摘要: 山茶属物种有将近280余种，其中具有油用价值的都可以统称为油茶(oil-tea，oil-Camellia)。油茶是我国南方丘陵山区特有的优质木本油料植物，具有重要的经济、社会和生态价值。油茶品种在果实形态、种仁含油率以及种仁油脂品质等果实性状都存在一定差... 展开 山茶属物种有将近280余种，其中具有油用价值的都可以统称为油茶(oil-tea，oil-Camellia)。油茶是我国南方丘陵山区特有的优质木本油料植物，具有重要的经济、社会和生态价值。油茶品种在果实形态、种仁含油率以及种仁油脂品质等果实性状都存在一定差异，但对性状差异的形成机理鲜有研究。前期发现，不同油茶果实鲜果出籽率差异的主要原因在于果皮组织的差异，而果皮组织的木质化过程对鲜果出籽率有重要影响。果皮组织的木质化过程是木质素积累的结果，受到木质素生物合成与转录调控相关基因调控。为此，本研究以6个不同油茶材料为研究对象，首先对成熟果实性状进行比较分析，通过对果实生长发育动态以及木质素在果实中的积累情况进行观测，分析油茶果实中木质素积累对果实发育的影响。通过转录组和小RNA测序对油茶果实木质素相关的基因进行分析和筛选，克隆油茶木质素生物合成的关键调控基因，对其表达模式和功能进行初步研究。主要研究结果如下: 1.油茶成熟果实表型性状和果皮成分比较:6种不同油茶材料的果实出籽率从大到小依次为攸县油茶（Camelliayuhsienensis）(70.32％)、小果油茶（C.meiocarpa）(60.40％)、普通油茶(C.oleifera)长林53号(52.65％)和长林166号(41.50％)、浙江红花油茶（C.chekiangoleosa）(16.34％)和茶梨油茶（C.octopetala）(7.81％)，果实重量指标中果皮重差异系数最大为3.59％，油茶果实出籽率与果皮厚度呈负相关关系。果皮较厚的浙江红花油茶和茶梨油茶的G-木质素和S-木质素含量显著低于其他几种类型油茶。 2.木质素积累对油茶果实生长发育的影响:油茶果实的生长经历了类似的S型的3个阶段。油茶果实发育由果皮发育和种子发育两部分组成:果皮发育以果皮完全木质化的时期作为分界线，分为增厚期和延展期;种子发育分别以种子填充种皮空间、种仁成型和种皮完全木质素化为形态特征，分为发育前期、种仁形成期和种子膨大期3个时期。果皮厚度在果实发育早期已经完成，果皮中木质素积累完成后厚度不再增长。油茶果实果皮中木质素的积累模式可以分为从外向内和从内向外的两种类型，在木质素从外向内积累的油茶果实中，果皮的木质素积累完成越早果皮越薄。 3.基于组学鉴定油茶果实中木质素调控基因:通过对浙江红花油茶花芽和果实不同组织转录组数据的差异基因分析，鉴定出了1083个可能与果实木质素积累过程相关的基因，其中586个在木质化程度较高的内果皮和种皮中具有较高的表达量;通过同源序列比对筛选出32个浙江红花油茶的木质素生物合成与转录调控的基因，其中21个在种皮中表达量较高。通过对浙江红花油茶小RNA测序和分析，鉴定出了103个miRNA，其中77个为保守miRNA，26个为浙江红花油茶特有;根据miRNA的表达模式，可以分成将其5类。对Cch-miR156a的前体序列进行了克隆，分析其靶基因的剪切位点，原位杂交分析表明Cch-miR156a特异的在雄蕊和胚珠中富集。通过对普通油茶果实不同发育时期的转录组数据的差异基因分析，鉴定出1770个可能与普通油茶果实的果皮和种子不同发育时期的木质素积累过程相关的基因，其中701个在木质素积累较高的果皮发育前期和种皮中表达量较高;通过同源序列比对筛选出43个普通油茶的木质素生物合成与转录调控的基因，其中27个基因在果皮发育前期高表达。浙江红花油茶和普通油茶转录组分析表明，木质素生物合成与调控基因的表达模式与果实木质素积累过程具有相关性。 4.油茶果实中木质素调控基因克隆与功能验证:结合转录组分析和相关文献结果，对木质素生物合成的关键转录调控因子NAC类和BEL类转录因子进行克隆和序列分析，发现DN47942（CchNST1）和DN40632(CchBLH6)，分别与拟南芥的关键转录因子NST1和BLH6/7在同一分支。研究发现:CchNST1编码396个氨基酸，N端具有一个NAM结构域，是典型的NAC类转录因子;CchBLH6编码632个氨基酸，具有一个POX结构域和一个HOX结构域，是典型BEL类转录因子。浙江红花油茶果实中CchNST1和CchBLH6在内果皮和种皮组织都具有较高的表达量。CchNST1在浙江红花油茶的果皮和种子中的表达量的变化规律与木质素积累规律基本吻合。过表达CchNST1和CchBLH6的转基因拟南芥都表现出木质化程度提高的表型。组织切片结果显示，转基因拟南芥的根部木质化区域、茎木质部细胞层数和木质部宽度，与野生型相比都表现出增多的表型。CchNST1的转基因拟南芥的叶片表现出向上卷曲的表型，可能与叶中脉木质化区域更加扁平有关。CchNST1的转基因拟南芥中，NST1及其直接下游基因MYB46、MYB83和BLH6的表达量都显著上调。过表达CchNST1的转基因杨树中，茎的木质化程度高于野生型杨树，韧皮纤维表现出提前的木质化增厚。CchNST1的转基因杨树中，PdSND1(NST1同源基因）及其下游的PdMYB21和PdMYB74表达量显著上调。亚细胞定位分析表明CchNST1和CchBLH6是核定位基因。 收起