摘要: 哺乳动物骨骼肌的生成具有十分复杂的机理，生肌转录因子Smad3、生肌调节因子MyoD、抑肌素基因GDF-8等生肌因子在骨骼肌生成中均起到重要作用，对Smad3、MyoD和GDF-8三个基因调控网络的研究对骨骼肌生成机理及猪育种研究具有十分重要的意义。 抑肌... 展开 哺乳动物骨骼肌的生成具有十分复杂的机理，生肌转录因子Smad3、生肌调节因子MyoD、抑肌素基因GDF-8等生肌因子在骨骼肌生成中均起到重要作用，对Smad3、MyoD和GDF-8三个基因调控网络的研究对骨骼肌生成机理及猪育种研究具有十分重要的意义。 抑肌素GDF-8(又名Myostatin，MSTN)基因是TGF-β超家族的一员，是肌肉生长的负调控因子。GDF-8分泌到胞外后，与细胞膜上的受体发生相互作用，通过三种Smad蛋白的介导将信号转入细胞核，作用于靶基因的调控区。Smad3对细胞生长的作用是双向的，既有促进，也有抑制，具体机制目前尚未完全清楚。MyoD基因对生肌发生起重要调节作用，可促使某些细胞向骨骼肌细胞分化。 鉴于这三个基因在猪骨骼肌卫星细胞分化调控过程中的重要作用，本研究建立了猪骨骼肌卫星细胞系，利用RNAi技术和基因过量表达技术，以Smad3、MyoD和GDF-8基因为靶基因，研究三个基因对骨骼肌卫星细胞增殖的调控作用以及基因间的网络关系。主要研究结果如下： (1)根据Genbank上登录号为NM214137的猪Smad3基因CDS序列设计一对引物S3，以猪骨骼肌cDNA为模板，成功扩增出1278bp基因片段。与真核表达载体pcDNA3.1+连接后经测序以及PCR鉴定证实为目的片段。 (2)建立了稳定的猪骨骼肌卫星细胞体外培养体系，并从细胞形态、核型分析等方面对猪骨骼肌卫星细胞进行了鉴定。 (3)RNA干扰条件优化以及最佳干扰序列的筛选：利用RT-PCR方法，检测了Smad3、MyoD和GDF-8在体外培养的五个世代猪骨骼肌卫星细胞中的表达情况，发现三个基因的表达量均在第一、二代较高，与第三、四、五世代差异显著(P＜0.05)；成功地构建了带有荧光标记基因的表达载体psiSTRIKTMhMGFP，最佳转染体系DNA:Lipofectamine:Plus的比例为2:5:10；转染后的48h检测转染效率最高;针对Smad3基因的mRNA序列，分别在不同区域设计了三对特异性干扰序列，对其干扰效果进行比较，统计结果表明，三对特异性干扰序列均能显著降低Smad3基因的表达水平(P＜0.05)，其中第三对干扰序列干扰效果好于其它两对，非特异性序列并未引起GDF-8基因mRNA的表达下降(P＞0.05)。 (4)利用RNAi技术，研究了干扰Smad3、MyoD与GDF-8基因对猪骨骼肌卫星细胞增殖的影响，其中干扰Smad3基因对骨骼肌卫星细胞的增殖有促进作用(P＜0.05)，干扰MyoD组细胞的增殖能力未受到影响(P＞0.05)，而干扰GDF-8组细胞的增殖能力显著提高(P＜0.05)。 (5)利用RNAi技术，抑制了猪骨骼肌卫星细胞中Smad3、MyoD与GDF-8基因的表达。检测结果表明：Smad3基因表达下调后，MyoD基因的表达量显著升高(P＜0.05)，GDF-8基因的表达受到明显的抑制(P＜0.05)；MyoD基因表达下调后GDF-8基因表达显著降低(P＜0.05)，Smad3基因的表达量无显著变化(P＞0.05)；在干扰GDF-8基因使其表达下调后，MyoD表达量显著升高(P＜0.05)，Smad3基因的表达量明显下降(P＜0.05)。 (6)利用基因过量表达技术，在猪骨骼肌卫星细胞中使Smad3基因超表达。检测结表明，过量表达Smad3基因处理组细胞的增殖能力与对照组相比明显降低(P＜0.05);Smad3基因的表达上调后，MyoD基因的表达量随之下降，且显著低于正常细胞组(P＜0.05)，同时GDF-8基因的表达显著升高(P＜0.01)。 (7)综合研究成果，猪骨骼肌卫星细胞中Smad3、MyoD和GDF-8三基因的表达具有相关性，并初步绘制了Smad3、MyoD与GDF-8三个基因的调控网络图。 收起