摘要: 目的：研发以前列腺癌细胞表面表达的PSMA为靶点的超声－磁共振双模态靶向造影剂。 方法：通过改良的双乳化方法制备携抗PSMA多肽超声-磁共振双模态靶向造影剂。通过表征分析、体外靶向实验、体外成像实验及体外细胞毒性实验来研究携抗PSMA多肽超声... 展开 目的：研发以前列腺癌细胞表面表达的PSMA为靶点的超声－磁共振双模态靶向造影剂。 方法：通过改良的双乳化方法制备携抗PSMA多肽超声-磁共振双模态靶向造影剂。通过表征分析、体外靶向实验、体外成像实验及体外细胞毒性实验来研究携抗PSMA多肽超声-磁共振双模态靶向造影剂的稳定性、靶向性、双模态显像能力及安全性。在动物体内成像实验中，首先通过体内成像明确造影剂的最佳剂量。在磁共振—超声双模态靶向显像实验中，对前列腺癌荷瘤裸鼠在注射造影剂前及注射后不同时间段行磁共振T2加权成像，分析并比较不同组裸鼠皮下移植瘤的肿瘤相对增强强度（RSE）。在注射造影剂后即刻行超声成像，分析并比较不同组裸鼠皮下移植瘤的造影剂到达时间（AT）、达峰时间（TTP）及峰值强度（PI）。并进一步通过体内实验研究造影剂的体内生物分布及安全性。 结果：携抗PSMA多肽超声-磁共振双模态靶向造影剂平均粒径为415 nm，Zeta电位为-6.11mV，呈球形，分布均匀，无明显团聚现象，成功包裹 Fe3O4纳米粒，具有超顺磁性。在体外靶向实验中，携抗PSMA多肽超声-磁共振双模态靶向造影剂能与LNCaP细胞靶向结合。造影剂在超声下表现为高回声，在磁共振T2加权成像上表现为低信号，在体外细胞实验中造影剂对细胞无明显细胞毒性。 体内成像实验确定造影剂的最佳浓度为12mg/ml，在体内磁共振靶向成像实验中，LNCaP荷瘤裸鼠在注射该浓度携抗 PSMA多肽的超声－磁共振双模态靶向造影剂后肿瘤内T2信号明显降低，注射后2小时、6小时12小时及24小时RSE值分别为41.0±1.9%、28.2±6.5%、21.4±5.0%及16.2±3.6，明显高于对照组。LNCaP荷瘤裸鼠在注射携抗 PSMA多肽的超声－磁共振双模态靶向造影剂后肿瘤超声增强 PI值为8.9±1.7dB，明显高于对照组(5.6±1.7dB、6.9±1.2dB及7.0±1.4，P<0.05)。普鲁士蓝染色证实造影剂与肿瘤组织的靶向结合。造影剂在静脉注射后主要被网状内皮系统所摄取，对裸鼠的主要脏器无明显毒性。 结论：携抗PSMA多肽的超声－磁共振双模态靶向造影剂能通过与前列腺癌细胞表面的PSMA靶向结合特异增强前列腺癌的超声及磁共振图像。 第一篇：携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂的制备及体外实验 第一部分：携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂的制备与表征分析 目的：研发以前列腺癌细胞表面表达的PSMA为靶点的超声－磁共振双模态靶向造影剂。 材料与方法：通过改良的双乳化方法制备携抗PSMA多肽超声-磁共振双模态靶向造影剂（Fe3O4/Polypeptide-PLGA MNBs）。采用动态激光散射仪分析携抗 PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂的粒径分布及Zeta电位，采用透射电镜、扫描电镜及光学显微镜分析造影剂的形态结构及分散情况，通过X射线衍射、能量色散X射线谱及原子吸收光谱分析造影剂的构成，采用振动样品磁强计分析造影剂的磁性特征。 结果：动态激光散射仪分析显示造影剂平均粒径为415±11.4 nm，聚合物分散指数为0.142，Zeta电位为-6.11mV，造影剂放置七天后粒径分布无显著变化。透射电镜、扫描电镜及光学显微镜显示造影剂形态呈球形，分布均匀，无明显团聚现象，高分辨率透射电镜可见造影剂中 Fe3O4纳米粒均匀分布。X射线衍射、能量色散X射线谱证实造影剂中成功包裹Fe3O4纳米粒，原子吸收光谱分析测得造影剂中铁含量为12.8ug/mg。振动样品磁强计分析显示造影剂具有超顺磁性。结论：本研究成功制备了用于前列腺癌靶向成像的携抗PSMA多肽的超声-磁共振双模态靶向造影剂，表征分析结果显示该造影剂的理化特性符合超声/磁共振双模态显影的要求。 第二部分：携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂的体外靶向性实验 目的：研究携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂的体外靶向性。 材料与方法：通过免疫荧光实验验证造影剂配体K(FITC)]CQ[K(Dde)]HHNYLC与前列腺癌LNCaP细胞的靶向结合。在进一步的造影剂靶向结合实验中，我们将实验分为以下四组：LNCaP细胞+携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂、LNCaP细胞+普通超声-磁共振双模态造影剂、抗体封闭的LNCaP细胞+携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂以及PC3细胞+携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂。分别通过普鲁士蓝染色、细胞磁共振实验、花环形成实验及免疫荧光实验来研究造影剂的靶向性。 结果：免疫荧光实验证实了多肽K(FITC)]CQ[K(Dde)]HHNYLC能与前列腺癌LNCaP细胞靶向结合。在造影剂靶向结合实验中，普鲁士蓝染色发现LNCaP细胞与携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂孵育后细胞周围出现蓝染颗粒，而对照组及竞争组细胞周围无蓝染颗粒。细胞磁共振实验发现LNCaP细胞与携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂孵育后其磁共振T2加权成像SNR值为 624.6±18.7，明显低于对照组及竞争组(818.6±23.3、814.4±10.9、790.2±23.7，P<0.05)。免疫荧光及花环形成实验发现LNCaP细胞能与携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂靶向结合，而对照组细胞与造影剂无靶向结合。结论：我们所合成的携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂在体外能与前列腺癌LNCaP细胞表达的PSMA特异结合。 第三部分：携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂的体外成像实验 目的：研究携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂的体外超声/磁共振显像性。 材料与方法：配置不同浓度梯度的携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂，同时以去离子水作为阴性对照。采用灰阶成像模式研究造影剂的回声强度。通过磁共振T2加权成像研究造影剂的磁共振显影能力，并采用Carr–Purcell–Meiboom–Gill序列测定不同浓度造影剂的横向弛豫时间（T2），研究造影剂中铁浓度与1/T2的关系，并计算得出造影剂的横向弛豫率R2。 结果：携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂在灰阶超声模式下均表现为高回声，且其回声强度随造影浓度升高而升高，而去离子水则表现为无回声。在磁共振T2加权成像上，携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂表现为低信号，且其信号随造影剂浓度升高而减低，去离子水表现为高信号。造影剂中铁浓度与1/T2呈正比，造影剂的横向弛豫率R2为46.58 mM-1s-1。 结论：我们所合成的携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂在体外具有双模态显影能力。 第四部分：携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂的体外细胞毒性实验 目的：研究携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂的体外细胞毒性。材料与方法：分别将不同浓度梯度的造影剂与前列腺癌LNCaP及PC3细胞孵育24小时、48小时及72小时。孵育后采用MTT法测定细胞的细胞活性。 结果：不同浓度的携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂与PC3细胞及LNCaP细胞孵育后，细胞活性均大于90%。且随着实验细胞与造影剂孵育时间的延长，细胞活性无明显改变（图3-1）。经方差分析，各组之间的细胞活性无显著差异（P>0.05）。 结论：携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂无明显细胞毒性。 第二篇：携抗PSMA多肽超声－磁共振双模态靶向造影剂的体内实验 第一部分：携抗PSMA多肽的超声－磁共振双模态靶向造影剂的体内最佳成像浓度筛选 目的：研究携抗PSMA多肽的超声－磁共振双模态靶向造影剂的体内成像最佳浓度。 材料与方法：分别对LNCaP荷瘤裸鼠注射不同浓度的携抗PSMA多肽的超声-磁共振双模态靶向造影剂，在注射造影剂前及注射后2小时、6小时及12小时行磁共振T2加权成像，分析并比较注射不同浓度造影剂后裸鼠皮下移植瘤的相对增强强度（RSE）。采用磁共振体内成像实验所得的最佳浓度对LNCaP荷瘤裸鼠行超声造影检查，评估该浓度的体内超声成像效果。 结果：LNCaP荷瘤裸鼠在注射携抗PSMA多肽的超声-磁共振双模态靶向造影剂后肿瘤内磁共振T2信号减低，浓度为12mg/ml的携抗PSMA多肽的超声－磁共振双模态靶向造影剂磁共振增强效果最佳，注射后2小时、6小时及12小时RSE值分别为19.9±3.4%、34.3±3.6%及30.9±1.4%。体内超声成像实验发现注射浓度为12mg/ml的双模态靶向造影剂后裸鼠皮下移植肿瘤呈均匀的高增强。结论：裸鼠体内磁共振的增强效果与携抗PSMA多肽的超声－磁共振双模态靶向造影剂浓度相关，浓度为12mg/ml的造影剂体内磁共振及超声成像效果俱佳。 第二部分：携抗PSMA多肽的超声－磁共振双模态靶向造影剂的体内靶向成像实验 目的：研究携抗PSMA多肽的超声－磁共振双模态靶向造影剂的体内超声/磁共振双模态靶向显像能力。 材料与方法：在体内超声/磁共振双模态靶向显像实验中，我们将实验动物分为以下四组：LNCaP荷瘤裸鼠注射携抗PSMA多肽的超声-磁共振双模态靶向造影剂，LNCaP荷瘤裸鼠注射普通超声-磁共振双模态造影剂，抗体封闭的LNCaP荷瘤裸鼠注射携抗PSMA多肽的超声-磁共振双模态靶向造影剂，PC3荷瘤裸鼠注射携抗PSMA多肽的超声－磁共振双模态靶向造影剂。在注射造影剂前及注射后2小时、6小时、12小时及24小时行磁共振T2加权成像，分析并比较裸鼠皮下移植瘤的肿瘤相对增强强度（RSE）。在注射造影剂后即刻行超声成像，分析并比较裸鼠皮下移植瘤的造影剂到达时间（AT）、达峰时间（TTP）及峰值强度（PI）。完成靶向成像后将裸鼠行安乐死，收集裸鼠肿瘤，通过病理检查研究肿瘤镜下形态、PSMA表达情况及与造影剂靶向结合情况。 结果：磁共振成像发现LNCaP荷瘤裸鼠在注射双模态靶向造影剂后肿瘤内T2信号明显降低，注射后2小时、6小时、12小时及24小时的RSE值分别为41.0±1.9%、28.2±6.5%、21.4±5.0%及16.2±3.6，明显高于对照组及竞争组（P<0.05），RSE在注射造影剂后2小时达到峰值。在体内超声成像实验中，LNCaP荷瘤裸鼠在注射携抗PSMA多肽的超声－磁共振双模态靶向造影剂后肿瘤PI值为8.9±1.7dB，明显高于三组对照组（5.6±1.7dB、6.9±1.2dB及7.0±1.4，P<0.05），四组之间的造影剂AT及TTP无显著差异。病理HE染色结果显示所有肿瘤均未见到明显的出血坏死。免疫组化染色证实了LNCaP移植瘤表达PSMA而PC3移植瘤不表达PSMA。病理普鲁士蓝染色发现LNCaP荷瘤裸鼠在注射携抗PSMA多肽的超声－磁共振双模态靶向造影剂后肿瘤组织内可见蓝染颗粒，而三组对照组在注射造影剂后肿瘤组织内未见到明显蓝染颗粒。 结论：携抗PSMA多肽的超声－磁共振双模态靶向造影剂能通过与PSMA靶向结合来特异性增强前列腺癌组织的超声及磁共振成像图像。 第三部分：携抗PSMA多肽的超声－磁共振双模态靶向造影剂的体内生物分布研究 目的：研究携抗PSMA多肽的超声－磁共振双模态靶向造影剂的体内生物分布。 材料与方法：采用电感耦合等离子体原子发射光谱法(inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy，ICP-AES)技术检测裸鼠在注射携抗PSMA多肽的超声－磁共振双模态靶向造影剂前及注射后2小时、6小时、12小时及24小时各主要脏器的铁元素含量。在裸鼠注射携抗PSMA多肽的超声－磁共振双模态靶向造影剂前及注射后2小时、6小时、 收起