摘要: 湖羊是我国优质的地方绵羊品种，具有多胎、生长快、耐湿热等诸多优点，其中多胎性能尤为突出，因此多胎机制一直是湖羊特色性状研究和应用的热点。FSHR是哺乳动物多胎性状的主效基因，调控卵泡发育和排卵，且其表达水平和单核苷酸多态性与湖羊多胎性... 展开 湖羊是我国优质的地方绵羊品种，具有多胎、生长快、耐湿热等诸多优点，其中多胎性能尤为突出，因此多胎机制一直是湖羊特色性状研究和应用的热点。FSHR是哺乳动物多胎性状的主效基因，调控卵泡发育和排卵，且其表达水平和单核苷酸多态性与湖羊多胎性状关系密切。本研究拟以湖羊FSHR基因非编码区(5'-UTR和3'-UTR)为研究对象，采用克隆测序技术获得湖羊FSHR基因非编码区序列，并采用生物信息学软件对其序列特征进行分析;采用荧光素酶报告基因系统、EMSA和过表达等技术分析转录因子、突变和miRNA对湖羊FSHR基因转录活性的调控及其机制。研究结果为探索湖羊FSHR基因表达调控机制，进一步揭示湖羊多胎性状形成机制等提供理论依据。 全文主要研究结果如下: (1)湖羊FSHR基因5'-UTR克隆与分析 通过克隆测序获得了730bp的湖羊FSHR基因5'侧翼序列，其中5'-UTR全长为161bp。同源性对比发现湖羊FSHR基因5'-UTR序列与Texel羊的一致性为100％，与哺乳动物其它物种如牛和小鼠等在进化上也比较保守。转录因子结合位点预测显示，在湖羊FSHR基因5'-UTR中含有多个转录因子（如IRF-1、Sp-1、E4F、PAX4、GATA2等）结合位点，其中转录因子PAX4(paired box4)对哺乳动物FSHR基因转录调控的研究还未见报道。 (2)转录因子PAX4调控湖羊FSHR基因转录活性 组织表达谱发现转录因子PAX4在湖羊心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、大肠、小肠、子宫和卵巢等组织中均有表达，其中在卵巢组织中中等表达。构建湖羊PAX4过表达载体pcDNA3.1-PAX4，并转染卵巢颗粒细胞，流式细胞术检测显示PAX4可显著促进颗粒细胞凋亡，说明PAX4为卵巢颗粒细胞的促凋亡因子。pcDNA3.1-PAX4与FSHR基因5'-UTR双荧光报告载体pGL3-730共转颗粒细胞和COS7细胞，结果发现PAX4可显著下调pGL3-730的荧光素酶活性，说明PAX4可抑制湖羊FSHR基因的转录活性。EMSA结果发现在湖羊卵巢组织中PAX4蛋白可与FSHR基因5'-UTR结合。研究结果表明转录因子PAX4靶向结合FSHR基因5'-UTR，显著下调FSHR的转录活性，进而促进颗粒细胞凋亡。 （3)湖羊FSHR基因3'-UTR克隆与序列分析 通过克隆测序获得了湖羊FSHR基因3'-UTR序列，序列长度为877bp。同源性分析发现湖羊FSHR基因3'-UTR序列与Texel羊的一致性为99.12％，与哺乳动物其它物种如牛和人等也较为保守。进一步分析发现在*290nt～*294nt处存在一个加尾信号(ATAAA)，在*105nt～*109nt和*462nt～*466nt处发现两个ARE元件。miRNA结合位点预测发现，在湖羊FSHR基因3'-UTR中存在7个潜在的miRNA结合位点，结合的miRNAs分别是miR-633、miR-126*、miR-2352、miR-539-5p、miR-145-5p和miR-96。 (4)3'-UTR碱基突变影响湖羊FSHR基因转录活性 通过池DNA测序发现湖羊3'-UTR区存在三个SNP位点，并分别命名为*88A＞G、*158C＞A和*159T＞G（后两个位点完全连锁，合称为*158C＞A）。分别构建两个位点的pmir-GLO双荧光报告重组载体，并转染293T细胞，结果发现:在*88A＞G位点，A型载体的荧光素酶活性显著高于G型;在*158C＞A位点，C型载体的荧光素酶活性显著高于A型，说明2个位点碱基突变均可影响湖羊FSHR基因的转录活性。放线菌素D(Act D)处理后0h、1h、2h、3h和4h，qRT-PCR检测荧光素酶基因水平，结果显示*88A＞G位点的A型载体荧光索酶基因mRNA半衰期(1.15h)高于G型(0.42h),*158C＞A位点的C型(1.15h)高于A型(0.51h)，说明2个位点碱基突变均可通过影响mRNA的稳定性影响湖羊FSHR基因的转录活性。构建2个突变位点的ARE元件突变型双荧光报告重组载体，并转染293T细胞，结果发现:ARE1突变后，两个位点的不同基因型载体的荧光素酶活性均差异不显著，说明2个位点碱基突变均可通过ARE1元件影响mRNA的稳定性，进而影响湖羊FSHR基因的转录活性。 (5)miRNA对湖羊FSHR基因的靶向调控 通过在线软件预测发现*158C＞A位点位于miR-633在湖羊FSHR基因3'-UTR的结合位点内。合成miR-633mimics，分别与C、A型pmir-GLO双荧光报告重组载体共转293T细胞，荧光素酶活性分析显示miR-633可同时显著下调两型载体的转录活性，且差异不显著，说明miR-633可靶向抑制湖羊FSHR基因，但不参与*158C＞A突变对其转录活性的调控。 收起