摘要: 第一部分 氟碳纳米粒及CNA35靶向氟碳纳米粒的制备及基本特性检测 目的： 制备具有Ⅰ型胶原靶向性的液气相变氟碳纳米粒，检测其基本特性。 方法： 以脂质材料作为外壳，中间包裹相变材料液态氟碳PFP,采用薄膜水化法和声振法制备相变型氟... 展开 第一部分 氟碳纳米粒及CNA35靶向氟碳纳米粒的制备及基本特性检测 目的： 制备具有Ⅰ型胶原靶向性的液气相变氟碳纳米粒，检测其基本特性。 方法： 以脂质材料作为外壳，中间包裹相变材料液态氟碳PFP,采用薄膜水化法和声振法制备相变型氟碳纳米粒，检测其形态、分布、粒径和表面电位，筛选出制备纳米粒的最佳条件；通过碳二亚胺法连接Ⅰ型胶原特异性抗体CNA35和氟碳纳米粒，制备可特异性结合Ⅰ型胶 原 的 靶 向 氟 碳 纳 米 粒 （ CNA35-Perfluoropentane nanoparticles,CNA35-PFP NPs）,并检测其基本特性，激光共聚焦显微镜定性观察、流式细胞仪定量分析其连接率。 结果： PFP和脂质悬液以1∶20的比例，进行2次脉冲声振制备的PFP NPs和CNA35-PFP NPs大小均匀、分散性好，纳米粒溶液呈乳白色，光学显微镜及荧光显微镜下观察到纳米粒呈球形或点状，透射电镜显示纳米粒的粒径约250nm。Malvern激光粒径电位仪检测出PFP NPs 和 CNA35-PFP NPs 的粒径分别为 （ 255.86±3.13 ） nm 和（295.62±4.19）nm，表面电位分别为（-1.73±0.46）mV和（1.79±0.13） mV；激光共聚焦显微镜观察到代表CNA35的绿荧光和代表PFP NPs的红荧光能够有效结合；流式细胞仪结果显示CNA35和PFP NPs有较高的连接率，约86%。 结论： 成功制备出符合条件的氟碳纳米粒（PFP NPs）及CNA35靶向氟碳纳米粒（CNA35-PFP NPs），CNA35是Ⅰ型胶原特异性抗体，为后续心肌纤维化体外寻靶实验奠定了基础。 第二部分 CNA35靶向氟碳纳米粒的体外相变及超声成像研究 目的： 制备一种新型的液-气相变型靶向Ⅰ型胶原氟碳纳米粒CNA35-PFP NPs ，通过体外实验探讨加热及低功率聚焦超声（ Low intensity focused ultrasound,LIFU）辐照促使这种新型靶向氟碳纳米粒发生液-气相变的适宜条件，并用诊断超声观察其显影情况。 方法： 不同温度（37℃、40℃、45℃和50℃）分别水浴加热纳米粒 1min、5 min、10 min ，用光学显微镜及诊断超声观察制备的CNA35-PFP NPs发生相变的情况；用LIFU不同功率（1W/cm2、2W/cm2、3W/cm2、4W/cm2）分别辐照纳米粒1min、2min、3min 、4min后观察纳米粒光学显微镜下发生液气相变的情况及体外超声成像效果；通过加热和超声能量促使CNA35-PFP NPs发生液气相变，从中探讨引发相变的最佳条件。 结果： 加热和LIFU辐照都能引起CNA35-PFP NPs 发生相变。在未加热及LIFU辐照前，100倍显微镜下难以观察到纳米粒。随着水浴加热温度及时间的延长，镜下可观察到愈加明显的纳米粒相变，纳米粒的数量增多，体积增大，同时可明显增强超声显影；此外，一定功率的LIFU辐照后也可促使纳米粒发生相变并能增强超声显影（p＜0.05），我们观察到辐照强度为3W/cm2，时间为3min时纳米粒超声成像效果最佳。 结论： 本实验所制备的CNA35-PFP NPs通过加热或一定功率的LIFU辐照均可发生液气相变，增强超声显影，为将来心肌纤维化的诊断及治疗奠定了基础。 第三部分 CNA35 Ⅰ型胶原靶向氟碳纳米粒的体外寻靶，超声成像效果及半定量分析 目的： 探讨CNA35靶向氟碳纳米粒（CNA35-PFP NPs）对心肌Ⅰ型胶原的体外寻靶能力，并作半定量分析。 方法： 分别制备心肌梗死兔模型及正常兔模型心肌组织冰冻切片（ 10μm ），各5组。用异硫氰酸荧光素（ FITC ）标记CNA35得到FITC-CNA35。采用FITC-CNA35对梗死组和对照组冰冻切片进行染色，通过激光共聚焦显微镜进行观察，并采集图片。将同一张冰冻切片进行天狼星红（PSR）染色，光学显微镜采集图像，与FITC-CNA35染色的图像进行对比，以验证 CNA35 对胶原纤维的靶向能力；将FITC-CNA35用碳二亚胺法与PFP NPs连接，得到带荧光的CNA35靶向氟碳纳米粒（ FITC-CNA35-PFP NPs ）。采用FITC-CNA35-PFP NPs和DNA荧光染料（DAPI）对两组冰冻切片进行染色，在激光共聚焦显微镜下观察染色结果，并采集图片，与梗死组和正常组心肌组织病理切片染色进行对比，包括苏木精-伊红（HE）染色、马松（Masson）染色、PSR染色。应用分析软件ImageJ对Masson染色、PSR染色及荧光染色图像中胶原纤维百分比进行半定量分析，以验证CNA35-PFP NPs的体外寻靶能力。 结果： 在梗死组荧光图像中可观察到大量绿色荧光，而正常组未见明显绿色荧光，显示绿色荧光的部位与PSR染色胶原纤维的部位基本一致；FITC-CNA35-PFP NPs和DAPI染色结果与HE、Masson、PSR染色结果对比发现，绿色荧光所代表的CNA35-PFP NPs能够大量聚集在胶原纤维丰富区域，通过半定量分析可得到一致结果。 结论： CNA35-PFP NPs能够与心肌Ⅰ型胶原纤维结合，并随着心肌胶原纤维沉积而大量聚集，因此，CNA35-PFP NPs具有良好的体外靶向能力，可为后续体内靶向能力的研究提供基础。 收起