摘要: 研究目的： 1.研究环状RNA circAFF2在人胃癌细胞、血清和组织中的表达，探讨circAFF2对胃癌细胞侵袭、迁移、增殖的影响； 2.研究环状RNA circAFF2在胃癌中发挥作用的分子机制。 研究方法： 1.通过Sanger测序、琼脂糖凝胶电泳以及RNase ... 展开 研究目的： 1.研究环状RNA circAFF2在人胃癌细胞、血清和组织中的表达，探讨circAFF2对胃癌细胞侵袭、迁移、增殖的影响； 2.研究环状RNA circAFF2在胃癌中发挥作用的分子机制。 研究方法： 1.通过Sanger测序、琼脂糖凝胶电泳以及RNase R鉴定环状RNA circAFF2的结构； 2.qRT-PCR检测circAFF2在正常人胃黏膜上皮细胞株(GES-1)、胃癌细胞株(BGC823，HGC27，MGC803，SGC7901)以及胃癌组织、血清中的表达水平，并分析临床病理特征与circAFF2表达量之间的关系。敲减胃癌细胞中circAFF2水平后，通过Transwell实验、CCK-8实验检测circAFF2对胃癌细胞侵袭、迁移、增殖的影响； 3.通过mirTarbase和Targetscan数据库预测、荧光素酶报告基因实验验证circAFF2与microRNA-6894-5p(miR‐6894-5p)、miR‐6894-5p与炭疽毒素受体1(ANTXR1)之间存在相互作用。通过斯皮尔曼相关曲线分析circAFF2与miR‐6894-5p、miR‐6894-5p与ANTXR1之间相关性。敲减circAFF2后，通过qRT-PCR分析胃癌细胞中miR‐6894-5p表达水平；过表达miR‐6894-5p后，用蛋白印迹法和qRT-PCR分析胃癌细胞中ANTXR1的表达。 4.用qRT-PCR分析miR‐6894-5p在GES-1以及胃癌细胞中表达水平。向胃癌细胞中单独转染circAFF2干扰RNA(si-circ)，或者共转染si-circ与miR‐6894-5p抑制剂(miR-inhi)后，通过Transwell实验、CCK-8实验分析其对胃癌细胞侵袭、迁移、增殖的影响，再次用qRT-PCR分析miR‐6894-5p在细胞中的表达情况。 5.向胃癌细胞中单独转染miR‐6894-5p模拟物（miR-mimics），或者共转染miR-mimics与ANTXR1过表达质粒后，通过Transwell实验、CCK-8实验分析对胃癌细胞侵袭、迁移、增殖的影响，蛋白印迹法分析ANTXR1在胃癌细胞中表达水平。 6.在裸鼠皮下注射胃癌BGC823细胞，分析si-circ对体内种植瘤的影响。通过蛋白印迹法，免疫组化检测种植瘤内ANTXR1表达水平。 研究结果： 1.Sanger测序、琼脂糖凝胶电泳以及RNase R鉴定结果显示RNA circAFF2为闭合环状结构。 2.qRT-PCR结果显示环状RNA circAFF2在胃癌细胞中表达量较GES-1细胞上调，在胃癌组织中表达量较癌旁组织上调，在胃癌患者术后血清中表达水平较术前低。统计学分析显示胃腺癌组织中circAFF2表达水平与TNM分期、浸润深度以及肿瘤大小有关。Transwell实验、CCK-8实验结果提示敲减胃癌细胞中circAFF2后，胃癌细胞侵袭、迁移、增殖能力均受到抑制。 3.荧光素酶报告基因实验证实circAFF2与miR‐6894-5p、miR‐6894-5p与ANTXR1均可以互相连接。统计学分析提示胃癌细胞中circAFF2与miR‐6894-5p、miR‐6894-5p与ANTXR1表达水平均呈负相关。敲减circAFF2后，qRT-PCR提示胃癌细胞中miR‐6894-5p表达上调。miR‐6894-5p被过表达以后，蛋白印迹和qRT-PCR结果提示胃癌细胞中ANTXR1表达下调。 4.qRT-PCR提示miR‐6894-5p在胃癌细胞中表达较GES-1细胞下调。向胃癌细胞中单独转染si-circ后，Transwell实验、CCK-8实验结果提示，胃癌细胞侵袭、迁移、增殖受到抑制；向胃癌细胞中共转染si-circ与miR-inhi后，CCK-8实验、Transwell实验显示，si-circ对胃癌细胞侵袭、迁移、增殖能力的抑制作用减弱，且qRT-PCR显示，miR‐6894-5p在胃癌细胞中表达较si-circ组下降。 5.向胃癌细胞中单独转染miR-mimics后，CCK-8实验、Transwell实验显示，胃癌细胞侵袭、迁移、增殖受到抑制；向胃癌细胞中共转染miR-mimics与ANTXR1过表达质粒后，miR-mimics对胃癌细胞侵袭、迁移、增殖的抑制作用减弱，且蛋白印迹法检测结果显示，胃癌细胞中ANTXR1表达水平较miR-mimics组升高。 6.BGC823细胞裸鼠体内种植瘤结果提示，si-circ组种植瘤生长较si-NC组明显受到抑制；免疫组化和蛋白印迹结果显示si-circ组种植瘤内ANTXR1表达量低于si-NC组。 研究结论： CircAFF2在胃腺癌组织、胃癌患者血清，胃癌细胞中表达升高，可能作为胃癌诊断和治疗的分子标志物；CircAFF2通过抑制miR‐6894-5p的表达，从而上调ANTXR1表达水平，最终促进胃癌细胞侵袭、迁移、增殖。 收起