摘要: GDF9和BMP15基因是影响绵羊高繁殖力性状的主效基因，二者均在卵巢卵母细胞中特异表达，对卵泡发育、颗粒细胞增殖和排卵均发挥重要的调控作用。目前在国外绵羊品种GDF9和BMP15基因编码区分别发现了多个与高繁殖性状相关的SNPs位点，但这些SNPs均与我... 展开 GDF9和BMP15基因是影响绵羊高繁殖力性状的主效基因，二者均在卵巢卵母细胞中特异表达，对卵泡发育、颗粒细胞增殖和排卵均发挥重要的调控作用。目前在国外绵羊品种GDF9和BMP15基因编码区分别发现了多个与高繁殖性状相关的SNPs位点，但这些SNPs均与我国著名的高繁殖力品种湖羊无显著关联。为了进一步明确GDF9和BMP15基因与湖羊高繁殖力的关系，本研究以湖羊和巴什拜羊为研究对象，分离GDF9基因组序列、BMP15基因编码区和5调控区序列，并分析相应序列特征;筛选2个群体中GDF9基因组序列、BMP15基因编码区和5'调控区序列SNPs位点;分析SNPs位点多态性与湖羊产羔数的关系;采用荧光素酶报告基因系统分析SNPs对启动子区的影响和机制。研究结果为探索绵羊GDF9和BMP15与绵羊繁殖性能的潜在关系，筛选影响湖羊高繁殖力性状的分子标记等提供理论依据。 全文主要研究结果如下: (1)湖羊和巴什拜羊GDF9基因组序列特征 通过PCR和测序获得了湖羊和巴什拜羊GDF9基因组序列，全长均为5150bp，包括5'调控区、2个外显子、1个内含子和3'调控区。在GDF9基因5'调控区预测到3个潜在的启动子区，分别位于-1129nt--1079nt、-633nt--583nt和-270nt--220nt处。转录因子结合位点预测发现在GDF9基因5'调控区中含有多个转录因子结合位点，如GATA4、SOX8、YY1、HSF1、AP1、OCT1、SOX1和PTF1等，其中GATA4、YY1和HSF1等已证实与卵泡发育有关。湖羊和巴什拜羊GDF9基因编码区长度均为1362bp，编码蛋白均含有453个氨基酸，与其它哺乳动物的序列一致性均较高。结构域预测发现GDF9蛋白含有典型的TGF-(a)结构域。M1-S32位氨基酸为GDF9蛋白可能的信号肽序列。三级结构预测发现GDF9蛋白主要由2个á-螺旋和6个(a)-折叠组成。在GDF9基因3'调控区预测到5处可能的miRNA结合位点，结合的miRNA包括miR-515-5p、let-7e-3p和let-7a-2-3p，这3种miRNA均与卵泡发育有关。 (2)湖羊和巴什拜羊GDF9基因SNPs位点多态性与产羔数的关系 利用DNA池测序技术，在湖羊和巴什拜羊GDF9基因组序列中发现5个SNPs位点，其中编码区1个（1599A＞G，未引起氨基酸改变）、5'调控区3个（-534A＞G、-407T＞G和-332C＞T，其中-534A＞G引起转录因子OCT1结合位点改变）和3'调控区1个(2547A＞G，未发现miRNA结合位点改变)。在湖羊和巴什拜羊群体中，GDF9基因启动区3个SNPs位点完全连锁，将野生单倍型A-T-C命名为A，突变单倍型G-G-T命名为B。在湖羊中和巴什拜羊群体中均检测到3种基因型(AA型、AB型和BB型)，其中AA型为优势基因型（频率分别为0.6292和0.6420），A为优势等位基因（频率分别为0.7921和0.7840）。关联分析发现，AA型和AB型湖羊平均产羔数均显著高于BB型。荧光素酶活性型分析发现A型启动子区活性与B型无显著差异，而与转录因子OCT1表达载体共转后，B型启动子区活性比A型启动子区活性有极显著降低，说明-534A＞G突变可能影响转录因子OCT1与之结合，进而影响启动子区活性。体外试验发现过表达OCT1后卵泡颗粒细胞凋亡率极显著升高，说明转录因子OCT1可促进卵泡颗粒细胞凋亡。 (3)湖羊和巴什拜羊BMP15基因组序列特征 通过PCR和测序获得湖羊和巴什拜羊BMP15基因编码区序列，长度均为1182 bp（二者同源性为99.92％），编码蛋白含393个氨基酸（二者同源性为100％），与其它哺乳动物的序列一致性较高。结构域预测发现BMP15蛋白含有典型的TGF-(a)结构域。M1-M24位氨基酸残基为BMP15蛋白可能的信号肽，三级结构预测发现BMP15蛋白主要由2个á-螺旋和6个(a)-折叠组成。通过PCR和测序获得1806bp湖羊和巴什拜羊BMP15基因5调控区序列，启动子预测显示在BMP15基因-1617nt--1568nt处存在可能的启动子区，生物信息学分析发现在BMP15基因5'调控区中含有多个转录因子结合位点，如HSF、CdxA、OCT-1、SRY、SOX-5、GATA-1、AP-1、NIT-2和GATA-2等，其中HSF、OCT-1和Sp1等已证实与卵泡发育有关。 (4)湖羊和巴什拜羊BMP15基因组c.-1760C＞A变异与启动子区活性的关系 通过DNA池测序方法在湖羊和巴什拜羊BMP15基因编码区发现1个SNP位点（6355G＞A，但未引起氨基酸改变），在5'调控区发现5个突变位点（分别为-1760C＞A、-1548G＞A、-1146C＞T、-1145G＞A和-609G＞A）。BMP15基因-1760C＞A位点多态性分析发现湖羊中均为CC型，巴什拜羊中CC、CA和AA等3种基因型的频率分别为0.6154、0.3654和0.0192。荧光素酶活性分析发现野生型(CC)启动子区活性明显高于突变型（AA），但未达到显著水平(P=0.069)，说明-1760C＞A位点突变对绵羊BMP15基因的启动子区活性有一定的影响。 收起