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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 目的: 探讨miR-4664-3p在胃癌中的调控机制。 方法: 1、基于TCGA数据库下载胃癌患者相关临床病例资料和相应的miRNA数据。采用R语言对数据资料进行整理和统计学分析,利用单因素、多因素Cox回归分析筛选胃癌患者癌组织的差异表达miRNA,生存... 展开 目的: 探讨miR-4664-3p在胃癌中的调控机制。 方法: 1、基于TCGA数据库下载胃癌患者相关临床病例资料和相应的miRNA数据。采用R语言对数据资料进行整理和统计学分析,利用单因素、多因素Cox回归分析筛选胃癌患者癌组织的差异表达miRNA,生存分析采用Kaplan-Meier曲线。并基于TCGA数据库验证miR-4664在胃癌组织中的表达水平且与肿瘤的组织分级、有无淋巴结转移的关系。 2、采用实时荧光定量PCR法检测胃癌组织样本、胃正常组织细胞株(GES-1)和胃癌细胞株(AGS、SGC7901、MKN28、MKN45)中miR-4664-3p的表达水平,基于临床样本验证miR-4664-3p在胃癌组织中的表达水平且与肿瘤的组织分级、有无淋巴结转移的关系。采用荧光定量PCR检测沉默或过表达miR-4664-3p的功能影响。 采用CCK-8、划痕愈合、Transwell等试验研究miR-4664-3p在胃癌细胞增殖、迁移和侵袭过程中的作用。 3、使用miRDB(http://www.mirdb.org/miRDB/),TargetScan(http://www.targetscan.org/)和mirDIP(http://ophid.utoronto.ca/mirDIP/index.jsp)数据库等在线工具分析差异表达的miRNA的靶基因和分子通路预测。采用TargetScan在线预测软件预测miR-4664-3p可能与YAPI的靶向结合位点,采用荧光定量PCR和Western blot技术检测YAP1在胃癌组织和相应癌旁组织、不同的胃癌细胞系和胃正常细胞中mRNA表达水平和蛋白表达水平的差异以及YAP1表达与miR-4664-3p表达之间的相关性。采用双荧光素酶报告基因系统揭示miR-4664-3p与YAP1之间的靶向关系。采用荧光定量PCR检测YAP1脂质体转染siRNA沉默表达YAP1后miR-4664-3p的表达改变,采用荧光定量PCR检测过表达YAP1后miR-4664-3p的表达改变,采用荧光定量PCR和Western blot技术检测miR-4664-3p表达改变对YAP1的影响。利用CCK-8、划痕及Transwell等实验研究miR-4664-3p过表达及YAP1的过表达对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。 4、采用裸鼠移植瘤实验揭示miR-4664-3p和YAP1对荷瘤小鼠肿瘤发展的影响,分组构建miR-4664-3p和YAP1过表达慢病毒稳转株裸鼠皮下注射,测定肿瘤的大小,计算肿瘤体积的变化,处死小鼠后测定瘤体的重量。 结果: 1、基于TCGA数据库分析结果,单因素回归分析显示7个miRNA与胃癌患者生存相关,包括hsa-miR-4664,hsa-miR-548ba,hsa-miR-520c,hsa-miR-515-1,hsa-miR-519b,hsa-miR-520g,hsa-miR-523。多因素回归分析显示miR-4664是与胃癌患者生存显著相关的独立风险因素,K-M生存曲线显示miR-4664高表达,胃癌患者长期预后好,提示miR-4664的表达水平与胃癌患者的总体生存期存在正相关性。TCGA数据库验证miR-4664在胃癌组织中的表达水平显著低于对应的癌旁组织,且其表达水平与肿瘤的组织分级、有无淋巴结转移呈显著负性相关。采用临床样本进一步验证发现miR-4664-3p在胃癌组织中的相对表达水平显著低于癌旁组织,且miR-4664-3p的表达水平与患者的组织分级、有无淋巴结转移呈显著负性相关,与TCGA数据库验证结果保持一致。与胃正常组织细胞GES-1相比,胃癌细胞系AGS、SGC7901、MKN45、MKN28中的miR-4664-3p表达水平显著降低。 2、选择miR-4664-3p表达相对较高的胃癌细胞AGS和表达相对较低的胃癌细胞SGC7901进行后续实验,揭示miR-4664-3p对胃癌细胞恶性生物学行为的影响。在AGS细胞中转染miR-4664-3p inhibitor,提示抑制miR-4664-3p表达促进胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭;在SGC7901细胞中转染miR-4664-3p mimics,提示上调miR-4664-3p的表达则抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。 3、为了探索miR-4664-3p在胃痛中发挥作用的潜在的分子机制,我们通过miRDB,TargetScan和mirDIP数据库预测miR-4664-3p的靶基因,并与其表达相关的基因组取交集,得到YAP1基因。并采用TargetScan预测miR-4664-3p与YAP1的可能结合位点足YAP13''UIR区序列。在胃癌组织和胃癌细胞株分别检测YAP1的mRNA及蛋白表达水平,对比发现YAP1在胃癌组织的mRNA及蛋白水平显著高于相应癌旁组织,YAP1在胃癌细胞株(AGS、SGC7901、MKN45、MKN28)的mRNA及蛋白表达水平显著高于胃正常组织细胞GES-1,且胃癌组织和癌旁组织中YAP1的表达和miR-4664-3p表达之间存在显著负相关。荧光素酶报告基因显示在AGS细胞中,转染了沉默表达miR-4664-3p与YAP1-野生型的细胞与miR-NC阴性对照相比,荧光素酶活性显著升高,但沉默表达miR-4664-3p与YAP1-突变型组的细胞荧光素酶活性无显著变化;在SGC7901细胞中,转染了过表达miR-4664-3p与YAP1-野生型组的细胞与miR-NC阴性对照相比,荧光素酶活性显著下降,但过表达miR-4664-3p与YAP1-突变型组的细胞荧光素酶活性与miR-NC阴性对照组相比未发生显著变化,表明miR-4664-3p可直接靶向结合YAP1的3''UTR区。沉默表达YAP1后miR-4664-3p的表达改变无显著差异,过表达YAP1后miR-4664-3p的表达改变无显著差异,提示YAP1无法调控miR-4664-3p,YAP1是miR-4664-3p的下游调控因子。miR-4664-3p沉默表达,YAP1的mRNA和蛋白表达水平显著增加;miR-4664-3p过表达,YAP1的mRNA和蛋白表达水平显著降低。 4、为了验证miR-4664-3p是否通过YAP1发挥功能,SGC7901细胞共转染miR-4664-3p过表达和YAPI过表达质粒。结果显示YAP1的过表达可以削弱miR-4664-3p过表达对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用,miR-4664-3p的表达上调导致YAPI表达F降,蛋白水平检测发现E-cadherin上调,Ki67和N-cadherin下降。与仅转染miR-4664-3p过表达组相比,miR-4664-3p/YAP1过表达共转染组,YAP1表达上调,蛋白水平检测发现E-cadherin显著下降,Ki67和N-cadherin显著上调;而miR-4664-3p过表达和miR-4664-3p过表达转染空白质粒组E-cadherin,Ki67和N-cadherin并未发生显著变化,表明miR-4664-3p靶向作用至YAP1,调节胃癌关键蛋白的表达,进而调控胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭。 5、裸鼠移植瘤实验显示miR-4664-3p过表达组的活体瘤体积及重量均显著低于miR-NC空白对照组,而miR-4664-3p/YAP1过表达共转染组,活体瘤体积及重量均显著高于miR-4664-3p过表达组,与miR-NC空白对照组无显著差异,表明YAP1的过表达削弱miR-4664-3p过表达对瘤体的体积和重量的抑制作用。 结论: 1、本研究基于TCGA数据库,结合生物信息学分析技术,筛选出胃癌组织样本与正常组织样本存在差异表达的miRNA,发现miR-4664的表达水平显著降低,且其表达水平与患者的临床特征相关,miR-4664与胃癌患者长期生存显著相关,miR-4664高表达,胃癌预后好。分子生物学实验显示miR-4664-3p在胃癌组织和胃癌细胞系(AGS、SGC7901、MKN45和MKN28)中表达显著下降,且miR-4664-3p的表达水平与胃癌患者的组织分级、有无淋巴结转移呈显著负性相关。 2、miR-4664-3p沉默表达促进细胞的增殖、迁移和侵袭;miR-4664-3p过表达则抑制细胞的增殖、迁移和侵袭,表明miR-4664-3p对胃癌具有潜在的抑痛作用。 3、生物信息学分析结果提示YAPI基因的3''-UTR区含有miR-4664-3p的靶向结合位点,提示miR-4664-3p可能靶向作用于YAP1。胃癌组织和胃癌细胞中YAP1高表达,且胃癌组织和癌旁组织中YAP1表达和miR-4664-3p表达存在显著负相关,YAPI与miR-4664-3p存在直接靶向结合关系,而YAP1对miR-4664-3p无调控作用,且miR-4664-3p过表达敲降YAP1的表达水平,miR-4664-3p低表达增高YAP1的表达水平,提示:miR-4664-3p通过靶向下调YAPI的表达水平发挥作用。 4、体外实验表明miR-4664-3p/YAP1过表达共转染可阻断miR-4664-3p过表达对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。体内实验表明miR-4664-3p通过下调YAP1表达从而抑制肿瘤生长。 收起
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