摘要:
香菇是目前世界上一种深受消费者喜欢的重要食用菌品种,其在世界范围的生产量和消费量排名仅次于双孢蘑菇之后,是第二大食药用菌品种。香菇栽培周期至少可以分为四个重要阶段,分别为营养菌丝生长阶段、菌丝转色形成阶段、原基形成阶段、子实体生长阶段...
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香菇是目前世界上一种深受消费者喜欢的重要食用菌品种,其在世界范围的生产量和消费量排名仅次于双孢蘑菇之后,是第二大食药用菌品种。香菇栽培周期至少可以分为四个重要阶段,分别为营养菌丝生长阶段、菌丝转色形成阶段、原基形成阶段、子实体生长阶段。香菇菌丝转色形成是原基发生和子实体形成前重要阶段,对香菇的产量和品质具有重要作用,但香菇发育过程中菌丝转色形成的机制还知之甚少,尤其是环境因子比如光对香菇菌丝转色形成的影响还未见报道。为了深入分析和阐明香菇菌丝转色形成的分子机制,本论文从转录组和蛋白质组水平系统分析光诱导香菇菌丝转色形成的机理。这是首次对香菇菌丝转色形成进行系统研究,为这种具有重要商业价值的食用菌的子实体发育的分子机制的深入研究打下一基础,对研究香菇的生长发育及其次级代谢也具有重要意义。 本论文从转录组和蛋白质组水平,分析了光对香菇菌丝转色的影响,并挖掘其相应的候选基因和蛋白,解析了香菇菌丝转色形成的机制,主要结果如下: 第一、通过在完全避光条件下培养香菇菌丝30天,菌丝发满菌包,并且菌丝均为白色,再通过在两种不同条件下(有光和避光)进行平行培养(后熟),其中在有光条件下,香菇菌丝逐渐形成转色,而在避光条件下,香菇菌丝未发生转色现象,即仍为白色。培养试验结果表明,光对香菇菌丝转色的形成具有重要作用。 第二、香菇菌丝经过30天黑暗发菌培养后,菌丝长满菌包,再进行见光和黑暗两种处理进行后续培养以考察转色情况,其中分别对黑暗培养30天,以及后续培养50天两种试验处理的的菌包表层香菇菌丝作为试验样品,其样品编号分别为样品118,313W以及313C。再利用新一代高通量转录组测序技术(RNA-seq)分别对三个试验样品进行测序,共获得了约159.23 million reads,通过从头组装得到了31,511unigenes,其中unigenes的平均长度为1,746 bp其N50为2,480 bp。将得到的unigenes应用BLASTx与NR, SwissProt, COG以及KEGG库进行注释与比对,其中有24,246(76.94%)unigenes有注释结果。通过比较313C/118和313C/313W的表达谱,分别获得3958和5651显著差异表达基因。通过比较和COG库注释等分析,揭示出与光诱导香菇菌丝转色形成相关的候选基因,这些基因编码的蛋白主要包括光感受器(如WC-1, WC-2,phytochrome),光信号转导途径(如two-component phosphorelay system, mitogen-activated protein kinase pathway),以及色素形成基因(如polyketide synthase,O-methyltransferase, laccase, P450-monooxygenase, oxidoreductase)等,在此基础上,我们初步构建了光诱导菌丝转色的分子模型。同时,应用实时定量PCR技术对转录组数据的可靠性进行了验证。 第三、以见光转色的香菇菌丝转色的样品(313C)与避光未转色的香菇菌丝样品(313W)为材料,利用蛋白质组学的手段,即采用蛋白质双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)技术比较分析了两种处理条件下香菇菌丝的蛋白质表达图谱。通过双向电泳分离出700个左右银染的蛋白质点,其中有73个蛋白质点有显著差异。这些蛋白质点经酶解和质谱鉴定,最终鉴定出52个蛋白质,其中有32个蛋白质在样品转色的香菇菌丝中表现为上调,其主要包括核苷二磷酸激酶、锰离子超氧化歧化酶、谷胱甘肽S-转移酶、蛋白酶成分PTS1、热休克蛋白70、20S蛋白酶体亚基、S短链脱氢酶/还原酶 SDR、脂肪酶、腺苷激酶、3-异丙基脱氢酶、酮还原酶等;20个蛋白质为下调,主要包括琥珀酸半醛脱氢酶、林可霉素冷凝蛋白LMBA、乙二醛I、天门冬氨酸激酶丝氨酸脱氢酶、增殖相关2G4、三肽肽酶A和碳水化合物结合模块系列13蛋白等。根据其主要功能,可将其分为能量代谢相关酶类、核苷酸的转运和代谢、碳水化合物运输和代谢、脂质转运和代谢、翻译后修饰、蛋白质折叠、伴侣等相关类型。通过蛋白质组初步分析,我们发现由光诱导香菇菌丝转色形成,可能依赖于光信号传导的蛋白。蛋白NDK的显著上调表达,进一步说明涉及光信号转导与调控的蛋白质在光诱导香菇菌丝转色形成过程中起着重要作用。此外,推测其能调节信号介导的色素等相关代谢合成基因的表达,从而完成香菇菌丝的转色。本研究结果为香菇的功能基因组学的深入分析研究奠定了良好基础。 第四、通过香菇菌丝的转录组进行SSR分子标记筛选和分析,结果表明,有2474个Unigenes检测出SSRs分子标记位点,总计获得了3017个SSRs分子标记。其中438个Unigenes含有一个以上的SSR位点,205个Unigenes存在于化合物合成相关途径中。另外,三核苷酸重复类型有1333个,占有42.9%,类型最多的重复序列是(GGA)n(6.15%)和(TGG)n(6.0%)。以转录本为基础发展的分子标记将是鉴定与转色农艺性状相关遗传功能的重要资源。
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