摘要: 肺癌是目前全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率增长最快。我国男性肺癌的新发病例和死亡率不断攀升，居所有恶性肿瘤之首，女性死亡率第一，发病率屈居乳腺癌之下。其特征是手术后存活率低，复发率高。根据肺癌细胞的分化程度和形态特征将其... 展开 肺癌是目前全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率增长最快。我国男性肺癌的新发病例和死亡率不断攀升，居所有恶性肿瘤之首，女性死亡率第一，发病率屈居乳腺癌之下。其特征是手术后存活率低，复发率高。根据肺癌细胞的分化程度和形态特征将其分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌两种类型，NSCLC是最常见的类型，包括肺鳞癌、肺腺癌，腺鳞癌，大细胞肺癌等，占所有病例的约80％。现阶段临床上对于NSCLC主要采取手术联合化疗的方法，但肿瘤浸润和远处转移仍是NSCLC治疗失败的主要因素。 MiRNAs与各种类型的癌症相关，涉及许多重要的生理和病理过程，包括发育，分化和肿瘤发生。miRNA通过结合mRNA的3'-UTRs使其降解或抑制其翻译从而抑制蛋白质的合成。miR-29a作为几类癌症的抑癌基因，可以通过调控靶基因的表达从而影响肿瘤的细胞增殖，侵袭，迁移和凋亡。迄今为止，已将一些基因鉴定为miR-29a的靶基因，包括CDC42，CLDN1，c-MYC，KDM5B，TNFR等。然而，miR-29a调节肺癌发生的功能和潜在机制尚待进一步研究。 NRAS是原癌基因RAS中的一员，经常在多种人类肿瘤中被激活成致癌状态。NRAS在各种癌症中都有功能改变，致癌性NRAS通过激活多种下游通路促进肿瘤发生，包括PI3K/AKT，MAPK/ERK和NF-κB通路。因此，NRAS沉默已经成为肿瘤中有效的治疗策略，但仍然远未达到最佳状态，迫切需要新的治疗策略。 目的: 目前已知miR-29a可通过影响不同的信号途径在肺癌中发挥作用，本研究探讨了miR-29a在非小细胞肺癌中的作用以及其分子机制和细胞机理，以及其与患者临床参数的相关性，研究了miR-29a的过表达如何影响肺癌细胞的增殖，侵袭和迁移，并从动物水平进行了验证。同时讨论了过表达miR-29a的肺癌细胞对顺铂的药物敏感性的改变。我们的研究结果揭示了miR-29a在肺癌中作用的新机制，并为开发基于miR-29a的治疗新策略提供了依据。 方法: (1)共采集了38例NSCLC样本及癌旁对照组织，荧光定量PCR检测miR-29a在肺癌组织及癌旁组织中的表达水平，并分析miR-29a与NSCLC患者的临床参数的相关性。 (2)用慢病毒包装质粒并感染人肺癌H1299和A549细胞，经嘌呤霉素筛选后建立稳定过表达miR-29a或miR-NC的细胞株。提取各细胞株的总RNA并用qRT-PCR方法检测miR-29a的表达水平，CCK-8法检测转染后的细胞增殖活性，并进行体外集落形成的测定，transwell小室检测细胞的侵袭和迁移能力。 (3)运用生物信息软件筛选miR-29a的靶基因。qRT-PCR方法检测NRAS在人正常组织和肺癌组织中的表达水平，并对miR-29a和NRAS的表达水平进行了相关性分析。构建NRAS野生型(WT)质粒和NRAS突变型(MT)质粒，将这两种质粒加上miR-29a或miR-NC模拟物共转染H1299肺癌细胞，48小时后检测荧光素酶活性。瞬时转染法将miR-29a或miR-NC分别转染H1299和A549肺癌细胞株，western blot法检测NRAS蛋白水平。 (4)用CCK8试剂盒检测不同顺铂浓度下各细胞株的增殖活性。在顺铂浓度为5μM的条件下检测H1299/miR-29a，对照组以及过表达NRAS的H1299/miR-29a的各组肺癌细胞增殖活性。流式细胞术检测细胞凋亡率，并用半胱天冬酶-3活性试剂盒检测半胱天冬酶-3的活性。 (5)建立裸鼠皮下成瘤模型，检测H1299/miR-29a和H1299/miR-NC细胞的成瘤性，定时测量瘤块的体积，绘制生长曲线。并通过荧光定量PCR和Western blot检测皮下移植瘤中NRAS的mRNA和蛋白表达水平。 结果: (1)荧光定量PCR显示miR-29a在肺癌组织中的表达水平显著低于正常组织，Ⅲ-Ⅳ期肺癌组织中miR-29a的表达水平明显低于Ⅰ期和Ⅱ期。临床参数相关性分析表明，miR-29a的表达水平与肿瘤TNM分期有关，与性别/年龄无关。 (2)用含有miR-29a或miR-NC的慢病毒构建体感染H1299和A549细胞，并用嘌呤霉素进行筛选，构建了稳定表达miR-29a/miR-NC的细胞株。结果表明，过表达miR-29a可以抑制肺癌H1299和A549细胞的增殖活性和体外集落的形成，同时显著降低肺癌细胞的侵袭和迁移能力。 (3)双荧光酶素报告基因检测结果显示过表达miR-29a使含有NRAS3'-UTRWT报告基因的荧光素酶活性下降了65％，而对NRAS3'-UTR MT报告基因的荧光素酶活性无明显影响，初步提示NRAS为miR-29a的靶基因。蛋白质印迹结果显示NRAS的蛋白水平在过表达miR-29a的H1299和A549细胞中下调，证明NRAS是miR-29a直接作用的靶基因。荧光定量PCR检测NSCLC肺癌标本中NRAS基因的表达水平显著高于相应正常组织样本，Spearman等级相关分析显示，NRAS和miR-29a在肺癌组织中的表达水平呈负相关。 (4)MiR-29a的过表达显著增强了H1299细胞对顺铂的化疗敏感性，与顺铂联合治疗显著诱导细胞凋亡，NRAS的强制表达则部分逆转了miR-29a诱导的顺铂对肺癌细胞的作用。与单独的miR-29a或顺铂治疗相比，miR-29a和顺铂联合治疗后，半胱天冬酶-3的活性显着增强，而NRAS的强制表达则减弱了治疗期间激活的半胱天冬酶-3。 (5)裸鼠皮下成瘤模型表明，miR-29a过表达组的皮下移植瘤中，NRAS mRNA和蛋白含量较对照组均明显降低。MiR-29a通过靶向NRAS降低了小鼠体内肿瘤的生长速率，减轻了瘤负荷。 结论: MiR-29a在肺癌组织发挥抑癌作用，在NSCLC组织中低表达，通过靶基因NRAS来抑制肺癌细胞的增殖、侵袭、迁移以及抑制肿瘤生长，并增强肺癌细胞对顺铂的药物敏感性。 收起