因(Hpl)转录水平极低，但除摇摆期的BmFib-H基因和5L3d的BmP25基因转录水平下调以外，内源丝素蛋白Fib-H、Fib-L和P25的基因转录水平在5龄前期和中期较野生型都显著上调;另一方面，丝素蛋白酶基因BmBcp及其抑制因子BmBcpi转录水平显著上调。显示TBH的PSG细胞中，丝素蛋白质合成水平上调的同时触发了蛋白降解水平显著升高。 (2)转基因后部丝腺特异表达Hpl基因影响胚胎期丝腺细胞发生和幼虫期丝腺细胞发育突变体TBH家蚕，在整个幼虫期中部丝腺(MSG)发育正常，但PSG发育异常，其长度显著短于野生型，并出现大量结节和扭曲。丝腺细胞膜绿色荧光探针DiO和细胞核DAPI染色结果显示，5龄后期TBH家蚕的PSG细胞核在结节膨大处密集，在弯折凹陷处稀疏，细胞核分枝极度不匀，在膨大扭曲处挤压导致细胞膜受力不均出现破裂，这种变化从3龄至5龄幼虫期，伴随PSG细胞的核内分裂的进行和细胞核分枝加剧而不断加重。家蚕的丝腺发生起始于胚胎发育中期、完成于胚胎发育后期，丝腺细胞数量在幼虫期不再增加。在刚孵化的幼虫(蚁蚕)体内，TBH家蚕的丝腺细胞核形态与WT家蚕都没有明显区别，但PSG细胞数量显著少于野生型，2龄开始PSG细胞排列混乱，形态不规则。表明转基因PSG表达Hpl基因显著影响了早期丝腺细胞的发育。在TBH家蚕的胚胎中，虽然检测不到痕迹量的外源Hpl基因的mRNA，但在丝腺发生早期(戊3)、丝腺细胞有丝分裂增殖期(己3)和丝腺成型期(己5)的胚胎中，后部丝腺特异表达的BmFib.H与BmFib.L基因转录水平与野生型相比出现显著变化，细胞周期基因BmCyclinB与BmCyclin3转录水平在3个调查时期较野生型一直显著上调。转录组学分析显示，PSG特异表达Hpl基因，抑制了糖代谢调控基因表达，减弱了信号转导Wnt途径基因转录水平，影响了细胞分化和细胞周期、蛋白质转运和分泌相关基因表达。本文的研究结论是，TBH家蚕PSG畸形的发育机制，与胚胎期丝腺组织发生开始至整个幼虫期的丝素蛋白基因转录水平异常，细胞周期调控压力增大，Wnt信号途径和糖代谢途径相关基因转录水平下调所致信号减弱有关。直接表现为胚胎期PSG细胞增殖变慢、细胞数量减少，幼虫期PSG细胞核内有丝分裂增殖减缓、细胞核分布异常。收起

关键词 : 家蚕转基因突变体丝腺发育丝蛋白

5. 家蚕2龄不眠蚕突变关键基因的功能分析

[学位论文] 毕思敏江苏科技大学 2019年硕士导师: 赵巧玲共95页

摘要 : 家蚕（Bombyx mori）是一种重要的经济昆虫，属于鳞翅目完全变态昆虫，常作为鳞翅目昆虫的模式生物用于相关基础研究。家蚕入眠蜕皮是其生长、发育、变态的重要生理过程之一，是在其长期进化中形成的遗传特性。本课题研究对象是一种2龄不眠蚕（non-mo... 展开家蚕（Bombyx mori）是一种重要的经济昆虫，属于鳞翅目完全变态昆虫，常作为鳞翅目昆虫的模式生物用于相关基础研究。家蚕入眠蜕皮是其生长、发育、变态的重要生理过程之一，是在其长期进化中形成的遗传特性。本课题研究对象是一种2龄不眠蚕（non-molting in the2ndinstar，nm2）突变体，突变体大多数表现为2龄末期不入眠、不蜕皮、极少进食，维持此状态一周左右后相继死亡。前期研究已经确定BmCPG10是引起nm2突变的主效基因。本研究在前期的研究基础上，利用CRISPR/Cas9技术、数字基因表达谱（Digital Gene Expression，DGE）以及双向电泳技术对BmCPG10基因及相关基因的功能进行更为系统、详细的分析，以阐述该突变体发生的分子机制。主要研究结果如下：第一，利用CRISPR/Cas9编辑技术对BmCPG10基因的功能进行分析。在BmCPG10基因的1号外显子上选取合适的靶位点体外合成sgRNA，与Cas9蛋白混合注射到家蚕的早期胚胎中，经检测，有2头蚕在靶位点均出现4个碱基的缺失，其中一头蚕在2龄末期死亡，另一头为雄性蚕，正常发育并化蛾，该雄蛾与正常野生型雌蛾交配，所产卵多为不受精卵，暗示BmCPG10功能丧失不仅影响家蚕的生长发育，可能还会导致精子活性降低。BmCPG10基因在这两头发生编辑的蚕中均上调表达，与自然突变体nm2中BmCPG10的表达趋势一致。第二，利用DGE和qRT-PCR分析了nm2突变体和突变体原品种C603的2龄将眠蚕头部相关基因的表达情况。结果发现，在nm2突变体中，蜕皮激素信号通路上的相关基因差异显著，其中neverland、spook、sad显著上调表达，CYP314A1及CYP18A1显著下调表达；部分表皮蛋白基因差异显著，且上调表达的表皮蛋白基因多于下调表达的表皮蛋白基因；蜕皮激素介导的信号通路上的核受体基因也有表达上的差异，其中关键核受体基因βFTZ-F1显著上调表达，早晚期基因HR3和HR4显著下调表达，其他核受体基因均无显著变化。第三，以nm2突变体和C603野生型家蚕2龄将眠蚕包含第一对气管丛的前胸腺（PGW）为材料进行双向电泳（2-DE）分析。发现其中一个表皮蛋白基因BmCPR41在nm2突变体中显著上调，qRT-PCR在mRNA水平的检测结果与蛋白质水平一致，而且与表达谱研究结果一致。进一步分析发现BmCPR41基因在两头发生编辑的蚕中与BmCPG10基因同步上调表达。基于上述结果，我们推测BmCPR41基因虽然不是引起家蚕nm2突变体的主效基因，但它可能与BmCPG10基因协同作用，参与了nm2突变体的形成。通过上述分析，我们进一步明确了引起nm2突变性状的主效基因是BmCPG10基因，并证实了BmCPG10基因通过蜕皮激素信号通路调控家蚕生长发育的生理功能。同时又发现了一个蜕皮激素信号通路的下游基因，表皮蛋白基因BmCPR41可能与BmCPG10基因协同作用，引起nm2突变性状。本研究为进一步阐述nm2突变体的形成机制提供了证据，同时也有助于深入了解蜕皮激素在家蚕生长发育过程中的调控机制。收起

关键词 : 家蚕 2龄不眠蚕突变体基因功能

6. 家蚕迷你(mini)突变体突变基因的精细定位分析

[学位论文] 高梦杰江苏科技大学 2021年硕士导师: 赵巧玲共89页

摘要 : 家蚕作为完全变态昆虫，其幼虫期的生长发育关乎整个世代的延续。家蚕迷你突变体（mini）是从家蚕品系S8V中发现的一种发育迟缓且纯合致死的突变体。本课题在对mini突变体进行遗传学分析的基础上，利用图位克隆技术对突变基因进行定位分析并构建遗传连... 展开家蚕作为完全变态昆虫，其幼虫期的生长发育关乎整个世代的延续。家蚕迷你突变体（mini）是从家蚕品系S8V中发现的一种发育迟缓且纯合致死的突变体。本课题在对mini突变体进行遗传学分析的基础上，利用图位克隆技术对突变基因进行定位分析并构建遗传连锁图谱，借助实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析候选基因在不同发育时期的表达水平并对候选基因的结构进行克隆测序，以确定引起突变性状的关键基因。同时结合RNAi技术和转录组测序分析结果筛选出参与调控mini突变体的相关基因及其所行使的功能。本课题研究结果为深入认识和了解家蚕mini突变体的形成机制奠定了基础，也为进一步探明家蚕生长发育中相关信号通路影响机制提供理论依据。主要研究结果如下：第一、家蚕mini突变体的表型特征和遗传模式分析。mini突变体的体型显著小于同龄期野生型家蚕，发育至2龄便可与正常体型家蚕区分开来，发育至4龄时体型与正常2龄相似且4龄后陆续死亡。该突变体孵化后约20天体型差异达到最大，野生型家蚕的体重约是mini突变体的60.13倍，体长约是突变体的3.71倍。通过调查不同蛾区发现正常个体与突变个体的分离比约为3:1，表明该突变性状由1个可遗传的隐性基因控制且表现为纯合致死。第二、2龄48h的mini突变体与野生型（S8V）中差异表达基因的筛选鉴定。通过对2龄48h的野生型和突变体家蚕进行转录组测序分析，共筛选出2944个差异表达基因，其中包括1638个上调表达基因和1306个下调表达基因。Pathway分析结果表明上述基因主要集中在代谢通路及脂肪酸代谢通路中。进一步对通路基因分析发现有些酶类基因、保幼激素及蜕皮激素等生长代谢相关基因的相对表达量也存在差异。第三、对mini突变体突变基因的连锁分析及精细定位。利用2个亲本及F1代对家蚕28条染色体上的多态性分子标记进行筛选，利用21个BC1F回交个体（表现为野生型表型和突变表型）确定了mini突变基因位于家蚕第2连锁群。通过对423个BC1M回交个体（表现为突变表型）进行精细定位将mini突变基因定位在分子标记Nscaf2623-SNP301和Nscaf2623-290之间，其中包含5个候选基因（基于NCBI数据库），分别为101742339、101742200、101746751、101742051和101746611。第四、mini突变体候选基因的表达分析和结构分析。通过qRT-PCR技术对获得的5个候选基因进行相对表达量分析，与野生型相比，101742200、101746751、101742051和101746611基因在2龄期mini突变体中的相对表达量差异极显著；101742339、101742200和101742051基因在4龄期mini突变体中的相对表达量差异极显著。对上述候选基因序列CDS区扩增结果发现，101742200、101746751、101742051和101746611基因在突变体与野生型中未发生碱基序列改变；而101742339在mini突变体的CDS序列上存在12个碱基的缺失，造成转录过程中4个氨基酸的缺失。该基因编码ATP依赖型金属蛋白酶（YME1），推测其与家蚕自身能量代谢密切相关，因此我们推断引起mini突变体形成的关键基因为YME1。第五、RNAinterference（RNAi）验证突变体关键基因。借助RNAi技术对YME1基因进行敲降，结果表明与对照组相比，处理组家蚕生长发育迟缓，体重显著降低。与此同时，对YME1基因及凋亡通路相关基因IAP1,Caspase1,Bmtrt基因进行相对表达量分析发现，这些基因的相对表达量均呈现出表达差异。综上所述，我们初步推测mini突变体的产生可能是由于YME1基因的突变，使线粒体功能受损，促使细胞凋亡加剧，导致了家蚕生理活动代谢异常，从而造成mini突变体发育迟缓并在4龄后逐渐死亡。本课题相关研究结果为阐明mini突变体形成的分子机制奠定了基础，也为防治鳞翅目农林虫害提供了新的靶标基因。收起

关键词 : 家蚕 mini突变体转录组测序图位克隆 YME1

7. 家蚕Sel突变体候补基因筛选及BmADAR的选择性拼接研究

[学位论文] 龚美霞安徽农业大学 2015年硕士导师: 孟艳共62页

摘要 : 家蚕（Bombyx mori）是鳞翅目（Lepidoptera）模式昆虫，遗传背景清晰。目前为止，已经被鉴定的家蚕突变体超过600种，其中有200多种被定位于28个连锁群上。对家蚕体色突变体的研究不仅有助于了解鳞翅目昆虫色素代谢的相关基因及调控网络，还能为相关... 展开家蚕（Bombyx mori）是鳞翅目（Lepidoptera）模式昆虫，遗传背景清晰。目前为止，已经被鉴定的家蚕突变体超过600种，其中有200多种被定位于28个连锁群上。对家蚕体色突变体的研究不仅有助于了解鳞翅目昆虫色素代谢的相关基因及调控网络，还能为相关功能基因的利用提供新思路。Sel是家蚕黄浮黄体色突变体，位于24-0.0座位，幼虫期体色呈现黄色。此前的研究结果表明，Sel突变体中的墨蝶呤脱氨酶活性高于正常家蚕，且体内积累的墨蝶呤脱氨产物亦高于正常家蚕；Sel初步定位的位点与SSR分子标记S2404的遗传距离为12 cM。至今，Sel的分子实质尚未得到分离鉴定，人们对Sel所参与的调控昆虫色素合成及体色模式形成的分子机制的认识非常有限。本文根据对家蚕遗传连锁图谱的分析，结合候补基因的功能与Sel突变体的表型相关性，以家蚕鸟苷三磷酸环化水解酶（GTP Cyclohydrolase I，GTPCH I）基因、胆色素原脱氨酶（Porphobilinogen deaminase，PBGD）基因、以及RNA编辑酶--腺苷脱氨酶（Adenosine deaminase acting on RNA，ADAR）基因为Sel候补基因，在野生型和突变型家蚕中分别进行基因克隆、序列比对和表达模式分析，并对 BmADAR的选择性拼接进行研究，鉴定了不同转录本的表达谱特征和可能的自我编辑位点。本文主要获得如下研究结果：（1）基因克隆及序列分析表明BmGTPCHIa和BmGTPCHIb编码的氨基酸序列在p50和U12（Sel/+）之间均没有差异。不同发育阶段BmGTPCHIb的表达模式在两品系间基本一致，组织表达模式的差异主要在马氏管。BmGTPCHIb在Sel突变体的马氏管不表达，与p50之间存在显著差异，该基因在马氏管的功能是否影响Sel突变表型的形成尚需进一步研究探明。（2）基因克隆及序列分析表明BmPBGD编码的氨基酸序列在p50和U12（Sel/+）之间有4个氨基酸位点差异，但F2代分离个体的测序结果表明该4个位点并没有与Sel连锁。p50和U12（Sel/+）的BmPBGD在不同发育时期的表达模式基本相同，然而，该基因5龄幼虫不同组织的表达模式在两品系之间多处存在明显差异。Sel突变体在头部较高表达BmPBGD是否为该突变体内脱氨酶活性高于正常蚕的原因尚待深入研究。（3）利用RT-PCR和RACE首次全面克隆并获得了BmADAR的多种转录类型，成功获得了2个具有完整ORF序列的转录本和4个没有终止密码子的转录本，分别编码氨基端或羧基端各有差异的6种亚型。4个没有终止密码子的转录本的共同特征是在终止密码子TAG处发生了A-to-I的自我编辑。2个具有完整ORF的转录本的基因结构分析说明，BmADAR mRNA在成熟的过程中发生了选择性拼接。时空表达模式结果表明，家蚕主要表达BmADARa亚型。（4）家蚕基因组数据库信息的查询结果显示，BmADARa由19个外显子、18个内含子构成，编码717 aa。同源序列比对及保守性分析表明，BmADARa和果蝇等昆虫 ADAR一样，属于脊椎动物 ADAR2的同系物。据报道利用原核表达系统表达纯化的ADAR不具有酶活性。为了研究BmADARa的酶活性特点，我们进行了该酶蛋白的原核表达研究，有助于今后对该酶进行大量表达、纯化和鉴定体外酶活特性。综上，BmADAR在Sel突变体里的基因转录表达模式有待于进一步研究鉴定，目前尚不能排除BmGTPCH、BmPBGD以及BmADAR与Sel之间存在相关性。因为非翻译区的突变，特别是启动子的活性区域的变化，也可能引起基因功能发生异常导致突变体表型的产生。为了确定Sel的基因本质，今后可以通过定位克隆技术对其进行精细定位，从染色体图位上锁定候补基因。本文在BmADAR研究方面取得的结果对于深入解析家蚕BmADAR的A-to-I RNA编辑机制及其与靶标基因dsRNA的相互作用机理提供了必要的理论研究基础。收起

关键词 : Sel突变体家蚕候补基因选择性拼接

8. 家蚕淡墨突变体的基因定位克隆及功能研究

[学位论文] 吴松原西南大学 2016年博士导师: 代方银共128页

摘要 : 地球上已被描述和记录的物种大约有200万种，其中昆虫约占53%。昆虫以其强大的适应能力，遍布各地。家蚕（Bombyx mori）是重要的经济昆虫，在大约5000年前由中国野桑蚕（Bombyx mandarina）驯化而来，也是实验遗传学的经典材料。近年来，随着家蚕基础... 展开地球上已被描述和记录的物种大约有200万种，其中昆虫约占53%。昆虫以其强大的适应能力，遍布各地。家蚕（Bombyx mori）是重要的经济昆虫，在大约5000年前由中国野桑蚕（Bombyx mandarina）驯化而来，也是实验遗传学的经典材料。近年来，随着家蚕基础研究的系统化发展和越来越多的生物学关注，家蚕被认为是一种新兴的模式动物，在基础研究、生物反应器、鳞翅目害虫防治及医学模型等研究领域具有重要意义。 1941年日本学者首次报道了一种自然发生的家蚕突变体，淡墨（black dilute， bd），其幼虫表皮显著黑化，雌蛾不妊，表现为隐性的孟德尔遗传，被定位于家蚕经典连锁图谱的第9连锁群22.9cM处，该突变体现被保存于日本和中国。昆虫的体色和斑纹是其最为显著的形态特征之一，其着色机制研究具有重要的生态学意义，并已有良好的研究基础；同时，着色在种群中极易分化，是进化生物学研究的优秀模型。生殖发育是昆虫繁衍和扩张的重要基础，有性的繁殖方式能带给生物更多的演化机会，研究其生殖相关的分子机制能够推动对遗传分化发育的理解。家蚕淡墨（bd）突变兼具显著的着色模式改变和生殖障碍表型，对其突变基因及其分子作用的解析既有利于昆虫着色机制研究，同时也为鳞翅目害虫防控提供潜在的靶标。本研究利用分子定位锁定淡墨突变位点在基因组上的范围，结合基因功能注释、基因芯片分析、基因表达差异分析、克隆测序分析等方法确定其候选基因，利用RNAi、过表达和基因敲除等手段鉴定候选基因的功能。并比较分析了淡墨突变与野生型幼虫体壁的转录组，寻找Bmbd基因的可能下游靶基因，综合分析淡墨突变发生的分子机制。本论文主要的结果有： 1. bd突变体表型特征分析比较野生型品系大造、淡墨纯合体（bd/bd）、淡墨杂合体（+/bd）和可育淡墨（bdf/bdf）幼虫的着色模式。淡墨纯合体幼虫表皮显著黑化，斑纹处颜色加深；bdf幼虫着色模式与bd类似，只是颜色较浅。蛹期和蛾期bd体色与对照并没有明显的差别。淡墨纯合体成虫翅膀皱缩，不能顺利伸展，活动能力偏低，雄蛾交配能力弱，交配后的雌蛾产卵不能正常着色形似未受精卵。淡墨杂合体（+/bd）和bdf成虫翅膀正常，行为协调，雄蛾能够独立寻找雌蛾交配，雌蛾产卵能正常着色并发育。解剖未交配的淡墨雌蛾，观察内部生殖器，发现其卵巢各结构完整，但整体偏小，卵不整齐。经过电镜扫描发现，淡墨卵的花瓣体结构和卵孔异常。经过孤雌生殖实验，发现淡墨突变体的卵存在发育缺陷。 2. bd位点的分子定位因为淡墨（bd）雌表现为不育性，我们选择其等位点突变体可育淡墨（bdf）作为突变亲本，大造N作为正常亲本，两者杂交产生F1。用F1的雌回交bdf的雄配制连锁群体，用F1的雄回交bdf的雌配置定位群体。选取属于第9连锁群的SSR分子标记引物，并根据基因组数据设计相应的引物，在亲本基因组间进行多态筛选，利用多态标记对 bd位点进行连锁分析，采用连锁的标记在1162个个体构成的重组分析群体中对淡墨位点进行定位分析。将淡墨位点锁定在家蚕第9染色体大约600Kb的区域内，该区域存在11个预测基因。 3.候选基因筛查分析将11个预测基因的编码序列与NCBI的非冗余蛋白库（nr）进行比对，对其进行功能注释。利用家蚕基因芯片数据分析11个预测基因在家蚕5龄3天各组织和4龄到5龄幼虫的时空表达模式。结合基因功能、表达模式与突变性状进行关联分析，通过半定量PCR比较大造、淡墨杂合体以及淡墨纯合体中定位区域内的预测基因在转录水平的差异。发现can8基因在淡墨纯合体中几乎不表达，杂合体中表达水平大约为野生型的一半。而其他预测基因在三者之间无明显的差异。所以，我们将can8作为重点候选基因进行进一步研究。 4. bd突变候选基因的克隆与序列分析我们在野生型大造和bdf中克隆了can8基因的cDNA序列，发现 can8基因与nscaf3045上相邻的预测基因can9为一个基因，且该基因至今没有明确的功能注释，将其命名为Bmbd，其编码BTB-ZF蛋白。通过序列分析，检测到该基因存在两种不同的开放阅读框，其差异为羧基端锌指功能域不同，可能结合不同的DNA序列。通过序列比对，比较了bdf与野生型中cDNA的序列，发现仅存在几个单碱基的突变，其预测蛋白质的高级结构并没有明显的差异。通过基因组DNA克隆发现，在bd中Bmbd基因从第二内含子到转录上游存在大约160 Kb的缺失，并插入一段3.6 Kb的序列，该缺失和插入造成Bmbd基因完全沉默，同时疑似产生了一个新基因，编码钾离子依赖的钠/钙离子通道蛋白，将其命名为 BmNCKX4-like基因，其功能有待研究。通过BLAST程序，在昆虫中对Bmbd基因进行同源搜索，并进行系统发生分析，发现该基因在许多物种中都存在同源基因，在鳞翅目中非常保守。 5.野生型中Bmbd基因的表达模式分析在野生型大造4龄刚眠的各组织的RNA模板中进行荧光定量检测Bmbd基因的表达情况，发现其在各组织中均有不同程度的表达，在头、表皮、生殖腺和丝腺等有较高的表达，在血液中表达水平较低。同时，在大造品系中调查了 Bmbd从蚁蚕到蛾一天的时期表达模式，发现其呈波动表达，在每龄刚眠有上调表达，在食桑期有中度的表达。这一表达模式，与家蚕幼虫蜕皮及新表皮着色具有一致性。 6. Bmbd基因的RNAi 设计并合成了Bmbd基因的3条siRNA。取野生型Nis品系幼虫，在4龄2天， Bmbd基因上调前一天，将3条siRNA混合注入其血淋巴，并及时进行电穿孔诱导。之后，用桑叶在25℃，75%的相对湿度小心饲养。在5龄一天，观察幼虫皮肤表型，发现存在大约47%的注射幼虫在电击正极一侧出现表皮黑化现象。进行分子检测发现，黑化皮肤部分的Bmbd基因表达量被显著降低。 7. Bmbd基因的过表达克隆了Bmbd基因的两种ORF框，并将其重组入含有绿色荧光蛋白的表达载体中，基因与绿色荧光蛋白由A3启动子启动。将载体与piggybac助质粒混合使其终浓度为1μg/μL，经腹部气门注入到淡墨2龄幼虫的血淋巴中，并及时进行电穿孔诱导。在5龄时观察幼虫表皮，发现有部分幼虫在电击正极一侧出现白色斑块，在荧光显微镜下观察白色区域存在绿色荧光蛋白的表达。结合干涉实验结果，初步说明Bmbd基因参与调控家蚕的体壁着色。 8. Bmbd基因的敲除我们设计并合成了Bmbd基因的特异gRNA，并合成Cas9核酸内切酶的RNA，进行混合。选野生型N4品系的卵，在产卵1~4小时期间，显微注射大约10 nL的混合RNA，并用生物粘合剂封住针口。在25℃，相对湿度85%的条件下进行催青孵化。在其后代中，观察表型。结果显示，在子代群体中存在体壁偏黑表型的个体。 9. RNA-seq 通过功能分析，验证了Bmbd基因，作为一个转录因子蛋白，其表达能够抑制着色，缺乏时幼虫显著黑化。为了研究其调控体色机制，根据该基因在刚眠时高表达，我们取了大造、淡墨纯合体（bd/bd）和淡墨杂合体（+/bd）4龄刚眠幼虫的体壁，进行RNA测序。分析在该时期转录的基因，并比较三个转录组数据的差异。在三个品系中存在31个共同差异基因，包括候选基因Bmbd，还有15个表皮蛋白（cuticular protein）基因，在黑化淡墨突变中这15个表皮蛋白基因显著上调表达。表皮蛋白是表皮的主要组分之一，在家蚕中鉴定了200多个表皮蛋白基因。在柑橘凤蝶幼虫体壁中发现，表皮蛋白存在斑纹特异性，暗示色素在掺入表皮中时与表皮蛋白可能发生特异结合。本研究发现的15个在黑化表皮中高表达的表皮蛋白基因可能是家蚕幼虫黑化所必须的，推测表皮蛋白基因参与表皮着色，这为昆虫着色提供了新的研究内容。本研究定位克隆了家蚕淡墨突变体的负责基因Bmbd，验证了它抑制黑化的功能，并通过转录组比较分析、荧光定量分析，推测该基因可抑制漆酶基因laccase2，以及影响表皮蛋白基因的表达，对着色模式进行调控。同时，淡墨突变存在严重的生殖缺陷，我们发现在家蚕淡墨突变体中，与果蝇 ovo直系同源的基因BGIBMGA000988转录水平显著下调，ovo是卵发育关键基因，推测该基因可能与淡墨雌不育有关。本文通过家蚕bd突变体的研究，揭示了一个与鳞翅目幼虫着色模式和生殖发育相关的新基因。鳞翅目昆虫中普遍存在其保守的同源基因，结合对幼虫体色的调控和对生殖发育的影响，家蚕淡墨可望作为鳞翅目害虫防控研究的潜在模型，有待进一步挖掘其利用价值。收起

关键词 : 家蚕淡墨突变体定位克隆基因功能着色调控

9. 家蚕新突变体褐色类鹑斑q-lb的遗传分析及基因定位

[学位论文] 王文波江苏科技大学 2014年硕士导师: 赵巧玲共112页

摘要 : 家蚕遗传资源十分丰富，是一种重要的模式生物群体，而家蚕皮肤表面积累的色素则形成了诸多的类型，为科研提供了新的材料和研究方向。在培育过程中，在0223金黄品种中发现了一种类似于鹑斑的褐色类鹑斑突变体(q-lb)，其幼蚕期体色呈褐色，因此对该突... 展开家蚕遗传资源十分丰富，是一种重要的模式生物群体，而家蚕皮肤表面积累的色素则形成了诸多的类型，为科研提供了新的材料和研究方向。在培育过程中，在0223金黄品种中发现了一种类似于鹑斑的褐色类鹑斑突变体(q-lb)，其幼蚕期体色呈褐色，因此对该突变体进行研究分析对探究色素调节途径具有重要的理论和现实意义。本研究主要包含以下个方面：一、突变体q-lb的经典遗传学分析将褐色类鹑斑(q-lb)与正常型素斑进行杂交，F1代在正反交中表型均是正常型，F2代出现正常型和褐色类鹑斑两种表型，其分离比为3:1，正反交F1代回交正常型个体，回交后代均表现为正常型；正反交F1代回交褐色类鹑斑，回交后代中出现正常型和褐色类鹑斑两种表型，其分离比为1:1，证明了褐色类鹑斑由1个隐性基因q-lb控制，并且非伴性遗传。用第2、3、4、5、6、7、9、12、13、14、16、18、19、21、26连锁群中的形态标记检测，通过配制F1和F2群体，无论正反交，F1均未分离，且无褐色类鹑斑出现。F2出现分离，q除了第7连锁群外，其余的连锁群都出现了9:3:3:1分离比。而第7连锁群用的是鹑斑（q）作为形态标记，由于突变体斑纹与鹑斑极其类似，肉眼无法分辨，出现非鹑斑（素斑112头）与鹑斑（鹑斑或类鹑斑共86头）的分离比为9:7。此现象类似于非等位基因间的互作关系，褐色类鹑斑与鹑斑有“互补关系”(complementary genes)。在此可以确定尽管褐色类鹑斑与鹑斑表型相似，但为非等位基因。上述说明突变基因不在这些连锁群上。二、q-lb基因的连锁分析及精细定位在其他连锁群上，用P1、F1和P2来筛选具有多态性的SSR标记；BC1F群体用来确定q-lb基因所在的连锁群；275个BC1M个体用来对q-lb基因进行定位分析。结果显示，q-lb基因位于第8连锁群上，根据电泳观察筛选出20个与突变基因连锁的多态性SSR标记，最终将q-lb基因定位在S2828-30与S2828-37两个多态性标记之间，相距230kb，用Map maker绘制出q-lb基因的分子标记连锁图。所得到的q-lb基因的连锁图的遗传距离为17.7cM。三、候选基因的分析在定位分析的基础上，通过分析两个标记之间的18基因在家蚕表皮和脂肪体中半定量的结果，发现其中16个基因表达无差异，而其余两个基因中BGIBMGA005383因 cDNA太短，未能设计出半定量引物；BGIBMGA005418则是开放阅读框（ORF）未能成功克隆，其功能都与生长发育相关。为了确定是否是突变基因，则需要进一步研究证实该基因及其突变位点。四、类鹑斑突变体q-lb表皮组织差异蛋白质谱分析我们通过双向电泳技术对正常型0223金黄及突变体q-lb的表皮组织进行蛋白质组学分析，结果发现BGIBMGA007789基因编码的Bmrunt蛋白出现两个差异点，其中一个在正常型中表达量高，而在突变体q-lb中表达量低，另一个在正常型中表达量低，而在突变体中表达量高；BGIBMGA008906基因编码的Bmcryptochrome2蛋白在正常型中表达量低甚至不表达，而在突变体q-lb中表达量高。随即对BGIBMGA007789和BGIBMGA008906这两个基因的外显子分别进行克隆，比对发现引起蛋白差异的这两个基因未发生突变。综上所述，正常型与突变体q-lb表皮之间出现的蛋白差异并非由于编码该蛋白的基因发生突变引起的。这两个差异蛋白都是与生长发育相关的蛋白，而表皮斑纹的突变是在蚕体发育过程中发生的，推测与这两个差异蛋白有直接或间接的关系。收起

关键词 : 家蚕褐色类鹑斑突变体遗传分析基因定位

10. 家蚕淡红卵突变体(rep-1)的精细定位及其候选基因的功能分析

[学位论文] 吴美娜江苏科技大学 2020年硕士导师: 赵巧玲共96页

摘要 : 家蚕(Bombyx mori)是一类重要的经济类昆虫，生长周期短、繁殖率高，是鳞翅目昆虫研究的模式生物。正常家蚕卵在产下初期呈黄白色，最终转变为黑褐色。本团队前期发现一种新型淡红卵突变体(pale red egg, rep-1)，产卵初期呈黄白色，大约36h时卵色发生... 展开家蚕(Bombyx mori)是一类重要的经济类昆虫，生长周期短、繁殖率高，是鳞翅目昆虫研究的模式生物。正常家蚕卵在产下初期呈黄白色，最终转变为黑褐色。本团队前期发现一种新型淡红卵突变体(pale red egg, rep-1)，产卵初期呈黄白色，大约36h时卵色发生变化，最终转变为固有的淡红色。本研究以该突变体为研究对象，利用图位克隆技术对该突变体形成的相关基因进行精细定位，并分析候选基因的结构与功能；利用3′RACE技术获得定位区间内候选基因的3′UTR；通过RNA干涉(RNAi)和CRISPR/Cas基因编辑技术分析候选基因的功能，结合转录组测序(RNA-seq)技术分析突变体与野生型家蚕产卵后36h蚕卵的差异表达基因，为阐明rep-1突变体形成的分子机制奠定基础。主要研究结果如下： (1)rep-1突变体基因的精细定位。以P1(p50)、P2(rep-1)为亲本，构建F1、F2、BC1M和BC1F群体，其中BC1F群体用于连锁分析。利用SSR多态性分子标记将引起rep-1突变体突变性状的主效基因定位到家蚕第5连锁群，精细定位将突变基因定位于分子标记S2674-N53和分子标记S2674-N4之间，两标记之间的遗传距离为0.23cM，物理距离为88kb，基于SilkDB基因组数据库查询，发现定位区间内有三个候选基因，分别是BGIBMGA003693、BGIBMGA003500、BGIBMGA003501。 (2)rep-1突变体候选基因的结构分析。通过CDS测序，与野生型相比，突变体中3个基因的CDS未发生改变；电泳检测S2674-N53和S2674-N4之间的基因组序列，发现第7对引物电泳片段的大小具有差异，克隆测序发现在候选基因BGIBMGA003501和BGIBMGA003693之间出现52bp缺失，2个基因的编码区分别位于互补链上，缺失片段位于2个基因的3′端，初步排除候选基因BGIBMGA003500。利用3′RACE扩增获得了BGIBMGA003693的3′UTR，经多次重复并未克隆到BGIBMGA003501的3′UTR。引起rep-1突变体突变性状的主效基因需要进一步研究确认。 (3)rep-1突变体候选基因表达分析。综合定位分析的结果，初步筛选出2个候选基因BGIBMGA003501和BGIBMGA003693，以野生型C1(H)为对照，通过qRT-PCR技术分析结果显示，BGIBMGA003693在产卵后24-96h，表达量先增后减。野生型C1(H)在产卵48h后表达量达到峰值，而突变体rep-1在产卵后36h时BGIBMGA003693表达量最大。BGIBMGA003501的卵期表达谱显示其表达量亦表现出先增加后减少的趋势，野生型和突变型均在产卵后48h表达量到达峰值，前期突变型表达量极显著高于野生型。幼虫期BGIBMGA003693的组织表达谱显示其在野生型与突变型之间大部分组织中均存在表达差异，除在性腺中雌雄表达差异一致外，在表达量差异的组织中，雌雄个体表达差异相反，整体来说，在马氏管和中肠中的表达量较高。BGIBMGA003501的组织表达谱表明，其在很多组织中存在表达差异，其中大部分雌雄表达差异是一致的，与BGIBMGA003693相似，BGIBMGA003501整体在马氏管和中肠中的表达量较高。 (4)候选基因RNAi分析和CRISPR/Cas9基因编辑。对产下2h内的野生型蚕卵注射合成的siRNA，结果显示注射EGFPsiRNA的对照组蚕卵注射前后无变化，注射BGIBMGA003693基因siRNA后表型也无明显变化，而注射BGIBMGA003501基因siRNA的蚕卵颜色有变化，相较于对照组，出现了浅红色卵的表型，BGIBMGA003501表达量显著低于对照组。通过CRISPR/Cas9编辑技术对候选基因BGIBMGA003501和BGIBMGA003693进行基因敲除。BGIBMGA003501基因敲除获得2个阳性个体，经基因型鉴定，均为杂合体，后续将继续杂交培养至G2代获得纯合突变体，验证BGIBMGA003501的基因功能。BGIBMGA003693基因敲除未成功。 (5 )rep-1突变体和野生型C1(H)产后36h蚕卵的RNA-seq。通过对比RNA-seq结果，共鉴定到800个差异表达基因，其中相对于C1(H)，rep-1中有475个表达量下调，325个表达量上调，差异表达基因主要分布在家蚕生长发育相关和眼色素合成与代谢等通路上。以上研究结果为阐明淡红卵突变体rep-1的形成机制研究奠定了基础。收起

关键词 : 家蚕淡红卵突变体图位克隆 3&prime -RACE技术基因编辑