摘要: 湖羊是世界著名的绵羊品种，不仅繁殖性能优势突出，而且肉骨比高，肉质细嫩、多汁，深受大众喜爱。然而，由于市场对湖羊开发利用的不足、湖羊个体生长发育速度较慢以及盲目建立杂交体系等问题，不断制约湖羊肉质性状的开发利用。因此，科学地开展湖... 展开 湖羊是世界著名的绵羊品种，不仅繁殖性能优势突出，而且肉骨比高，肉质细嫩、多汁，深受大众喜爱。然而，由于市场对湖羊开发利用的不足、湖羊个体生长发育速度较慢以及盲目建立杂交体系等问题，不断制约湖羊肉质性状的开发利用。因此，科学地开展湖羊肉质性状调控机制的研究具有重大意义。 本课题组前期的研究已经发现，YAP1基因作为Hippo通道中的主效基因，在肌肉生长发育过程中扮演重要的角色。在此基础上，本研究通过多层次的生物信息学分析，共获取miRNA-200、miRNA-181a、miRNA-29a以及miRNA-541-3p四种可能与湖羊YAP1基因存在靶向结合位点的miRNA;利用RT-qPCR技术发现miRNA-181a、miRNA-29a及miRNA-541-3p在湖羊背最长肌组织中6月龄的相对表达量极显著高于1月龄，这3种miRNA可能对湖羊肌肉细胞增殖起负调控作用;综合前人研究进展，已有研究报道发现miRNA-29a与骨骼肌生长发育相关，因而选择miRNA-29a作为研究对象，进一步探究其在湖羊肌肉细胞增殖中的作用机理。 在miRNA-29a与YAP1的靶向验证过程中，通过转染浓度为20nM的miRNA-29a模拟物和抑制物，发现在6孔板中miRNA-29a模拟物的最适添加量为4μL，miRNA-29a抑制物的最适添加量为8μL;成功构建YAP1的野生载体和突变载体;由双荧光素酶报告基因法结果显示共转染miRNA-29a mimic与野生型载体wild组的荧光素酶的相对活性显著低于对照组，表明miRNA-29a与YAP1基因存在靶向结合位点;RT-qPCR技术的结果显示miRNA-29a在过表达条件下，YAP1、MyoG、MyoD以及MyHC基因的相对表达水平均极显著低于对照组，在miRNA-29a抑制条件下，YAP1和MyoG的相对表达水平均极显著高于对照组，而MyHC基因的相对表达量均显著高于对照组，MyoD与对照组差异不显著;CCK-8检测结果表明miRNA-29a的过表达显著降低湖羊肌卫星细胞的增殖水平，miRNA-29a的降低显著提高细胞增殖水平。试验结果进一步证实YAP1为miRNA-29a的靶基因，且miRNA-29a可能对湖羊肌肉细胞增殖起抑制作用。 运用在线网站进行生物信息学预测共发现LNCRNA-TCONS_00153891与miRNA-29a存在3个结合位点，并根据3个结合位点制作相应的干扰RNA(siRNA-1、siRNA-2与siRNA-3);过表达LNCRNA-TCONS_00153891组的miRNA-29a相对表达量显著低于阴性对照组，而3个结合位点中只有siRNA-1组与siRNA-3组的miRNA-29a相对表达量极显著高于阴性对照组;只有共转染miRNA-29a mimic与突变载体Mutant-3组的相对荧光素酶活性与对照组相比差异不显著，表明Mutant-3的突变位点为miRNA-29a与YAP1基因的靶标特异位点;过表达LNCRNA-TCONS_00153891后，YAP1、MyoG、MyoD以及MyHC基因的相对表达水平均极显著高于对照组，只有在siRNA-3干扰条件下，YAP1、MyoG和MyoD基因的相对表达水平均显著低于对照组;通过CCK-8技术发现LNCRNA-TCONS_00153891+miRNA-29a inhibitor组的湖羊骨骼肌卫星细胞增殖水平显著高于其他3组，而只有siRNA-3干扰组中，siRNA-3-NC+miRNA-29a inhibitor组的湖羊骨骼肌卫星细胞增殖水平均显著高于其他3组;在肌卫星细胞中miRNA-29a过表达和抑制条件下，YAP1及与肌肉相关基因蛋白表达量较阴性对照组蛋白浓度分别为更低与更高;过表达LNCRNA-TCONS_00153891组中YAP1及与肌肉相关基因蛋白表达水平均高于阴性对照组中蛋白水平，转染miRNA-29a inhibitor组的YAP1及与肌肉相关基因的蛋白水平显著高于miRNA-29a mimic转染组。结果表明siRNA-3的干扰位点为LNCRNA-TCONS_00153891与miRNA-29a的结合位点，LNCRNA-TCONS_00153891可作为ceRNA，抑制miRNA-29a从而上调YAP1，对湖羊肌肉细胞增殖起主要的促进作用。 收起