摘要: 背景和目的： 肺癌是全球发病率第二、死亡率第一的恶性肿瘤，其发病率占癌症总发病率的11.4%，死亡人数占总死亡人数的18.0%。近年来随着诊断技术的提高以及胸腔镜、靶向及免疫治疗的使用，肺癌患者的生存率有着显著的提高，其3年生存率从2001年的... 展开 背景和目的： 肺癌是全球发病率第二、死亡率第一的恶性肿瘤，其发病率占癌症总发病率的11.4%，死亡人数占总死亡人数的18.0%。近年来随着诊断技术的提高以及胸腔镜、靶向及免疫治疗的使用，肺癌患者的生存率有着显著的提高，其3年生存率从2001年的19%上升到2004年的21%，再到2015年至2017年的31%，中位生存时间也从8个月增加到13个月。而在我国肺癌仍然是发病率以及死亡率最高的疾病，据估计2022年我国新发肺癌病例数约870982，占癌症总人数的18%，预计死亡人数占总死亡人数的23.9%。在肺癌中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占到绝大多数，所以其发生、发展的机制仍有待于进一步研究。 环状RNA是一类通过反向剪接等机制形成的环状非编码RNA，由于其特殊的环状结构，所以较线性的mRNA更能够耐受RNase R酶的消化，表达更加稳定。最近的研究表明在肿瘤中也发现了大量差异表达的环状RNA，其表达量与肿瘤的TNM分期显著相关，对肿瘤的增殖迁移以及侵袭能力有显著影响。随着研究的增加，大量环状RNA在肺癌中的作用被阐明，但是这些研究主要集中在miRNA海绵机制上，对于环状RNA与蛋白相互作用、翻译成蛋白等机制仍缺乏相关的研究。 为了进一步阐明环状RNA在肺癌中的作用，我们首先利用三对NSCLC及癌旁组织进行环状RNA的高通量测序，共发现环状RNA9442个，其中差异表达的1114个(|logFC|≥0.585；p＜0.05），通过与GSE112214取交集及qRT-PCR验证后，最终筛选到hsa_circ_0001523(circZNF608)进行后续研究，探讨其对NSCLC增殖迁移及侵袭等功能的影响，为肺癌提供潜在的治疗靶点。本课题分为下面四个部分进行： 第一部分 CircZNF608的筛选及临床相关性分析 方法： 1、在3对NSCLC及癌旁样本中进行环状RNA的高通量测序，并进行差异分析。 2、使用qRT-PCR在NSCLC样本中验证环状RNA的表达。 3、设计发散引物(divergent primers)及收敛引物(convergent primers)，在gDNA和cDNA中进行PCR扩增，通过凝胶电泳分离扩增产物，并送sanger测序，验证circZNF608的存在。 4、用放菌素D及RNase R酶分别处理NSCLC细胞系，检测circZNF608的半衰期及稳定性；用核质分提、荧光原位杂交实验(FISH)证明circZNF608的亚细胞定位。 5、收集上述35例病人的临床信息，分析circZNF608的表达量与临床病理特征之间的关系。 结果： 1、NSCLC中共检测到9442个环状RNA,其中86.6%是由外显子反向剪接而形成。差异表达的环状RNA有1114个，包括620个上调及494个下调。 2、通过与GSE112214取交集后，共得到三个下调的环状RNA，通过qRT-PCR验证发现，circZNF608在NSCLC中下调最为明显。 3、CircZNF608是由ZNF608基因的外显子2反向剪接形成，全长为256nt。 4、CircZNF608的半衰期超过12小时，能够耐受RNase R酶的消化，且主要分布于细胞质中。 5、CircZNF608的表达量与肿瘤的T分期显著相关。 结论： CircZNF608在NSCLC中显著下调，与T分期显著相关，并主要分布于细胞质中。 第二部分 CircZNF608对NSCLC细胞功能的影响 方法： 1、通过qRT-PCR检测正常支气管上皮细胞BEAS-2B及NSCLC细胞系中circZNF608的表达水平，利用慢病毒，构建circZNF608过表达及敲减的稳转株。并验证表达。 2、CCK8及EDU检测circZNF608对NSCLC细胞增殖能力的影响；使用划痕实验及Tranwell实验检测circZNF608对NSCLC细胞迁移及侵袭能力的影响。 3、使用过表达circZNF608的NSCLC细胞系，构建裸鼠皮下成瘤及肺转移的模型，观察在体内circZNF608对肿瘤细胞增殖、转移能力的影响 结果： 1、与正常支气管上皮相比，circZNF608在NSCLC细胞系中显著下调。 2、CircZNF608在体外显著抑制NSCLC细胞的增殖迁移及侵袭能力。 3、CircZNF608在体内显著抑制肿瘤的增殖及转移。 结论： CircZNF608显著抑制NSCLC细胞增殖迁移及侵袭能力。 第三部分 CircZNF608通过结合IGF2BP3发挥作用 方法： 1、使用CSCD及Circinteractome预测circZNF608能够结合的miRNAs，CSCD及Starbase预测circZNF608结合的RBPs，通过CircRNADb网站预测circZNF608编码蛋白的可能； 2、通过RNA pull-down及RIP实验证实circZNF608与蛋白的结合； 3、FISH、免疫荧光分别验证circZNF608、RBP的亚细胞定位； 4、从TCGA及CPTAC数据库下载NSCLC肿瘤转录组、蛋白组及临床信息，研究IGF2BP3在NSCLC中表达及与临床性状关系，通过Kaplan-Meier Plotter分析IGF2BP3与预后关系； 5、从xena browser网站下载泛癌数据，对IGF2BP3进行泛癌分析； 6、利用String数据库及Metascape数据库构建IGF2BP3的PPI互作图，并进行富集分析。 结果： 1、CircZNF608在NSCLC细胞中结合IGF2BP3； 2、CircZNF608及IGF2BP3共定位于细胞质； 3、IGF2BP3在NSCLC中显著高表达，且与肿瘤T、N分期及预后显著相关； 4、IGF2BP3在多种肿瘤中显著高表达，并与预后较差相关。 结论： CircZNF608通过结合IGF2BP3发挥作用。 第四部分 CircZNF608通过竞争性结合IGF2BP3下调MYC表达 方法： 1、使用实时定量PCR及WB验证IGF2BP3过表达及敲减的效率，CCK8及EDU检测NSCLC细胞增殖能力的改变；使用Tranwell实验及划痕实验检测NSCLC细胞迁移及侵袭能力的变化； 2、WB检测过表达或敲减circZNF608对IGF2BP3表达量影响，实时定量PCR验证IGF2BP3过表达或敲除对circZNF608表达影响； 3、catRAPID网站预测circZNF608与IGF2BP3的结合位点，通过构建带Flag标签的IGF2BP3截短质粒及RIP实验，证实circZNF608与IGF2BP3的结合位点； 4、利用GEO数据库数据、SRAMP网站及RMbase网站预测circZNF608上m6A甲基化修饰位点，通过MeRIP、RIP及荧光素酶报告基因实验验证； 5、通过查阅文献寻找IGF2BP3的靶基因，通过qPCR、WB验证circZNF608及IGF2BP3对靶基因的含量的影响； 6、利用RIP、放线菌素D及荧光素酶报告基因实验检测circZNF608对IGF2BP3结合MYC mRNA的影响； 7、Ualcan数据库分析基因在NSCLC中的差异表达及基因启动子甲基化水平。 结果： 1、IGF2BP3在体外显著促进NSCLC细胞增殖迁移及侵袭； 2、过表达circZNF608能够抑制IGF2BP3的促癌作用，敲减circZNF608能够拯救IGF2BP3降低后的抑制作用； 3、IGF2BP3和circZNF608两者在表达量上无明显相互影响； 4、CircZNF608结合IGF2BP3的KH3-4结构域； 5、CircZNF608通过m6A甲基化修饰与IGF2BP3结合； 6、CircZNF608竞争性结合IGF2BP3降低MYC表达； 7、CircZNF608降低IGF2BP3与MYC mRNA的结合及mRNA稳定性; 8、在NSCLC中DNMT1、DNMT3b表达增加，ZNF608基因启动子甲基化水平显著升高。 结论： CircZNF608通过m6A甲基化修饰竞争性结合IGF2BP3，下调NSCLC细胞中MYC表达。 收起