中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

1. 黄连素经Hsa-miR-411-3P作用于胃癌细胞的功能及机制研究

[学位论文] 陈雪艳广东药科大学 2020年硕士导师: 张巨峰共74页

摘要 : 目的:在胃癌细胞中加入黄连素后，Hsa-miR-411-3P是显著差异表达的miRNA之一，本研究探索Hsa-miR-411-3P对胃癌细胞的作用功能，预测Hsa-miR-411-3P的靶基因，并验证Hsa-miR-411-3P对其靶基因的调控作用，从而研究在胃癌细胞中黄连素的作用机制。 ... 展开目的:在胃癌细胞中加入黄连素后，Hsa-miR-411-3P是显著差异表达的miRNA之一，本研究探索Hsa-miR-411-3P对胃癌细胞的作用功能，预测Hsa-miR-411-3P的靶基因，并验证Hsa-miR-411-3P对其靶基因的调控作用，从而研究在胃癌细胞中黄连素的作用机制。方法:通过高通量测序的方法，对黄连素处理后的胃癌细胞SGC-7901进行miRNA测序和mRNA测序。分析miRNA测序结果，筛选出差异表达的miRNA：Hsa-miR-411-3P。miRBase、NCBI、UCSC等数据库查找差异表达miRNA的碱基序列、染色体定位、物种保守性等基本信息；miGatorv3.0数据库查看Hsa-miR-411-3P在人体中的分布情况；MTT方法检测Hsa-miR-411-3P对胃癌细胞SGC-7901、AGS增殖的影响；流式细胞术检测Hsa-miR-411-3P对SGC-7901、AGS细胞凋亡、细胞周期的影响；Transwell方法检测Hsa-miR-411-3P对胃癌细胞SGC-7901、AGS侵袭、迁移的影响。RNAhybrid2.1.2、Miranda3.3a、TargetScan7.03种在线工具预测Hsa-miR-411-3P靶基因，与mRNA测序结果联合分析，取交集基因认为是比较可靠的靶基因，然后进行蛋白质-蛋白质相互作用分析、GO分析、KEGG分析、cbioportal网站分析。RT-qPCR检测Hsa-miR-411-3P靶基因VAV3、ROCK2、PLD1、PTCH1的表达。结果:(1)miRNA测序结果中，Hsa-miR-411-3p在黄连素处理过的胃癌细胞中表达显著上调(差异倍数为256,P<0.05)。 (2)过表达Hsa-miR-411-3P可以抑制胃癌细胞SGC-7901、AGS增殖、侵袭、迁移，促进凋亡，使SGC-7901细胞周期阻滞于S期，AGS细胞周期阻滞于G1期。 (3)RNAhybrid2.1.2、Miranda3.3a、TargetScan7.03种在线工具预测结果结合mRNA测序结果分析，得到235个Hsa-miR-411-3P的靶基因。Hsa-miR-411-3P靶基因PPI分析得到5个核心基因：SLC2A3、ATP8B4、PLD1、HGSNAT、AP1M1。Hsa-miR-411-3P靶基因GO分析结果显示，Hsa-miR-411-3P的235个靶基因分子功能集中在酶结合、蛋白质结合、转移酶活性等(P＜0.05)；生物学过程集中在代谢过程、细胞组件组装、解剖结构发展、细胞成分生物发生等(P＜0.05)。KEGG分析结果中，Hsa-miR-411-3P靶基因KEGG信号通路集中在Insulin信号通路、cAMP信号通路、AMPK信号通路、FOXO信号通路等(P＜0.05)；Hsa-miR-411-3P靶基因VAV3、ROCK2、PLD1、PTCH1共同参与cAMP信号通路。测序结果中VAV3、ROCK2、PLD1、PTCH1可能与Hsa-miR-411-3P存在负调控关系。cBioportal网站分析结果显示，VAV3、ROCK2、PLD1、PTCH1在胃癌中有较高的突变率，导致其mRNA表达量改变。提示Hsa-miR-411-3P可能引起了其靶基因VAV3、ROCK2、PLD1、PTCH1的基因突变，导致这几个基因的mRNA表达量下调，从而作用cAMP信号通路，影响胃癌的发展进程。 (4)RT-qPCR结果显示，在过表达Hsa-miR-411-3P的胃癌细胞SGC-7901、AGS中，VAV3、ROCK2表达量均减少；PLD1在过表达Hsa-miR-411-3P的SGC-7901细胞中表达增加，在过表达Hsa-miR-411-3P的AGS细胞中表达减少；PTCH1在过表达Hsa-miR-411-3P的SGC-7901细胞中表达减少,在过表达Hsa-miR-411-3P的AGS细胞中表达增加；PLD1、PTCH1在SGC-7901细胞、AGS细胞这两种细胞中有不一样的表达，需要选取更多胃癌细胞进行研究。结论: Hsa-miR-411-3P可以下调靶基因VAV3、ROCK2的表达，作用于cAMP信号通路，抑制SGC-7901、AGS细胞增殖、迁移、侵袭，促进SGC-7901、AGS细胞凋亡，使SGC-7901细胞周期阻滞于S期，AGS细胞周期阻滞于G1期。收起

关键词 : 胃癌 Hsa-miR-411-3P miRNA

2. Hsa-miR-125a-3p和Hsa-miR-125a-5p对非小细胞肺癌侵袭转移的作用研究

[学位论文] 江黎黎中国医科大学 2010年博士导师: 邱雪杉共68页

摘要 : 前言 MicroKNA(miRNA)是近年来备受关注的一类普遍存在于动、植物中的非编码小RNA,大约20-24个核苷酸,来自于长的转录子前体pri-miRNA和pre-miRNA。MiRNA与其靶mRNA分子的3’端非编码区(3’-UTR)不完全互补结合,在多细胞生物体中,转录后调控基因... 展开前言 MicroKNA(miRNA)是近年来备受关注的一类普遍存在于动、植物中的非编码小RNA,大约20-24个核苷酸,来自于长的转录子前体pri-miRNA和pre-miRNA。MiRNA与其靶mRNA分子的3’端非编码区(3’-UTR)不完全互补结合,在多细胞生物体中,转录后调控基因的表达,影响着几乎所有的信号通路,参与多种生理病理过程,在肿瘤的发生和发展中也发挥了重要的调节作用。目前研究最为清楚的Ras相关单体GTP酶家族为Rho,Rac1和CDC42,它们参与细胞内多样的调节作用,包括细胞骨架的重构,细胞的迁移和侵袭。Rho相关的丝／苏蛋白激酶(Raho-associated serine／threonine protein kinase,Rock)是迄今为止功能研究最为清楚的Rho下游靶效应分子之一。活化的GTP-Rho可以和Rock相互作用而激活Rock。通过与Rho相互作用,Rock在肿瘤细胞的转移过程中参与调控细胞迁移和侵袭。肿瘤的侵袭和转移是世界上癌症患者死亡最常见的因为。最近,越来越多的研究报道表明,miRNA与肿瘤细胞的侵袭和转移有关,其调控肿瘤细胞侵袭和转移的作用机制成为miRNA研究领域的热点之一。在miRNA与Rho／Rock-1传导通路的关系中,Kong等人在鼠正常乳腺上皮细胞中发现,miR-155在TGF-β诱导的上皮间质转化以及RhoA引起的细胞迁移侵袭过程中具有重要作用。TWIST1能够诱导miR-10b,miR-10b通过直接转录后抑制HOXD10的表达来间接的增加RhoC的水平,从而影响了肿瘤细胞的迁移和侵袭。研究Rho和miRNAs之间的关系加强了miRNA在肿瘤形成中的重要性,并且为癌症转移的患者提供了新的治疗策略。 miR-125a是一种功能以及机制尚未研究清楚的miRNAs之一。Yanainhara等人发现miR-125a定位在19q13.41,并用miRNA芯片分析了104对肺癌组织以及相应的癌旁肺组织,发现与癌旁肺组织相比较,miR-125a在肺癌组织中下调表达。至目前为止,已发现的成熟体miR-125a家族有两个成员,即hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p。本研究目的旨在探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p的表达及其临床意义,分析hsa-miR-125a-3p和hsa-miR—125a-5p与NSCLC细胞系转移潜能的关系。并在细胞水平上,通过向肺癌细胞中转染正义和反义的2’-O-甲基寡核苷酸的方法,探讨增加hsa-miR-125a-3p和hsa-miR—125a-5p的表达以及下调hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p的表达对Rho／Rock1途径,以及肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响,为hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p可能是Rho／Rock1信号通路非常重要的调节因子提供依据。材料与方法 1、NSCLC组织标本 52例配对的非小细胞肺癌和癌旁肺组织(远离原发灶)标本均来自中国医科大学病理教研室。患者术前均未接受过任何化学或放射治疗。福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织切片常规进行HE染色,分别由两名病理论断医师,根绝WHO肺及肺膜肿瘤分类标准(2004)和TNM分期系统(1997),确定肿瘤的组织学分型以及临床病理分期。52例NSCLC包括:男性33例,女性29例；年龄40～78岁(平均58岁±9岁)；鳞癌22例,腺癌30例；病理分级,高分化8例,中分化28例,低分化16例；病理分期,Ⅰ期18例,Ⅱ期15例,Ⅲ期19例；淋巴结转移20例,无淋巴结转移32例。52例配对组织在液氮中快速冰冻,以后用于提取mRNA。常规病理检查手术切除的肺门、纵膈以及肺内淋巴结,用于确定肺癌的淋巴结转移情况。患者的临床病理参数包括性别,年龄,组织学类型,病理分级,病理分期,淋巴结转移,摘自患者的病历资料。 2、细胞培养冻存于液氮的A549细胞经复苏后,用DMEM培养液(含有10％新生牛血清,100u／ml的青霉素和100μg／ml的链霉素),在37℃,5％CO2饱和湿度条件下培养,经3次传代稳定后,进行转染。 3、细胞转染 2’-O-甲基寡核苷酸(2’-O-Me-sense-3p:5’-ACA GGU GAG GUU CUU GGGAGCC-3’2’-O—Me—antisense-3p:5’-GGC UCC CAA GAA CC U CAC CUGU-3’,2’-O-Me-scramble-3p:5’-GGU CGG UGC UCG AUG CAG GUAA-3’,2’-O—Me—sense-5p:5’-UCC CUG AGA CCC UUU AAC CUG UGA-3’,2’-O—Me-antisense-5p:5’-UCA CAG GUU AAA GGG UCU CAG GGA-3’,2’-O-Me—scramble-5p:5’-GGA CG G CGA UCA GAU AAG AGU UCU-3’.)用结合DNA技术合成(GeneChem,China)。用LipofetamineTM 2000(Invitrogen,USA)将20μM 2'-O-甲基寡核苷酸转染入6孔板中A549和SPC细胞中为RNA提取和transwell备用。untreated为未加任何处理因素的细胞,scramble为转染乱码序列2’-O-甲基寡核苷酸的细胞,sense为转染正义序列2’-O-甲基寡核苷酸的细胞,antisense为转染反义序列2’-O-甲基寡核苷酸的细胞。其中对照组细胞为(untreated和scramble)。 4、Real-time PCR 根据操作说明应用TaqMan MicroRNA试剂检测成熟体miRNA(AppliedBiosystems,USA)。所有的RT产物,在ABI Prism 7900HT序列检测系统中运行。用特异的RT引物和TaqMan探针定量检测hsa-miR-125a-3p(PN:4395310)和hsa-miR-125a-5p(PN:4395309),RNU6B(PN:4373381)和U18(PN:4380904)为内参。组织样本用2次独立样本经过2次独立实验,细胞样本用3次独立样本经过3次独立实验后得到的数据用公式RQ=2-ΔΔCt的方法进行分析。 5、RT-PCR TRIzol试剂提取总RNA,紫外分光光度计测定RNA纯度并定量,在1％甲醛变性凝胶电泳验证RNA完整性。RT-PCR采用两步法试剂盒(宝生物公司)按照厂家推荐步骤进行,扩增体系为20μl,以持家基因β-actin为内参照,对样品模板用量标准化。引物参照文献及使用Primer Designer5.0软件设计。RT条件按照厂家推荐,PCR条件:95℃ 1min,随后进行35个循环的94℃ 30s,55℃ 30s,72℃45s,最后72℃充分延伸10min；β-actin PCR条件:94℃5min,随后94℃ 40s,50℃ 40s,72℃ 40s共35个循环,最后72℃充分延伸5min。扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳,UVP图像处理系统采集图像,ImageJ灰度分析软件进行条带灰度分析。产物经1.75％琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统摄像,分析各条带强度。 6、Western blot检测提取各组织蛋白,根据蛋白的分子量制备不同浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶,每孔上样量50μg,常规电泳、转膜、封闭,一抗及相应二抗37℃孵育1h,DAB显色,β-actin作为内对照。UVP图像处理系统采集图像,ImageJ灰度分析软件进行条带灰度分析。以平均吸光度值INT和信号面积S的乘积代表信号强度。分别计算不同指标和β-actin的INT×S,用二者的比值显示不同指标的表达水平。 7、Transwell细胞迁移和侵袭实验在具有8μm小孔聚碳酸酯滤膜的培养小室上铺用预冷无血清培养基稀释的Matrigel基质胶,接种100μl无血清培养基稀释的A549细胞或NCI-H460细胞(5x105个／mL),下室加入600μl含10％血清的DMEM培养液或1640培养液,每组设6复孔。37℃、5％CO2条件下培养24h后,取出培养小室,用2.5％戊二醛固定15min,并以0.5％Triton X-100处理3min,苏木精中染核15min。将培养小室倒置,在光学显微镜(Leica,德国)下观察、照相,并计数每高倍视野滤膜底面的平均细胞数。细胞迁移实验在无Matrigel基质胶包被的Transwell小室中进行,方法同细胞侵袭实验。 8、统计学分析结论 1、hsa-miR-125a-3p与病理分期和淋巴结转移呈负相关,而hsa-miR-125a-5p与病理分期和淋巴结转移呈正相关。 2、hsa-miR-125a-3p能够通过RhoA／Rock1信号途径抑制肺癌细胞的迁移和侵袭。 3、hsa-miR-125a-5p能够通过RhoC／Rock1信号途径促进肺癌细胞的迁移和侵袭。收起

关键词 : 非小细胞肺癌侵袭转移 Hsa-miR-125a-3p Hsa-miR-125a-5p

3. Hsa-miR-515-5p对喉鳞状细胞癌迁移与侵袭及相关调控机制研究

[学位论文] 李梦璐第一临床医学院 2022年硕士导师: 张春明共69页

摘要 : 目的：探究hsa-miR-515-5p对喉鳞癌迁移和侵袭作用，以及靶向下游目的基因的相关调控机制。方法：使用Kaplan-MeirePlotter做hsa-miR-515-5p在喉鳞癌（LaryngealSquamousCellCarcinoma,LSCC）患者中的生存分析，RT-qPCR检测LSCC中h... 展开

关键词 : 喉鳞状细胞癌 FOXC1基因 Hsa-miR-515-5p

4. Hsa_circ_0009061通过miR-889-3p/CPEB3轴抑制膀胱癌恶性增殖的分子机制研究

[学位论文] 马文超安徽医科大学 2022年硕士导师: 姚旭东共62页

摘要 : 研究背景：膀胱癌作为泌尿系统常见肿瘤，主要特点是高复发风险、高转移风险和高死亡风险。目前,膀胱癌的病因及发生机制尚不明确，尽管手术、放疗、化学治疗及免疫治疗虽然一定程度上改善了膀胱癌患者的预后，但仍不能取得让人满意的疗效。因此，开展... 展开研究背景：膀胱癌作为泌尿系统常见肿瘤，主要特点是高复发风险、高转移风险和高死亡风险。目前,膀胱癌的病因及发生机制尚不明确，尽管手术、放疗、化学治疗及免疫治疗虽然一定程度上改善了膀胱癌患者的预后，但仍不能取得让人满意的疗效。因此，开展膀胱癌基础研究，探究膀胱癌恶性进展的分子机制，可能会为膀胱癌早期诊断、结局预测提供可靠的生物标志物，并为靶向治疗提供新的研究方向。环状RNA作为一类结构特殊的RNA，不具有5’甲基鸟苷帽子和3’多聚腺苷酸尾巴，呈现为单链、共价闭合的环状结构，因其在结构、生成、调节、降解等各方面均具有独特表现，成为近年来RNA领域的研究热点。在膀胱癌中，环状RNA不仅与膀胱癌临床病理特征显著相关，而且通过各种方式参与膀胱癌的多种生物学行为。此外，由于环状RNA可高度稳定存在于外泌体，因而还可作为膀胱癌早期诊断及预后评估生物标志物。综上所述，环状RNA在与膀胱癌的发生、恶性进展、诊断及预后评估中均发挥重要作用，提示环状RNA具有成为膀胱癌治疗靶点的潜力。研究方法：本研究应用生物信息学方法分析膀胱癌与其邻近癌旁组织间差异表达的环状RNA。实时荧光定量PCR实验用于鉴定在膀胱癌细胞系及膀胱肿瘤组织中差异表达的环状RNA。运用平板克隆、CCK-8,Edu和异种移植肿瘤模型等功能实验确定hsa_circ_0009061敲低引起的体外和体内膀胱肿瘤细胞的生物学行为变化。生物信息学方法预测环状RNA可能结合的miRNA以及miRNA靶基因，并通过实时荧光定量PCR，RNApulldown，Westernblot和双荧光素酶报告实验探究环状RNA调控膀胱癌膀胱癌进展的机制。实验结果：我们应用生物信息学分析和RT-qPCR技术发现hsa_circ_0009061在膀胱癌细胞系及膀胱肿瘤组织中低表达。成功构建膀胱肿瘤细胞hsa_circ_0009061敲低稳转株后，应用CCK-8，平板克隆和Edu等体外功能实验发现hsa_circ_0009061表达降低可促进膀胱肿瘤细胞系恶性增殖，异种移植肿瘤模型发现敲低hsa_circ_0009061可促进膀胱肿瘤细胞在裸鼠体内增殖。机制研究表明，hsa_circ_0009061富含miRNA结合位点，可作为竞争性内源性RNA与hsa-miR-889-3p相结合，导致靶基因CPEB3表达变化，进而影响膀胱肿瘤的恶性进展。结论：本研究首次发现hsa_circ_0009061在膀胱肿瘤细胞系及膀胱肿瘤组织中低表达，并揭示其通过hsa-miR-889-3p/CPEB3轴影响膀胱肿瘤恶性增殖的机制，为膀胱癌的治疗提供了新的方向。收起

关键词 : 膀胱癌环状RNA hsa-miR-889-3p

5. 喉鳞癌中Hsa-miR-145-5p及靶基因FSCN1调控紊乱的新机制及临床意义

[学位论文] 高伟山西医科大学 2013年博士导师: 王斌全共211页

摘要 : 【研究目的】 1.获得喉鳞癌中差异性microRNA表达谱，从中挑选预研究的靶标分子； 2.结合喉鳞癌临床病理参数评价Hsa-miR-145-5p及其靶基因FSCN1的临床意义，探讨它们与喉鳞癌预后的关系； 3.验证Hsa-miR-145-5p及其靶基因FSCN1的调控... 展开【研究目的】 1.获得喉鳞癌中差异性microRNA表达谱，从中挑选预研究的靶标分子； 2.结合喉鳞癌临床病理参数评价Hsa-miR-145-5p及其靶基因FSCN1的临床意义，探讨它们与喉鳞癌预后的关系； 3.验证Hsa-miR-145-5p及其靶基因FSCN1的调控关系，并明确他们在喉鳞癌细胞系Hep-2及TU-177中的体外、体内生物学功能； 4.初步明确两者在喉鳞癌中调控紊乱的分子生物学机制。【研究方法】 1.利用基因芯片技术获得喉鳞癌中差异性microRNA的表达谱； 2.通过生物信息学预测并结合文献，定位与喉鳞癌侵袭转移相关的microRNA及其靶基因； 3.利用qRT-PCR、Westernblot及免疫组化技术回顾性研究它们与喉鳞癌患者临床病理参数及预后的关系； 4.利用双荧光报告载体验证他们之前的靶向调控关系； 5.利用基因转染技术，通过loss-of-function及gain-of-function体外观察他们对喉鳞癌细胞恶性表型的影响，通过裸鼠移植瘤模型观察抑制肿瘤效果； 6.通过荧光共聚焦技术、电镜技术观察他们对喉鳞癌细胞骨架形成及细胞生物学结构的影响； 7.利用生物信息学技术预测Hsa-miR-145-5p甲基化位点，结合甲基化测序进行定量验证； 8.体外校正Hsa-miR-145-5p-FSCN1轴后，检测EMT关键分子的变化水平；数据全部录入SPSS21.0。率的比较用卡方检验，计量资料用t检验或方差检验，强度用秩和检验，生存分析用KM法及Cox模型。P<0.05认为差异有统计学意义。【研究结果】 1.基因芯片筛查发现Hsa-miR-145-5p是喉鳞癌中显著下调的差异性microRNA之一； 2.经生物信息学预测，同时利用双荧光报告载体验证了FSCN1是Hsa-miR-145-5p的直接靶基因；Hsa-miR-145-5p发挥对FSCN1转录后的调控作用； 3.miR-145-5p（抑癌基因）在喉鳞癌组织中存在显著异常低表达，而其靶基因FSCN1（癌基因）则存在显著异常高表达；miR-145-5p与喉鳞癌患者T分期、颈淋巴结转移、临床分期、分化程度呈负相关，而FSCN1与喉鳞癌患者T分期、颈淋巴结转移、临床分期、分化程度呈正相关（P<0.05）； 4.miR-145-5p低表达及FSCN1蛋白高表达提示喉鳞癌患者预后不良。其中FSCN1是喉鳞癌患者预后不良的单独影响因素；特别是同时伴有miR-145-5p低表达且FSCN1蛋白高表达这一分子特征是患者预后不良的独立风险因子。 5.体外实验证实恢复miR-145-5p的表达或敲减FSCN1的表达，则可抑制喉鳞癌细胞增殖、平板克隆、迁移及侵袭的恶性表型，同时可将喉鳞癌细胞阻滞在G0/G1期，并促进其凋亡；化学修饰的miR-145-5p及si-FSCN1药物具有体内抑制肿瘤生长的效果； 6.miR-145-5p启动子高甲基化引发其转录障碍，导致靶基因FSCN1调控紊乱，并在肿瘤细胞恶性间质转化（EMT）中发挥重要生物学效应。【研究结论】 1.喉鳞癌中存在显著差异性microRNA表达谱。miR-145-5p在喉鳞癌中显著下调，扮演抑癌基因角色，而其靶基因FSCN1扮演癌基因角色。同时伴有miR-145-5p低表达且FSCN1高表达的个体预后不良，且这一分子特征是喉鳞癌患者预后的独立危险因素。 2.miR-145-5p启动子高甲基化导致其功能失调，促进喉鳞癌细胞增殖、侵袭转移、间质转化等恶性表型，这一生物学效应是通过其靶基因FSCN1异常上调所介导。 3.本研究以microRNA这一新视角，明确了miR-145-5p及靶基因FSCN1调控紊乱是喉癌中的重要分子事件。也为以microRNA为靶点对喉鳞癌行分子靶向治疗提供新思路及理论依据。收起

关键词 : 喉鳞癌 Hsa-miR-145-5p基因靶基因FSCN1 调控机制

6. Hsa-miR-371a-5p通过调控LEF1影响胃癌细胞迁移和侵袭的机制研究

[学位论文] 王颖南华大学 2020年硕士导师: 曾斌共67页

摘要 : 【目的】对hsa-miR-371a-5p通过调控LEF1影响胃癌细胞MKN45功能学的机制进行研究，为胃癌的早期诊断与治疗提供新的靶标。【方法】本文主要通过对TCGA数据库数据信息进行分析，预测并得到目标miRNA(hsa-miR-371a-5p)和靶基因(LEF1)... 展开

关键词 : 胃癌 Hsa-miR-371a-5p LEF1 肿瘤侵袭

7. 18-三体综合征母体胎源性CeRNA网络调控分析

[学位论文] 邹耀霜广西师范大学 2018年硕士导师: 晏强;戴勇共59页

摘要 : 竞争性内源性RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA）是指具有miRNA结合位点，能够竞争性结合miRNA，抑制miRNA对靶基因调控的一类RNA。ceRNA并不是新的RNA分子，而是最新发现的具有调控功能的一类RNA。其中包含mRNA、lncRNA、假基因、circRNA和sRN... 展开竞争性内源性RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA）是指具有miRNA结合位点，能够竞争性结合miRNA，抑制miRNA对靶基因调控的一类RNA。ceRNA并不是新的RNA分子，而是最新发现的具有调控功能的一类RNA。其中包含mRNA、lncRNA、假基因、circRNA和sRNA等。18-三体综合征(18-trisomy syndrome)又称为爱德华综合征(Edwards syndrome)，是常见的染色体三体征，是由于人类18号染色体增多1条造成的染色体畸变，该类患儿临床表现差异大，可从重度先天畸形到近似正常，重度的临床表现为严重的神经系统发育障碍、面部畸形、生长迟缓、骨骼异常、心脏和肾脏畸形等。由于18-三体综合征患儿在胎儿期即存在较高的自然流产率，故新生儿18-三体综合征的患病率为1/8000-1/6000，仅次于唐氏综合征(Downsyndrome,DS)的发病率，存在严重的智力低下和多种缺陷，生活往往不能自理，社会适应和劳动能力较差，给家庭和社会造成沉重的经济负担。创立新型的无创产前筛查，寻找18-三体综合征产前诊断的标志物十分重要。本研究主要从circRNA的差异性表达与miRNA结合位点分析、circRNA与miRNA、mRNA三者的网络分析、lncRNA在已知类型的基因分布情况以及lncRNA差异表达分析和lncRNA与miRNA、mRNA相互关联分析、sRNA与已知miRNA分析和新miRNA预测等方面进行研究分析。目的：通过获得的全转录组测序表达谱筛选母血（ES-2）和脐带血（ES-1）中差异性表达的lncRNA、circRNA和miRNA，并对差异性表达的circRNA、lncRNA、sRNA与mRNA、miRNA进行关联分析，探讨ceRNA在18-三体综合征中的网络调控及其作用机制。方法：选取产前诊断指征为18-三体综合症的2名孕妇的外周血以及脐带血，对照组为正常的相同孕周期的孕妇脐带血和外周血，利用Trizol法提取总RNA，使用NanoDrop ND-1000检测RNA是否降解并测定RNA浓度；采用DEGseq分析18-三体综合症孕妇的外周血以及脐带血中的circRNA、LncRNA和sRNA差异表达谱。根据circRNA、LncRNA和sRNA以及miRNA与mRNA可能存在的相互作用，分析18-三体综合征孕妇的脐带血以及外周血中表达共同显著差异的circRNA、LncRNA和sRNA与mRNA可能存在的关联关系。结果：（1）妊娠18-三体综合征孕妇的脐带血circRNA表达谱分析发现差异表达显著的circRNA 10050个，其中下调表达circRNA 5164个，上调表达circRNA 4886个。（2）妊娠18-三体综合征孕妇的外周血circRNA表达谱分析发现差异表达显著的circRNA13278个，其中下调表达circRNA 5007个，上调表达circRNA 8271个。（3）妊娠18-三体综合征孕妇的脐带血和外周血circRNA表达谱进行共同分析发现2876个共同差异，但只有1510个上调下调方向一致，其中共同下调表达circRNA 1064个，共同上调表达circRNA 466个，其中hg38_circ_0012295的差异倍数最大。（4）妊娠18-三体综合征孕妇的脐带血lncRNA表达谱分析发现差异表达显著的lncRNA 1824个，其中下调表达lncRNA 858个，上调表达lncRNA 966个。（5）妊娠18-三体综合征孕妇的外周血lncRNA表达谱分析发现差异表达显著的lncRNA 1063个，其中下调表达lncRNA 628个，上调表达lncRNA 535个。（6）妊娠18-三体综合征孕妇脐带血与外周血中共同表达差异的lncRNA为586个。脐带血中与18号染色体相关的lncRNA-mRNA分析有65个lncRNA对应相关有114个基因，其中RP11-231E4.5与CNDP2基因的lncRNA-mRNA关联最多。我们挑选了共同差异倍数大的lncRNA对应的5个关键基因，分别是CTD-2561J22.5、RP11-203J24.8、JPX、LINC00998、RP11-231E4.5，这5个关键基因不仅在脐带血中显著差异表达，而且在孕妇外周血也有同样的表现。（7）通过对sRNA与miRNA表达谱的关联关系分析，发现hsa-miR-148b-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-4433a-3p、hsa-miR-4433b-5p、hsa-miR-7706、hsa-miR-941共10个差异表达miRNA，特别是hsa-miR-20a-5p调控其对应靶基因mRNA的表达差异倍数最大。（8）挑选出18-三体综合征脐带血和孕妇的外周血中ceRNA差异表达与mRNA之间的共同的关键节点23个miRNA（hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-148b-3p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-500a-3p、hsa-miR-7706、hsa-miR-941、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-136-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-382-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-624-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-27a-3p），这些关键节点是ceRNA与miRNA、miRNA与mRNA的相互作用的中心枢纽，以不同的方式调控，相互作用，相互影响。（9）对circRNA差异基因进行GO分析，发现参与生物过程的基因有9131个，参与细胞组成的基因有1201个，参与分子功能的基因有2321个；对差异基因进行Pathway通路分析，挑选富集的前20位通路分析，发现脐带血和外周血的胞吞作用通路最富集。结论：（1）差异表达circRNA、lncRNA、sRNA有其对应的miRNA结合位点，有且还可能不止一个，结合位点同时也可能是其他ceRNA的共同位点，通过与miRNA的相互作用，共同调控靶基因的表达。ceRNA在未来有可能成为18-三体综合征新的分子生物学标志物。（2）差异表达基因可能通过多种途径、角色参与18-三体综合征的发生。（3）CTD-2561J22.5、RP11-203J24.8、JPX、LINC00998、RP11-231E4.5这5个失调lncRNA有可能对18-三体综合征的发生、发展有重要影响。（4）挑选出关键节点的23个miRNA通过ceRNA与miRNA、miRNA与mRNA的相互作用，以不同的方式调控，相互作用，相互影响，其中，hsa-miR-148b-3p和hsa-miR-941最有可能成为诊断18-三体综合征的生物标志物。收起

关键词 : 18-三体综合征竞争性内源性RNA hsa-miR-148b-3p hsa-miR-941 网络调控

8. 苦瓜蛋白MD28通过下调miR-23b-3p促进ABCA1表达

[学位论文] 费明珠南华大学 2015年硕士导师: 王佐共73页

摘要 : [目的]前期工作发现苦瓜蛋白 M28可上调 THP-1源性泡沫细胞ABCA1的表达而减少细胞内的脂质蓄积，但其机制不清楚。本研究拟从转录后水平分析其作用机制。 [方法]首先用miR芯片技术分析经苦瓜蛋白干预后，50mg/ml oxLDL处理48h的THP-1源性泡沫细胞... 展开 [目的]前期工作发现苦瓜蛋白 M28可上调 THP-1源性泡沫细胞ABCA1的表达而减少细胞内的脂质蓄积，但其机制不清楚。本研究拟从转录后水平分析其作用机制。 [方法]首先用miR芯片技术分析经苦瓜蛋白干预后，50mg/ml oxLDL处理48h的THP-1源性泡沫细胞的miRs谱中下调1.5倍的miRs，并与genecards调控ABCA1基因表达的miRs比较，找到2者共同miRs，然后用生物信息学手段预测此miRs与ABCA1之间的靶基因关系，并以荧光素酶报告基因系统加以验证。qRT-PCR和western blot分别检测ABCA1mRNA和蛋白表达水平，qRT-PCR检测 miR-23-3p表达水平，液体闪烁计数法测定胆固醇流出，油红 O染色法测定胞内脂质蓄积，最后再用生物信息学分析miR-23b-3p表达调控的转录因子。统计学分析采用均数±标准差（x±SD)表示，用Graphpad Prism5.0.1对数据进行分析和作图，选取95%可信区间，P<0.05为差异有显著性意义。 [结果]miR芯片分析发现69个miRs表达显著下调，genecards上显示113个miRs以ABCA1为靶基因，2者的交集是 hsa-miR-93、 hsa-miR-642b、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-130a、hsa-miR-513a-5p、hsa-miR-26a和hsa-miR-33a7个miRs，这7个miRs以hsa-miR-23b-3p在苦瓜蛋白MD28干预后下降幅度最大，达到12倍，其余大多不超过2倍，因此，以hsa-miR-23b-3p作为深入分析苦瓜蛋白MD28下调ABCA1表达的miR。人ABCA1的3’-UTR有3个miR-23-3p的结合位点，其中255-261为保守位点，其与ABCA13’UTR结合的自由能为-25.3kcal/mol。靶基因验证实验证实ABCA1是hsa-miR-23b-3p的靶基因。苦瓜蛋白MD28剂量（0mg/ml、0.4 mg/ml、1.2 mg/ml、3.6 mg/ml、5 mg/ml）和时间（0h、6h、12h、24h、48h）依赖性地上调ABCA1 mRNA及蛋白的表达水平，以1.2 mg/ml作用12h最为显著。使用hsa-miR-23b-3p的抑制剂可减弱苦瓜蛋白MD28对ABCA1的上调作用，并减少 THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出和增加胞内的脂质蓄积。qRT-PCR分析结果表明苦瓜蛋白MD28能上调THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞hsa-miR-23b-3p的表达水平，生物信息学分析表明，MYC、TGFβ、SPⅠ1、RunX2、EGR1、CREB1、ESR2、FXR在hsa-miR-23b-3p基因的启动子上有结合位点。 [结论]苦瓜蛋白MD28剂量和时间依赖性地上调THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1 mRNA及蛋白的表达水平，增强胆固醇流出，减少脂质蓄积，且其均与下调hsa-miR-23b-3p有关。收起

关键词 : 苦瓜 MD28蛋白 hsa-miR-23b-3p 胆固醇流出脂质蓄积 ABCA1基因

9. Hsa-miR-363、Hsa-miR-423-5p对HaCaT细胞表达VEGF的调控研究

[学位论文] 任新新天津医科大学 2014年硕士导师: 刘全忠共64页

摘要 : 目的:探讨人工构建的hsa-miR-363和hsa-miR-423-5P两条microRNAs对人HaCaT细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的调控作用，预测hsa-miR-363和hsa-miR-423-5P在银屑病领域的应用前景。方法:培养人永生角质形成细胞(HaCaT细胞株)，培养完成后进行细胞... 展开目的:探讨人工构建的hsa-miR-363和hsa-miR-423-5P两条microRNAs对人HaCaT细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的调控作用，预测hsa-miR-363和hsa-miR-423-5P在银屑病领域的应用前景。方法:培养人永生角质形成细胞(HaCaT细胞株)，培养完成后进行细胞铺板，本次实验设有hsa-miR-363模拟物组、hsa-miR-363抑制物组、hsa-miR-423-5p模拟物组、hsa-miR-423-5p抑制物组、模拟物阴性对照组、抑制物阴性对照组和空白对照组共7组，根据需要做好复孔，然后加入转染试剂进行转染，再用MTT法检测HaCaT细胞增殖活性和细胞转染的成果，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测转染细胞中VEGF基因的mRNA水平，ELISA法观察hsa-miR-363和hsa-miR-423-5p对VEGF蛋白表达水平的调控效应。结果:MTT实验结果显示hsa-miR-363模拟物、hsa-miR-363抑制物、hsa-miR-423-5p模拟物、hsa-miR-423-5p、抑制物、模拟物阴性对照和抑制物阴性对照六组24h、48h、72h的细胞增殖活性有统计学意义(P＜0.05)，在光学显微镜下观察到细胞生长状态良好，代表转染效果良好。随着时间的推移细胞增殖抑制率逐渐升高，到72h时达到最高，同样代表转染率在72h最高。随着细胞增殖抑制率达到最高，转染率也达到最高，效果最明显，细胞也趋于稳定，达到最佳状态，促使各组间差异体现明显。qRT-PCR结果显示hsa-rniR-363模拟物组、hsa-miR-363抑制物组、hsa-miR-423-5p模拟物组和hsa-miR-423-5p抑制物组VEGF基因的mRNA表达水平值与空白对照组之间的P值均大于0.05，差异无统计学意义，即hsa-miR-363模拟物和抑制物、Hsa-miR-423-5p模拟物和抑制物对VEGF基因的mRNA表达水平无影响。ELISA结果显示hsa-miR-363模拟物、hsa-miR-363抑制物和空白对照组各组间的VEGF蛋白表达水平均有统计学意义，即hsa-miR-363模拟物组的VEGF蛋白表达水平较正常组高，hsa-miR-363抑制物组的表达水平低，进一步说明hsa-miR-363可以使HaCaT细胞VEGF信号通路表达上调。Hsa-miR-423-5P模拟物、hsa-miR-423-5P抑制物、模拟物阴性对照、抑制物阴性对照和空白对照组各组间的VEGF蛋白表达水平没有统计学意义，即与正常组相比VEGF蛋白的表达水平无明显差异，进一步说明可能此条miRNA不通过VEGF信号通路调控。结论:Has-miR-363可提高HaCaT细胞VEGF的表达，从而可以认为hsa-miR-363在银屑病患者中通过VEGF信号通路表达上调。而hsa-miR-423-5P对HaCaY细胞VEGF的表达没有影响，可认为hsa-miR-423-5P可能在银屑病患者中没有通过VEGF信号通路表达下调。银屑病是一种遗传基因异常性疾病，转录水平上的hsa-miR-363可靶向调控大量mRNA，而这个被调控的mRNA与其它mRNA又存在错综复杂的相互影响和作用，共同形成网络式的调节结构通过VEGF等多种途径来参与银屑病的发生。收起

关键词 : 银屑病 hsa-miR-363 hsa-miR-423-5P HaCaT细胞血管内皮生长因子调控作用

10. LncRNA OTUD6B-AS1在脑胶质瘤中的分子机制研究

[学位论文] 张智南昌大学医学部 2022年博士导师: 王淳良共104页

摘要 : 背景：脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，其发病率高、复发率高和死亡率高以及预后极差的特点让患者饱受痛苦折磨和沉重的经济负担。目的：明确LncRNAOTUD6B-AS1基因在脑胶质瘤发生与发展过程中的生物学功能表型，初步探索... 展开背景：脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，其发病率高、复发率高和死亡率高以及预后极差的特点让患者饱受痛苦折磨和沉重的经济负担。目的：明确LncRNAOTUD6B-AS1基因在脑胶质瘤发生与发展过程中的生物学功能表型，初步探索该基因发挥生物学功能的分子机制以及可能调控的下游靶点，为脑胶质瘤的基因诊断与治疗挖掘潜在的药物作用靶点，并为该靶点提供相应的实验依据。方法：通过脑胶质瘤组织样本RNA-seq测序构建转录组数据库，分析建库数据后筛选出存在表达差异的基因并通过RT-qPCR实验验证。选定拟研究的基因LncRNAOTUD6B-AS1以及表达差异显著的脑胶质瘤细胞U87和T98G。RT-qPCR结合生物信息学分析筛选出存在调控关系的has-miR-155-5p基因和HNRNPA3基因。并通过CCK8实验、Edu实验、Transwell实验和划痕实验等检测上述三个基因在脑胶质瘤细胞U87和T98G生物学功能表型。双荧光素酶报告系统实验验证三个基因之间的结合位点。Westernbolt实验检测信号通路关键蛋白的改变，最后裸鼠成瘤实验和临床组织样本验证从动物与组织层面对LncRNAOTUD6B-AS1再次论证。结果：在干扰LncRNAOTUD6B-AS1基因表达后，U87和T98G细胞增殖能力下降，迁移、侵袭能力减弱，裸鼠皮下成瘤能力下降。而过表达LncRNAOTUD6B-AS1基因后，脑胶质瘤细胞的一系列细胞生物学功能则出现了相反的改变。在hsa-miR-155-5p基因mimics后，细胞增殖能力下降，迁移、侵袭能力减弱。而inhibitorhsa-miR-155-5p基因后，则出现了相反的改变。干扰HNRNPA3基因表达后，T98G细胞增殖能力下降，迁移、侵袭能力减弱。Westernblot实验发现干扰HNRNPA3基因表达后PI3K/AKT信号通路中的蛋白AKT和Bcl-2表达下降，而GSK3β表达上升。结论： LncRNAOTUD6B-AS1通过hsa-miR-155-5p/HNRNPA3/AKT信号轴调控细胞周期，从而促进脑胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭。收起

关键词 : 脑胶质瘤 hsa-miR-155-5p 分子机制