摘要: 湖羊是我国珍稀的少数几个高繁殖力绵羊品种之一，同时也是农业部首批138个国家级畜禽遗传资源保护品种之一，产于太湖流域，具有产羔多、全年发情、早期生长快、性成熟早、耐湿热、宜舍饲和肉质细嫩鲜美等特点。揭示湖羊高繁殖力性状形成的分子机理，... 展开 湖羊是我国珍稀的少数几个高繁殖力绵羊品种之一，同时也是农业部首批138个国家级畜禽遗传资源保护品种之一，产于太湖流域，具有产羔多、全年发情、早期生长快、性成熟早、耐湿热、宜舍饲和肉质细嫩鲜美等特点。揭示湖羊高繁殖力性状形成的分子机理，筛选影响湖羊多胎性状的关键基因和功能SNP，对湖羊高繁殖力优良种质特性的保护和创新利用等具有重要的意义。本研究以湖羊为研究对象，采用PCR扩增及克隆测序技术分别得到湖羊FSHR和TGF-β1基因编码区序列，采用生物信息学软件对其序列特征进行分析;克隆湖羊FSHR和TGF-β1基因5'调控区序列，构建缺失表达载体，利用荧光素酶报告基因系统筛选其核心启动子区;通过对多、单羔组湖羊FSHR和TGF-β1基因核心启动子区测序筛选SNP，并分析核心启动子区的表达调控。研究结果为探索湖羊卵泡颗粒细胞中FSHR和TGF-β1基因表达调控机制，揭示湖羊高繁殖力性状形成的分子机制等提供理论依据。 全文主要研究结果如下: (1)通过克隆测序获得了湖羊FSHR基因编码区全序列，全长为2088 bp，编码蛋白含有696个氨基酸残基，同源性比对发现其氨基酸序列与其它哺乳动物的一致性在75-97％之间。结构域预测发现湖羊FSHR蛋白含有典型的LRR结构域。研究结果说明湖羊与哺乳动物其它物种FSHR基因在进化上是比较保守的，推测湖羊FSHR基因与哺乳动物其它物种一样，在卵泡发育中发挥重要作用。 (2)通过克隆测序获得了湖羊FSHR基因5'调控区序列，长度为1920bp。构建湖羊FSHR基因5'调控区3个缺失表达载体（pFSHR-497、pFSHR-735、pFSHR-1459，并瞬时转染COV434细胞和COS-7，荧光素酶活性检测发现pFSHR-735载体的荧光素酶活性极显著高于其他载体(P＜0.01)，说明湖羊FSHR基因核心启动子区位于-743nt～-505nt。生物信息学发现核心启动子区含有YY1、AP-1、USF、Sp1及HSF等多个转录因子结合位点。 (3)通过对多、单羔组DNA池测序在湖羊FSHR基因核心启动子区-575nt处发现一个SNP即-575A＞G突变位点。为了进一步研究湖羊FSHR基因核心启动子区-575A＞G突变对启动子区活性的影响及其机制，我们构建了野生型（AA）与突变型(GG)启动子区荧光素酶报告基因载体（pFSHR-AA和pFSHR-GG），瞬时转染COV434和COS-7细胞细胞，结果发现突变型启动子区活性显著低于与野生型(P＜0.05)。生物信息学分析发现在湖羊FSHR基因核心启动子区含有转录因子YY1结合位点，了验证转录因子YY1对湖羊FSHR基因转录的调控，我们将转录因子YY1的过表达载体pUC57-YY1与pFSHR-AA共转染COV434细胞，荧光素酶表达活性发现转录因子YY1过表达后，FSHR基因启动子区活性极显著上升(P＜0.01)。另外，湖羊FSHR基因核心启动子区-575A＞G突变使突变型启动子区增加了一个新的CpG位点，为了分析DNA甲基化对突变型启动子区活性的影响，我们用体外甲基转移酶M.SssI处理pFSHR-GG，使CpG位点甲基化，并瞬时转染COV434细胞，荧光素酶活性分析发现-575nt处CpG位点甲基化后启动子区活性极显著下降(P＜0.01)。研究结果说明湖羊FSHR基因核心启动子区活性受碱基突变、转录因子YY1和DNA甲基化调控。 (4)通过克隆测序获得了湖羊TGF-β1基因编码区全序列，全长为1173 bp，编码蛋白含有390个氨基酸残基，同源性比对发现其氨基酸序列与其它哺乳动物的一致性在89-99％之间。结构域预测发现湖羊TGF-β1蛋白含有典型的TGF-β前肽(Ala28-Met261)和TGF-β like(Glu290-Ser390)等结构域。研究结果说明湖羊与哺乳动物其它物种TGF-β1基因在进化上是比较保守的，推测湖羊TGF-β1基因与哺乳动物其它物种一样，在卵泡发育和排卵中发挥重要作用。 (5)通过克隆测序获得了湖羊TGF-β1基因5'调控区序列，长度为1620bp。构建湖羊TGF-β1基因5'调控区4个缺失表达载体(pTGF-β1-188、pTGF-β1-341、pTGF-β1-540和pTGF-β1-1571)，瞬时转染COV434细胞，荧光素酶活性检测发现pTGF-β1-540载体的荧光素酶活性极显著高于其他载体，说明湖羊TGF-β1基因核心启动子区位于-439nt～-638nt。生物信息学发现核心启动子区含有HSF、Sp1、AP-2、ADR1及HSF2等转录因子结合位点。遗憾的是，多、单羔组DNA池测序并未在湖羊TGF-β1基因核心启动子区中发现SNP。 收起