摘要:
前 言 MicroKNA(miRNA)是近年来备受关注的一类普遍存在于动、植物中的非编码小RNA,大约20-24个核苷酸,来自于长的转录子前体pri-miRNA和pre-miRNA。MiRNA与其靶mRNA分子的3’端非编码区(3’-UTR)不完全互补结合,在多细胞生物体中,转录后调控基因的表...
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前 言 MicroKNA(miRNA)是近年来备受关注的一类普遍存在于动、植物中的非编码小RNA,大约20-24个核苷酸,来自于长的转录子前体pri-miRNA和pre-miRNA。MiRNA与其靶mRNA分子的3’端非编码区(3’-UTR)不完全互补结合,在多细胞生物体中,转录后调控基因的表达,影响着几乎所有的信号通路,参与多种生理病理过程,在肿瘤的发生和发展中也发挥了重要的调节作用。 目前研究最为清楚的Ras相关单体GTP酶家族为Rho,Rac1和CDC42,它们参与细胞内多样的调节作用,包括细胞骨架的重构,细胞的迁移和侵袭。Rho相关的丝／苏蛋白激酶(Raho-associated serine／threonine protein kinase,Rock)是迄今为止功能研究最为清楚的Rho下游靶效应分子之一。活化的GTP-Rho可以和Rock相互作用而激活Rock。通过与Rho相互作用,Rock在肿瘤细胞的转移过程中参与调控细胞迁移和侵袭。 肿瘤的侵袭和转移是世界上癌症患者死亡最常见的因为。最近,越来越多的研究报道表明,miRNA与肿瘤细胞的侵袭和转移有关,其调控肿瘤细胞侵袭和转移的作用机制成为miRNA研究领域的热点之一。在miRNA与Rho／Rock-1传导通路的关系中,Kong等人在鼠正常乳腺上皮细胞中发现,miR-155在TGF-β诱导的上皮间质转化以及RhoA引起的细胞迁移侵袭过程中具有重要作用。TWIST1能够诱导miR-10b,miR-10b通过直接转录后抑制HOXD10的表达来间接的增加RhoC的水平,从而影响了肿瘤细胞的迁移和侵袭。研究Rho和miRNAs之间的关系加强了miRNA在肿瘤形成中的重要性,并且为癌症转移的患者提供了新的治疗策略。 miR-125a是一种功能以及机制尚未研究清楚的miRNAs之一。Yanainhara等人发现miR-125a定位在19q13.41,并用miRNA芯片分析了104对肺癌组织以及相应的癌旁肺组织,发现与癌旁肺组织相比较,miR-125a在肺癌组织中下调表达。至目前为止,已发现的成熟体miR-125a家族有两个成员,即hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p。本研究目的旨在探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p的表达及其临床意义,分析hsa-miR-125a-3p和hsa-miR—125a-5p与NSCLC细胞系转移潜能的关系。并在细胞水平上,通过向肺癌细胞中转染正义和反义的2’-O-甲基寡核苷酸的方法,探讨增加hsa-miR-125a-3p和hsa-miR—125a-5p的表达以及下调hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p的表达对Rho／Rock1途径,以及肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响,为hsa-miR-125a-3p和hsa-miR-125a-5p可能是Rho／Rock1信号通路非常重要的调节因子提供依据。 材料与方法 1、NSCLC组织标本 52例配对的非小细胞肺癌和癌旁肺组织(远离原发灶)标本均来自中国医科大学病理教研室。患者术前均未接受过任何化学或放射治疗。福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织切片常规进行HE染色,分别由两名病理论断医师,根绝WHO肺及肺膜肿瘤分类标准(2004)和TNM分期系统(1997),确定肿瘤的组织学分型以及临床病理分期。52例NSCLC包括:男性33例,女性29例；年龄40～78岁(平均58岁±9岁)；鳞癌22例,腺癌30例；病理分级,高分化8例,中分化28例,低分化16例；病理分期,Ⅰ期18例,Ⅱ期15例,Ⅲ期19例；淋巴结转移20例,无淋巴结转移32例。52例配对组织在液氮中快速冰冻,以后用于提取mRNA。常规病理检查手术切除的肺门、纵膈以及肺内淋巴结,用于确定肺癌的淋巴结转移情况。患者的临床病理参数包括性别,年龄,组织学类型,病理分级,病理分期,淋巴结转移,摘自患者的病历资料。 2、细胞培养 冻存于液氮的A549细胞经复苏后,用DMEM培养液(含有10％新生牛血清,100u／ml的青霉素和100μg／ml的链霉素),在37℃,5％CO2饱和湿度条件下培养,经3次传代稳定后,进行转染。 3、细胞转染 2’-O-甲基寡核苷酸(2’-O-Me-sense-3p:5’-ACA GGU GAG GUU CUU GGGAGCC-3’2’-O—Me—antisense-3p:5’-GGC UCC CAA GAA CC U CAC CUGU-3’,2’-O-Me-scramble-3p:5’-GGU CGG UGC UCG AUG CAG GUAA-3’,2’-O—Me—sense-5p:5’-UCC CUG AGA CCC UUU AAC CUG UGA-3’,2’-O—Me-antisense-5p:5’-UCA CAG GUU AAA GGG UCU CAG GGA-3’,2’-O-Me—scramble-5p:5’-GGA CG G CGA UCA GAU AAG AGU UCU-3’.)用结合DNA技术合成(GeneChem,China)。用LipofetamineTM 2000(Invitrogen,USA)将20μM 2'-O-甲基寡核苷酸转染入6孔板中A549和SPC细胞中为RNA提取和transwell备用。untreated为未加任何处理因素的细胞,scramble为转染乱码序列2’-O-甲基寡核苷酸的细胞,sense为转染正义序列2’-O-甲基寡核苷酸的细胞,antisense为转染反义序列2’-O-甲基寡核苷酸的细胞。其中对照组细胞为(untreated和scramble)。 4、Real-time PCR 根据操作说明应用TaqMan MicroRNA试剂检测成熟体miRNA(AppliedBiosystems,USA)。所有的RT产物,在ABI Prism 7900HT序列检测系统中运行。用特异的RT引物和TaqMan探针定量检测hsa-miR-125a-3p(PN:4395310)和hsa-miR-125a-5p(PN:4395309),RNU6B(PN:4373381)和U18(PN:4380904)为内参。组织样本用2次独立样本经过2次独立实验,细胞样本用3次独立样本经过3次独立实验后得到的数据用公式RQ=2-ΔΔCt的方法进行分析。 5、RT-PCR TRIzol试剂提取总RNA,紫外分光光度计测定RNA纯度并定量,在1％甲醛变性凝胶电泳验证RNA完整性。RT-PCR采用两步法试剂盒(宝生物公司)按照厂家推荐步骤进行,扩增体系为20μl,以持家基因β-actin为内参照,对样品模板用量标准化。引物参照文献及使用Primer Designer5.0软件设计。RT条件按照厂家推荐,PCR条件:95℃ 1min,随后进行35个循环的94℃ 30s,55℃ 30s,72℃45s,最后72℃充分延伸10min；β-actin PCR条件:94℃5min,随后94℃ 40s,50℃ 40s,72℃ 40s共35个循环,最后72℃充分延伸5min。扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳,UVP图像处理系统采集图像,ImageJ灰度分析软件进行条带灰度分析。产物经1.75％琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统摄像,分析各条带强度。 6、Western blot检测 提取各组织蛋白,根据蛋白的分子量制备不同浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶,每孔上样量50μg,常规电泳、转膜、封闭,一抗及相应二抗37℃孵育1h,DAB显色,β-actin作为内对照。UVP图像处理系统采集图像,ImageJ灰度分析软件进行条带灰度分析。以平均吸光度值INT和信号面积S的乘积代表信号强度。分别计算不同指标和β-actin的INT×S,用二者的比值显示不同指标的表达水平。 7、Transwell细胞迁移和侵袭实验 在具有8μm小孔聚碳酸酯滤膜的培养小室上铺用预冷无血清培养基稀释的Matrigel基质胶,接种100μl无血清培养基稀释的A549细胞或NCI-H460细胞(5x105个／mL),下室加入600μl含10％血清的DMEM培养液或1640培养液,每组设6复孔。37℃、5％CO2条件下培养24h后,取出培养小室,用2.5％戊二醛固定15min,并以0.5％Triton X-100处理3min,苏木精中染核15min。将培养小室倒置,在光学显微镜(Leica,德国)下观察、照相,并计数每高倍视野滤膜底面的平均细胞数。细胞迁移实验在无Matrigel基质胶包被的Transwell小室中进行,方法同细胞侵袭实验。 8、统计学分析 结 论 1、hsa-miR-125a-3p与病理分期和淋巴结转移呈负相关,而hsa-miR-125a-5p与病理分期和淋巴结转移呈正相关。 2、hsa-miR-125a-3p能够通过RhoA／Rock1信号途径抑制肺癌细胞的迁移和侵袭。 3、hsa-miR-125a-5p能够通过RhoC／Rock1信号途径促进肺癌细胞的迁移和侵袭。
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