摘要:
肺癌是常见的恶性肿瘤之一,近年高居癌症所致的死亡原因首位,严重危害人类健康,对世界范围公共卫生慢性非传染性疾病防治发起了严峻的挑战.近年来,一些在肺癌的发生发展中起着重要调控作用的新型分子被逐渐发现. 长链非编码RNA是一种长度超过两百个...
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肺癌是常见的恶性肿瘤之一,近年高居癌症所致的死亡原因首位,严重危害人类健康,对世界范围公共卫生慢性非传染性疾病防治发起了严峻的挑战.近年来,一些在肺癌的发生发展中起着重要调控作用的新型分子被逐渐发现. 长链非编码RNA是一种长度超过两百个核苷酸,缺乏蛋白编码能力的RNA转录本.长链非编码RNA在表观遗传水平、转录水平、转录后水平均可发挥重要的调控作用,参与多种重要的生物学功能.长链非编码RNA按基因定位大致可分为:正义链长链非编码RNA(Sense lncRNAs)、反义链长链非编码RNA(Antisense lncRNAs)、双向长链非编码RNA(Bidirectional lncRNAs)、基因间长链非编码RNA(Intergenic lncRNAs)及基因内长链非编码RNA(Intronic lncRNAs).反义长链非编码RNA是长链非编码RNA的一种,其同时也属于天然反义转录本(Natural antisense transcripts)的一种亚类,在哺乳动物中含量丰富,有多样的生物功能调节机制,并以此来发挥广泛的生物学功能.研究显示,反义长链非编码RNA常富集于编码基因的起始端或者末尾端,主要用其与编码基因天然配对的反义链或其他机制调控临近或者远端的编码基因表达. 课题组拟假设反义长链非编码RNA POSH2-AS1与肺癌发生发展相关,并拟通过扩大样本量检验POSH2-AS1在肺癌中的表达情况,构建POSH2-AS1高表达和低表达细胞模型,研究其肿瘤细胞生物学功能,通过生物信息学分析POSH2-AS1其潜在调控靶基因,探索其在肺癌发生发展中的功能及可能的作用机制,为肺癌的诊断和治疗提供科学依据. 目的: 探讨反义长链非编码RNA POSH2-AS1在肺癌中的表达模式、肿瘤生物学功能及机制. 方法: 1.在课题收集的共209例新诊断的华南及华东肺癌病例肺癌组织及癌旁正常肺组织样本中检测POSH2-AS1表达水平,并分析其在肺癌中的表达情况与肺癌病例临床特征的关系. 2.构建POSH2-AS1高表达和低表达人肺癌细胞系A549及PC-9模型以及相应的对照模型;采用CCK-8实验研究POSH2-AS1高表达、低表达对肺癌细胞系的增殖能力影响;采用平板克隆实验研究POSH2-AS1高表达、低表达对肺癌细胞的增殖能力和群体依赖性的影响;采用流式细胞仪研究POSH2-AS1高表达、低表达对肺癌细胞的周期和凋亡的影响;采用细胞迁移及侵袭实验研究POSH2-AS1高表达、低表达对肺癌细胞的迁移能力和侵袭能力的影响;采用裸鼠成瘤实验研究POSH2-AS1高表达、低表达对肺癌细胞体内成增殖成瘤能力的影响;采用肿瘤细胞裸鼠尾静脉注射实验研究POSH2-AS1高表达、低表达对肺癌细胞的体内转移能力的影响. 结果: 1.通过q-RT PCR检测POSH2-AS1表达水平,结果显示,与癌旁正常肺组织相比,POSH2-AS1在肺癌组织中呈低表达(P=0.004). 2.POSH2-AS1低表达与肺癌临床分期(Ⅰ+Ⅱvs.Ⅲ+Ⅳ,P=0.003)、原发灶大小(T1+T2vs.T3+T4,P=0.001)存在关联. 3.在POSH2-AS1高表达和低表达A549及PC-9肺癌细胞系模型中进行CCK-8细胞增殖实验显示,在两组细胞系中,POSH2-AS1高表达组的细胞生长速率低于对照组(P<0.01),而低表达组的细胞生长速率高于对照组(P<0.01). 4.在POSH2-AS1高表达和低表达A549及PC-9肺癌细胞系模型中进行平板克隆实验显示,POSH2-AS1高表达组细胞集落形成率低于对照组(P<0.01),而低表达组细胞集落形成率高于对照组(P<0.01). 5.在POSH2-AS1高表达和低表达A549肺癌细胞系模型中进行细胞周期检测显示,POSH2-AS1高表达组与其对照组相比,休眠期及分裂前期(G0-G1期)细胞数量增多(P<0.01),DNA合成期(S期)细胞数量减少(P<0.05),低表达组与其对照组相比,休眠期及分裂前期(G0-G1期)细胞数量减少(P<0.01),DNA合成期(S期)细胞数量增多(P<0.05);在PC-9肺癌细胞系中,POSH2-AS1高表达组与其对照组相比,休眠期及分裂前期(G0-G1期)细胞数量增多(P<0.01),DNA合成后期及分裂期(G2-M期)细胞数量减少(P<0.01),低表达组休眠期及分裂前期(G0-G1期)细胞数量减少(P<0.01),DNA合成期(S期)细胞数量增多(P<0.01),DNA合成后期及分裂期(G2-M期)细胞数量增多(P<0.01).在POSH2-AS1高表达和低表达A549肺癌细胞系模型中进行细胞凋亡检测显示,与其对照组相比,POSH2-AS1高表达组细胞凋亡率增加(P<0.01),低表达组细胞凋亡率减少(P<0.01). 6.在POSH2-AS1高表达和低表达A549及PC-9肺癌细胞系模型中进行细胞自噬水平检测,结果发现,POSH2-AS1对自噬的影响不显著. 7.在POSH2-AS1高表达和低表达A549及PC-9肺癌细胞系模型中进行细胞迁移及侵袭实验显示,POSH2-AS1高表达组穿过小室的细胞数量低于对照组(P<0.01),低表达组穿过小室的细胞数量高于对照组(P<0.01). 8.裸鼠成瘤实验显示,与对照组相比,POSH2-AS1高表达组肺癌细胞在裸鼠体内生长能力降低(P<0.01),低表达组肺癌细胞裸鼠体内生长能力增加(P<0.01);裸鼠尾静脉注射肺转移实验显示,与对照组相比,POSH2-AS1高表达组细胞肺转移能力降低(P<0.01),低表达组细胞肺转移能力增加(P<0.01). 9.通过生物信息学分析显示,POSH2-AS1与POSH2存在天然碱基互补配对序列,POSH2-AS1与POSH2上游2214bp及POSH2第一个外显子578bp的碱基互补配对.通过分析POSH2-AS1和POSH2的基因表达情况发现,POSH2-AS1表达水平与POSH2表达水平呈正相关(肺癌组织r=0.374,P<0.01;癌旁正常组织r=0.393,P<0.01). 10.通过q-RT PCR检测与蛋白编码基因POSH2的表达水平,结果表明POSH2在肺癌组织中呈低表达(P<0.05),其低表达与肺癌临床分期(Ⅰ+Ⅱvs.Ⅲ+Ⅳ,P<0.01)、原发灶大小(T1+T2vs.T3+T4,P<0.01)、淋巴结转移(N0vs.N1+N2+N3,P<0.01)、远处转移(M0vs.M1,P<0.01)相关. 11.对POSH2-AS1及POSH2在基因表达水平的研究发现,与对照组相比,高表达POSH2-AS1能够增加POSH2表达量(P<0.01),而低表达POSH2-AS1能够降低POSH2表达量(P<0.01). 12.通过对POSH2启动子荧光素酶报告基因载体分析POSH2-AS1对POSH2启动子活性影响,结果显示POSH2-AS1高表达能增加POSH2启动子活性(P<0.05),低表达POSH2-AS1能够降低POSH2启动子活性(P<0.01). 13.在POSH2-AS1高表达及低表达细胞模型中,进一步采用siRNA对POSH2-AS1的潜在靶基因POSH2进行敲低实验,观察其对细胞增殖及凋亡,结果显示,在敲低了POSH2表达后,POSH2-AS1高表达组的细胞生长速率高于对照组(P<0.01),细胞凋亡率低于对照组(P<0.01),而未敲低POSH2的高表达POSH2-AS1组细胞生长速率低于对照组(P<0.01),细胞凋亡率高于对照组(P<0.01).对低表达POSH2-AS1进行敲低POSH2后,结果显示,既POSH2-AS1低表达又敲低POSH2组与不敲低POSH2只低表达POSH2-AS1组相比,细胞增殖、凋亡没有显著差异(P>0.05),但其细胞增殖都高于对照组(P<0.01),细胞凋亡率低于对照组(P<0.01) 结论: 1.POSH2-AS1在肺癌组织中呈低表达,其低表达与肺癌临床进展相关. 2.POSH2-AS1能够抑制肺癌细胞增殖、转移及侵袭,促进细胞凋亡,并在裸鼠体内可抑制肺癌细胞成瘤能力及肺转移能力. 3.POSH2-AS1可正向调控靶基因POSH2及影响SPAK/JNK通路活化,从而参与肺癌细胞的生物学进程. 本研究的创新之处: 研究首次报道了反义长链非编码RNA POSH2-AS1在肺癌中的表达模式及与临床特征关系,通过一系列细胞功能实验探索其肿瘤生物学功能,并研究了其可能的调控机制. 本研究的不足之处: 需要进一步研究POSH2-AS1对其靶基因POSH2的直接调控机制及其参与肺癌发生发展的具体作用机制.此外,反义长链非编码RNA POSH2-AS1对可能的远端调控基因的研究暂未探索. 研究总结: 反义长链非编码RNA POSH2-AS1在肺癌组织中呈现低表达,其低表达与肺癌临床特征相关,并通过调控编码基因POSH2及影响SPAK/JNK通路发挥肿瘤细胞生物学功能.该研究提示反义长链非编码RNA POSH2-AS1可作为肺癌诊断的生物标志物及潜在的治疗靶点.
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