中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 李红波宁波大学 2016年博士导师: 潘道东共112页

摘要 : 黄曲霉毒素（AFB1）是当前发现的毒性和致癌性最强的化学物质之一，其中以AFB1的毒性最强。水产饲料中使用植物成分以及加工或贮存过程控制不当就会容易被黄曲霉毒素污染。本文系统研究了AFB1对黄河鲤鱼的急性毒性及慢性毒性：对黄河鲤鱼生长性能及生... 展开黄曲霉毒素（AFB1）是当前发现的毒性和致癌性最强的化学物质之一，其中以AFB1的毒性最强。水产饲料中使用植物成分以及加工或贮存过程控制不当就会容易被黄曲霉毒素污染。本文系统研究了AFB1对黄河鲤鱼的急性毒性及慢性毒性：对黄河鲤鱼生长性能及生理生化指标的影响，对鲤鱼非特异性免疫酶活的影响，对鲤鱼 IL-1β、TNF-α以及Lysozyme-C等免疫相关基因表达的影响，对鲤鱼Bcl-2、Bax及 Caspase-3等细胞凋亡相关蛋白表达的影响，组织病理学分析以及毒素在黄河鲤鱼组织中的积累。同时通过体外细胞培养研究了香菇葡聚糖 CED对 AFB1诱导的黄河鲤鱼淋巴细胞免疫毒性的保护作用，制备纳米化肉桂醛并研究了其抑制黄曲霉菌生长及产毒活性。最后通过动物学实验等验证了CED、纳米化肉桂醛等作为水产饲料中AFB1干预剂使用的作用效果。本研究主要内容包括：⑴通过腹腔注射测得AFB1对黄河鲤鱼半致死剂量为12.3mg/kg体重，95%置信区间12.2-25.5mg/kg体重。随着注射AFB1浓度的升高，黄河鲤鱼血液中细胞呼吸爆发活性、免疫球蛋白 IgM、碱性磷酸酶呈现先升高后下降的趋势；溶菌酶活性、血浆总蛋白、白蛋白含量降低；谷丙转氨酶活性、谷草转氨酶活性、补体3含量升高。经6.1mg/kgAFB1处理，鲤鱼肝脏SOD活性下降了11%，GSH含量下降了38%，MDA含量提高了28%，差异显著（P<0.05）。AFB1抑制了头肾、脾脏中IL-1β、TNF-α以及Lysozyme-C三个免疫相关基因的表达。表明AFB1一定程度上抑制了黄河鲤鱼机体免疫防御，诱导其肝脏发生氧化损伤。⑵通过90天不间断饲喂含AFB1的饲料，发现黄河鲤鱼表现出食欲下降、消瘦、活动减弱现象。1 mg/kg AFB1处理组鲤鱼增重率下降50%，饲料系数为对照组的2倍。鲤鱼的肥满度、肌肉必需氨基酸总量略有下降，差异不显著(P<0.05)。摄入1 mg/kg AFB1鲤鱼肝胰脏中AFB1含量高达6.1μg/kg，肌肉中AFB1含量却都低于0.5μg/kg。通过石蜡切片发现，鲤鱼肝脏、头肾、后肾、十二指肠等器官发生不同程度的病变。通过免疫组化分析发现，肝脏、肾脏细胞Bcl-2表达受到抑制，Bax表达升高，Bcl-2/Bax下降，Caspase-3表达升高。表明AFB1能够诱导黄河鲤鱼肝脏、肾脏细胞凋亡。⑶研究发现10、50μg/mL CED对黄曲霉菌产毒的抑制率分别达到70%、92%，而100、250、500μg/mL的CED对黄曲霉菌产毒的抑制率均达到100%。通过体外离体培养诱导方法，发现20μg/L AFB1能够显著抑制鲤鱼淋巴细胞活性，导致淋巴细胞内ROS水平、MDA水平显著升高（P<0.05）；能够抑制淋巴细胞内的SOD、CAT、GSH活性，降低膜电位水平，诱导淋巴细胞崩溃。100μg/mLCED处理，可以有效提高淋巴细胞活性，降低胞内ROS、MDA水平，增强SOD、CAT酶活。CED可以有效抑制AFB1诱导的淋巴细胞线粒体膜电位崩解状态，提高淋巴细胞活性，增强鲤鱼免疫细胞的抗氧化防御系统。⑷通过制备纳米化肉桂醛，提高了肉桂醛的溶解性、稳定性以及对黄曲霉菌的抑制效果。选择乙酸乙酯作为油相，无水乙醇为助表面活性剂，吐温-80作为表面活性剂，Km=2:1（吐温-乙醇质量比值），制备的纳米化肉桂醛，形成了均一、稳定、透明的水溶性体系。纳米化肉桂醛在终浓度为0.6 mM时，可以有效地抑制黄曲霉菌菌丝生长，与肉桂醛相比，抑菌活性提高了50-100%。Nano-CA能够导致黄曲霉菌孢子发生更强烈的钙离子外流。虽然1mM肉桂醛也能够有效抑制黄曲霉孢子生长，但低浓度的肉桂醛（沙氏培养基中0.2mM、花生酱中0.25mM）一定程度上能够促进AFB1的产生。因此在黄曲霉毒素污染控制上，纳米化肉桂醛比肉桂醛更有效果。⑸10mg/kg、50mg/kgCED作为饲料中AFB1干预剂，能提高鲤鱼的增重率、鲤鱼含肉率及降低饲料系数；一定程度上提高细胞呼吸爆发活性、溶菌酶活性、碱性磷酸酶（AKP）活性、IgM含量、C3含量，降低血清中ALT及AST活性。表明CED作为饲料添加剂可以有效降低AFB1对黄河鲤鱼的毒害作用，促进鲤鱼的生长，提高鲤鱼的非特异性免疫力。而Nano-CA能提高鲤鱼的增重率及降低饲料系数，但降低了鲤鱼的含肉率。Nano-CA作为饲料中AFB1干预剂使用，性能不如CED。收起

关键词 : 黄曲霉毒素B1 黄河鲤鱼免疫毒性干预剂

2. 嗜酸乳杆菌胞壁肽聚糖的免疫调节效应与机理研究

[学位论文] 吴振南京师范大学 2015年博士导师: 潘道东共110页

摘要 : 乳酸菌作为一类重要的肠道定植型益生菌，被广泛的应用于发酵食品中，尤其是酸乳，干酪，泡菜等。同时，关于肠内乳酸菌与宿主健康的密切关系，也越来越多的被国内外微生物学家阐述。肽聚糖(peptidoglycan，PGN)作为革兰氏阳性细菌细胞壁的主要... 展开乳酸菌作为一类重要的肠道定植型益生菌，被广泛的应用于发酵食品中，尤其是酸乳，干酪，泡菜等。同时，关于肠内乳酸菌与宿主健康的密切关系，也越来越多的被国内外微生物学家阐述。肽聚糖(peptidoglycan，PGN)作为革兰氏阳性细菌细胞壁的主要成分，其基本结构是由N-乙酰葡糖胺与N-乙酰胞壁酸通过β-1，4糖苷键连接，并在重复的单元之间通过四肽或者五肽的桥连结构构成的多聚网络结构。其中，PGN的重复二糖结构N-乙酰葡聚糖和胞壁酸δ-内酰胺残基大约占据了PGN成分的50％。PGN作为一种免疫增强剂，对其在诱导有关免疫调控因子的释放来刺激免疫系统发挥其抗感染、抗肿瘤等生物效应方面的研究已初见端倪，但其激活巨噬细胞的具体信号通路仍不清晰，它在免疫系统中的作用机理也有待进一步探索。对PGN的高效分离利用，将对生物病害防治提供更多更可靠的天然生物免疫强化剂。肠道益生菌细胞壁PGN的免疫学研究，目前主要集中在双歧杆菌PGN方面。婴儿型双歧杆菌的PGN能促使小鼠腹腔巨噬细胞分泌多量的IL-1β、IL-6和TNF-α;同时部分研究发现双歧杆菌的完整PGN可以对机体免疫系统产生不同程度的免疫调节作用，激活巨噬细胞从而抑制多种肿瘤的发生。嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)作为一种重要的肠道益生菌，通过调节肠道免疫系统，增强机体非特异性免疫功能，对机体健康具有重要作用。本实验室已从海洋鱼类肠道分离出一种抗氧化型嗜酸乳杆菌，并对其进行了相关前期研究。结果发现其有较高的DPPH清除能力(24.42％)，且对新霉素、菌必治、丁胺卡那霉素、庆大霉素等常见药物有一定耐性。本课题利用分离出的L.acidophilus作为研究对象，通过微生物发酵技术，分离纯化得到L.acidophilus的PGN成分。但由于PGN过高的聚合度，限制了其溶解度，从而对其发挥免疫活性产生了重要的障碍。我们采取了部分水解的方法，提高了PGN的溶解度，在一定程度上增强其在免疫活性方面的活性。在分离纯化L.acidophilus细胞壁PGN的研究中，利用HPLC，NMR, FT-RI，MALDI-TOF/TOF及氨基酸成分分析，确定L.acidophilus菌株的细胞壁PGN结构单体为NAG-(β-1,4)-NAM-L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala。通过在LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型中，采用蛋白质印迹(Western blotting)实验，发现PGN聚合物，PGN水解产物以及PGN单体成分对LPS引起的炎症反应具有较好的抑炎调节功能。而且抑炎活性以N-乙酰胞壁酸(NAM)的作用最为显著。在对核转录因子(NF-κB)通路及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径的深入研究中，发现NAM的抑制作用是通过TLR4与NF-κb信号途径的相互交互，通过p38-MAPK激酶通路，抑制NF-kB的核转录，限制炎症因子的表达来实现的。在进一步的研究中，我们利用系统蛋白组学的研究方法，同位素相对标记与绝对定量(iTRAQ)技术发现了钙信号途径与p38-MAPK途径的相互关系。NAM处理组中，NAM通过上调内质网Ca2+-ATP酶(SERCA)在的表达，调节与内质网上SERCA依赖的钙离子流动方向，进而实现NAM介导的抑炎活性发挥作用。体内小鼠试验，我们采用致病性大肠杆菌灌注作为小鼠炎症模型，来观察PGN，PGN水解物以及NAM的抑炎效果。小鼠肠道免疫切片及肠道炎症因子的观察结果证明嗜酸乳杆菌PGN及其单体成分NAM确实可以对小鼠肠道起到很好的抑炎作用。本研究为嗜酸乳杆菌细胞壁PGN应用于功能食品、畜禽和水产动物饲料及药品，解决养殖过程中出现的生物抗药性问题及食品的药物残留问题提供很好的借鉴价值。收起

关键词 : 嗜酸乳杆菌胞壁肽聚糖免疫调节免疫强化剂 iTRAQ 钙信号

3. 瑞士乳杆菌蛋白酶的分离纯化及其水解乳蛋白产生ACE抑制肽研究

[学位论文] 郭宇星南京师范大学 2009年博士导师: 潘道东共106页

摘要 : 近年来研究发现采用某些瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)菌株制作的发酵乳有较强的降高血压功能，主要是由于在发酵过程中，瑞士乳杆菌的蛋白水解系统分解乳蛋白产生多肽，这些多肽则对血管紧张素转移酶(Angiotensin I-Converting Enzyme，ACE)... 展开近年来研究发现采用某些瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)菌株制作的发酵乳有较强的降高血压功能，主要是由于在发酵过程中，瑞士乳杆菌的蛋白水解系统分解乳蛋白产生多肽，这些多肽则对血管紧张素转移酶(Angiotensin I-Converting Enzyme，ACE)具有抑制作用，从而达到了降低血压的效果。本文就瑞士乳杆菌主要蛋白酶的分离纯化及其理化特性，以及它们在发酵乳制品中水解乳蛋白产生ACE抑制肽的作用进行了研究，并分离纯化了一种乳清蛋白源性的ACE抑制肽。通过对瑞士乳杆菌细胞壁蛋白酶(CEP)，氨肽酶N(PepN)，X-脯氨酰-二肽酰基-氨基肽酶(PepX)和肽链内切酶活性的研究，发现CEP，PepN，PepX的活性较高，于是确定CEP，PepN，PepX为研究对象。采用响应面分析法对瑞士乳杆菌发酵乳产ACE抑制肽的发酵条件进行了优化，确定了如下最适条件：接种量4％，发酵液初始pH值7.5，培养温度39℃，在此发酵条件下所得酸乳的ACE抑制活性为75.46±0.42％。用相关系数评定ACE抑制肽的活性与CEP，PepN和PepX的关系，初步推测瑞士乳杆菌CEP是水解乳蛋白产生ACE抑制肽的关键蛋白酶。采用超声波破碎瑞士乳杆菌细胞壁提取CEP，PepN和PepX。通过单因素实验和响应面分析法对瑞士乳杆菌细胞壁破碎的条件包括菌液浓度、破碎功率和破碎时间进行了研究，以PepN的活性为响应值，得到了破碎细胞壁的最佳条件：菌体浓度为0.0238g/mL的瑞士乳杆菌细胞悬液，破碎功率为300W，破碎总时间为26min(工作时间3s，间隔时间5s)。通过硫酸铵沉淀，SephacrylS-300HR层析，非变性-PAGE切胶回收蛋白纯化了瑞士乳杆菌的CEP，PepN和PepX。CEP，PepN和PepX的比酶活力分别为20.53mg/mL，43.41mg/mL，62.24mg/mL。用纯化的CEP，PepN，PepX体外水解乳蛋白以确定这三种酶与ACE抑制肽产生的关系，更进一步证实了CEP是水解乳蛋白产生ACE抑制肽的关键蛋白酶。纯化的瑞士乳杆菌CEP为单体结构，分子量为～40kDa。CEP的最适酶反应温度为33℃，最适酶反应pH为6.0。Co2+，Mg2+，Ca2+能够激活CEP的活性，Zn2+，Ni2+和EDTA能够抑制CEP的活性，表明CEP为一种金属酶。丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对CEP有抑制作用，表明CEP为一种丝氨酸蛋白酶。CEP的Km为0.115mM，N端氨基酸序列为Gln-Ile-Ile-Thr-Asp-Ile-Tyr-Ala-Arg-Glu。瑞士乳杆菌PepN分子量大约为24kDa，最适酶反应pH为7.0，最适酶反应温度为37℃。Co2+对PepN活性有激活作用，Zn2+，Ni2+，Fe3+对PepN活性有强烈的抑制作用，EDTA对PepN活力也有一定的抑制作用，表明PepN为金属蛋白酶。瑞士乳杆菌的PepX分子量大约为26kDa，最适酶反应pH为7.0，最适酶反应温度为37℃。Co2+对PepX有激活作用，Zn+，Ni2+，Mn2+，Fe3+对PepX有强烈的抑制作用，EDTA对PepX也有一定的抑制作用，表明PepX为金属蛋白酶。同时，丝氨酸蛋白酶PMSF对PepX也有抑制作用，表明PepX为一种丝氨酸肽酶。采用响应面设计确定了瑞士乳杆菌蛋白粗酶水解乳清蛋白产生ACE抑制肽的最优条件。通过控制三个主要的水解条件([E]/[S]，水解pH，水解温度)改变水解产物的ACE抑制活性。实验确定了最优的水解条件，即[E]/[S](w/w)为0.006，水解pH为8.60，水解温度为38.90℃，在此条件下酶解乳清蛋白，最后水解产物的ACE抑制率为92.21士0.45％，IC50为0.975mg/mL，水解度为18.76％。采用SephadexG-75，SephadexG-15，RP-HPLC分离纯化了一种乳清蛋白源性的ACE抑制肽，该ACE抑制肽IC50为0.13mg/mL。同时采用了ESI-MS/MS对纯化的ACE抑制肽测定了氨基酸序列，氨基酸序列为Arg-Leu-Ser-Phe-Asn-Pro，是β-乳球蛋白的148-153片段。收起

关键词 : 发酵乳制品瑞士乳杆菌蛋白酶分离纯化乳清蛋白水解工艺 ACE抑制肽降血压活性

4. 含抗氧化肽玉米酸奶的研制及其功能性研究

[学位论文] 陈莹艳南京师范大学 2021年硕士导师: 潘道东共96页

摘要 : 氧化应激会导致细胞损伤，引发多种疾病。机体内具备一定的氧化调节系统，维持自由基代谢平衡；当机体自身的防御系统不能抵抗自由基带来的损伤时，就需要外源性的抗氧化剂进行抵御缓解。抗氧化肽是一种由蛋白质水解而来，具备抗氧化功能的生物活性肽... 展开氧化应激会导致细胞损伤，引发多种疾病。机体内具备一定的氧化调节系统，维持自由基代谢平衡；当机体自身的防御系统不能抵抗自由基带来的损伤时，就需要外源性的抗氧化剂进行抵御缓解。抗氧化肽是一种由蛋白质水解而来，具备抗氧化功能的生物活性肽。近年来，越来越多的学者对抗氧化肽的来源，制备，功能特性进行了研究。本研究筛选得到一株发酵乳蛋白产抗氧化肽的乳酸菌，并对其进行生理特性研究；优化了玉米酶解发酵液以及酸奶发酵的制备条件，制得富含抗氧化肽的玉米酸奶；通过小鼠试验探明富含抗氧化肽的玉米酸奶的抗氧化能力，旨在为功能性酸奶的开发和利用提供理论依据，最后对酸奶内含有的抗氧化肽进行了分离鉴定，并合成验证其抗氧化活性。主要研究结果归纳如下： 1.筛选出一株发酵乳蛋白产抗氧化肽的乳酸菌，该菌株发酵所得的酸奶中多肽含量达到0.580±0.018mg/ml，总抗氧化活性相当于0.348±0.005mMTrolox当量。经过菌落形态观察、革兰氏染色、16SrDNA序列分子分析，确定所筛选出的产抗氧化肽的菌株为发酵乳杆菌。它在低pH环境中生长良好，在含有不同浓度NaCl的MRS培养基中总体耐受能力良好，在模拟人工胃、肠液环境中4h存活率均高于60.0%，且该菌株发酵乳蛋白产抗氧化肽的遗传稳定性较好。 2.通过单因素、响应面优化及正交优化试验，得出玉米最佳酶解方案为：底物浓度9.82%，加酶量6.53%，pH=9.19，温度49.53℃，在该条件下得到玉米酶解液的水解度为30.60±0.11%。枯草芽孢杆菌发酵的最佳方案为：接种量6%，发酵时间18h，初始pH为8,发酵温度37℃，发酵液总抗氧化活性为0.748±0.016mMTrolox当量。制备含抗氧化肽玉米酸奶的最佳条件为：酶解发酵液添加量为9%(v/v)，第一发酵剂（发酵乳杆菌）添加量为3%(v/v)，第二发酵剂（直投式发酵剂）添加量为2%(v/v)，蔗糖添加量为8%（w/v），所得酸奶的多肽含量为0.914±0.009mg/ml，总抗氧化活性相当于0.781±0.020mMTrolox当量，品质优良。 3.采用含抗氧化肽的玉米酸奶灌胃D-半乳糖连续注射皮下诱导的衰老模型小鼠。取出小鼠的肝组织进行HE染色，测定小鼠肝脏中相关的氧化应激指标，结果表明，含抗氧化肽的玉米酸奶可以有效缓解D-半乳糖诱导的衰老小鼠体内的氧化应激，具体表现为：可以显著降低D-半乳糖诱导的衰老小鼠炎症细胞浸润程度，提高D-半乳糖诱导的衰老小鼠肝脏中的T-AOC、SOD、CAT活性、GSH和NO含量，降低MDA、ROS含量、LDH、ALT、AST活性，抑制肿瘤坏死因子TNF-α和炎性因子IL-6、IL-1β的释放。 4.通过超滤、凝胶层析、质谱分析等方法，从含抗氧化肽的玉米酸奶中分离并鉴定出四条不同序列的抗氧化肽，分别为FPKYPVEPF、HLPLPLLQSWM、IGGIGTVPVGR、LTVTVTVTPGSR，其中，FPKYPVEPF、HLPLPLLQSWM来自牛乳蛋白，IGGIGTVPVGR、LTVTVTVTPGSR来自玉米蛋白。对鉴定出的肽序列进行合成，验证其抗氧化活性，发现四种序列的肽对DPPH自由基清除率都在60.0%以上，总抗氧化活性也达到0.6mMTrolox当量。其中HLPLPLLQSWM的总抗氧化活性接近0.75mMTrolox当量，显著高于另外三条肽。综上所述，本课题筛选的产抗氧化肽含量高的乳酸菌与优化的玉米酶解发酵液复配制备的酸奶，抗氧化肽含量高，口感较好，对D-半乳糖诱导的小鼠的衰老有显著的缓解作用。最后，在制备的酸奶里得到四条不同序列，且具有良好抗氧化活性的肽。收起

关键词 : 乳酸菌抗氧化肽玉米酸奶功能性分析

5. 鹅肉盐溶蛋白凝胶及其水解产物功能特性研究

[学位论文] 王莉莉宁波大学 2011年硕士导师: 潘道东共86页

摘要 : 鹅肉是一种低脂肪、低胆固醇、高蛋白的营养健康食品。盐溶蛋白质是肌肉蛋白质的主要成分。因此，研究鹅肉盐溶蛋白凝胶及其水解产物的功能特性，对鹅肉制品的加工过程及鹅肉高档产品的开发具有重要的理论指导意义。本论文主要研究了氯化纳、pH... 展开鹅肉是一种低脂肪、低胆固醇、高蛋白的营养健康食品。盐溶蛋白质是肌肉蛋白质的主要成分。因此，研究鹅肉盐溶蛋白凝胶及其水解产物的功能特性，对鹅肉制品的加工过程及鹅肉高档产品的开发具有重要的理论指导意义。本论文主要研究了氯化纳、pH、热变温度、氯化钙及磷酸盐对鹅肉盐溶蛋白凝胶硬度和保水性的影响，通过响应面试验，分别建立了硬度和保水性回归模型，并分析了各因素对它们的影响及二者之间的关联性;此外，根据回归模型，研究了底物质量浓度、pH及水解温度对水解度及DPPH自由基清除率的影响;最后，利用超滤膜将盐溶蛋白水解产物分成分子量范围不同的组分，比较其功能特性，确定最佳组分的分子量范围。主要研究结果如下: 一、鹅肉盐溶蛋白凝胶制备条件的优化。单因素试验结果表明，NaCl浓度、pH和热变温度是影响凝胶硬度和保水性的主要因素。根据响应面试验结果，获得较优凝胶制备条件是:NaCl浓度0.65mo1/L,pH7.20，热变温度78℃。在此条件下，测得凝胶的硬度和保水性分别为88.05g、91.48％。二、添加剂对鹅肉盐溶蛋白凝胶的影响。选择常见的焦磷酸纳、六偏磷酸纳、三聚磷酸铀和氧化钙作为制备凝胶的添加剂。以凝胶硬度和保水性为指标，优化四种添加剂的添加量，得到复合磷酸盐的最优配比，其结果为:CaCl2浓度0.02mol/L三种磷酸盐的添加量分别为0.21％、0.16％、0.11％，此时复合磷酸盐的配比为4:3:2。同时，扫描电镜试验结果表明这四种添加剂对凝胶超微结构的影响不同。最优条件下，凝胶超微结构致密、均匀、平滑。根据食品添加剂使用卫生标准，确定复合磷酸盐总的最佳添加量为0.3％。三、鹅肉盐溶蛋白水解条件的优化。本试验主要对影响DPPH自由基清除率及水解度的因素进行了选择和优化，试验表明最优的水解条件为:底物质量浓度240mg/5mL、水解温度48.5℃、pH7.80。在此条件下，测得水解度为20.35％，水解产物对DPPH自由基的清除率为74.01％，与模型的预测值基本相符。四、鹅肉盐溶蛋白水解产物功能特性研究。用超滤膜将水解产物分为＞5kDa、3-5kDa、2-3kDa和＜2kDa四种组分。分别测是它们亚铁还原能力、抑制ACE活性的能力及几种自由基的清除率，确是分子量范围2～3kDa组分的抗氧化能力较强，＜2kDa组分抑制ACE洁性的能力较强。可见，鹅肉盐溶蛋白水解产物成分复杂，其功能特性各异。根据消费者需求不同，可以生产具有不同功能的鹅肉深加工产品。收起

关键词 : 鹅肉盐溶蛋白凝胶特性酶解产物功能特性

6. 鸭骨架酶解及其产物制备鸭肉香精的研究

[学位论文] 王淑慧宁波大学 2013年硕士导师: 潘道东共81页

摘要 : 鸭骨架是鸭肉加工过程中的主要副产品，富含优质蛋白质和矿物质，酶解法是提高其蛋白质提取率的主要技术。本文主要利用酶解技术和Maillard热反应对鸭骨架的深加工和产品开发进行研究，对回收鸭骨架资源以及实现鸭肉加工产业的持续发展具有现实意义。... 展开鸭骨架是鸭肉加工过程中的主要副产品，富含优质蛋白质和矿物质，酶解法是提高其蛋白质提取率的主要技术。本文主要利用酶解技术和Maillard热反应对鸭骨架的深加工和产品开发进行研究，对回收鸭骨架资源以及实现鸭肉加工产业的持续发展具有现实意义。本论文主要分析了鸭骨架的基本营养成分、蛋白质的组成特点，并在此基础上研究了鸭骨架的营养特性和蛋白质的疏水性值;采取Papain、Panctreatin、Protamex和Flavorzyme四种蛋白酶对鸭骨架蛋白质进行酶解，研究其在单酶酶解和双酶复合酶解过程中产物的变化规律，根据产品需求选择不同的酶解产物。此外，研究鸭脂控制氧化的最佳工艺条件，并分析其挥发性香气成分;最后，利用鸭骨蛋白酶解产物，建立Maillard热反应模型，制备脂肪氧化型的鸭肉香精。主要研究结果如下: (1)鸭骨架蛋白质含量高达29.19％，其中必需氨基酸、鲜味氨基酸、含硫氨基酸含量较高，分别为42.73％、25.00％、4.30％，这些都是制备鸭肉香精的风味前体物质。鸭骨架蛋白质中所有必需氨基酸的氨基酸分超过AAS的评分标准模式，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸等必需氨基酸的氨基酸分超过或接近于CS评分标准模式。鸭骨架蛋白质的疏水性值比较低，为1082.27Cal/mol。 (2)随着酶解时间的延长，四种蛋白酶酶解鸭骨蛋白产物中的可溶性氮和氨基氮含量都不断增加，4h后增速减慢，而肽基氮含量则先增加达到一个最高值，之后缓慢减少。酶解12h后，大分子肽段少，小分子肽段多，游离氨基酸的总量也存在一定差异，游离氨基酸总量、鲜味氨基酸、含硫氨基酸含量均以Flavorzyme最高。因此以Flavorzyme为例，研究其酶解过程中游离氨基酸释放规律，各氨基酸的释放速度不同。酶解12h，产物中游离氨基酸含量为89.1mg/100mL(178.2mg/g蛋白)，是酶解2h产物的3.04倍多，鲜味氨基酸含量不断增加，含硫氨基酸几乎都在7％左右。 (3)选取Papain、Panctreatin、Protamex分别和Flavorzyme复合酶解鸭骨架蛋白质，酶解产物中可溶性氮、氨基氮、肽基氮含量变化规律与单酶酶解过程相同。Protamex和Flavorzyme复合酶解产物的可溶性氮含量和肽基氮含量明显低于其他两种复合酶，氨基氮含量高于其他两种复合酶。以Protamex和Flavorzyme为例研究其复合酶解过程中，产物中游离氨基酸含量的释放规律。随着酶解时间的延长，各氨基酸含量不断增加，2h酶解产物中游离氨基酸含量为42.6mg/100mL(85.2mg/g蛋白)，12h酶解产物中游离氨基酸含量为89.3mg/100mL(178.6mg/g蛋白)。后期采用Protamex和Flavorzyme复合酶解鸭骨蛋白，进行Maillard热反应制备鸭肉香精。 (4)鸭脂控制氧化的最佳工艺条件是:氧化温度120℃、氧化时间4h，其POV值为22.30meq/kg，P-AV值为7.04，AV值为0.93mgKOH/g，具有强烈的脂肪香气以及轻微的油炸气息。通过SPME-GC-MS对氧化前后鸭脂的挥发性香气成分进行分析比较，与氧化前的鸭脂相比，氧化后的鸭脂共检测出32种呈味化合物，种类及含量均有所增加，其含量占总挥发性物质含量的72.32％。其中醛类物质13种，其含量占呈味物质总量的42.29％，己醛含量最高，占29.40％。另外还检测到烃类、呋喃、醇类、羧酸类等多种呈味化合物。 (5)以Protamex和Flavorzyme复合酶解鸭骨架蛋白质8h的酶解产物为主要原料，进行Maillard热反应制备鸭肉香精，通过简单描述法和情感检验法，在单因素试验的基础上，选取硫胺素、还原糖配比、氧化鸭脂、反应时间对产品风味影响比较大的因素，进行4因素3水平的正交试验，优化Maillard热反应的原料和工艺条什为:鸭骨酶解蛋白50mL，水解植物蛋白10g，L-半胱氨酸0.5g，L-丙氨酸0.5g，葡萄糖∶木糖=1∶1，总量为2g，氧化鸭脂2g，硫胺素0.2g，食盐0.3g;反应条件为:120℃，30min。在优化后的配方和条件下，制得的鸭肉香精鸭香味浓，鲜味浓郁，有焦香味和脂香味，经过SPME-GC-MS检测出42种挥发性成分，其中醛类13种(37.35％)、酮类9种(8.75％)、醇类8种(18％)、烃类2种(1.35％)、呋喃类2种(2.59％)、羧酸类4种(10.73％)、吡嗪、噻唑类4种(1.86％)，其中醛类、酮类、醇类比较多，占挥发性成分总量的64.1％。收起

关键词 : 鸭骨架酶解法鸭肉香精游离氨基酸脂肪氧化

7. 嗜酸乳杆菌NCFM沉默基因slpB的克隆表达及S-层蛋白结构与功能研究

[学位论文] 李向月南京师范大学 2018年硕士导师: 潘道东共78页

摘要 : 嗜酸乳杆菌是乳酸菌中重要成员之一，在粘附宿主肠道细胞、与致病菌竞争粘附位点、调节机体免疫功能上发挥着重要作用。作为粘附因子的S-层蛋白，受到越来越多学者的关注与研究。随着基因工程技术的飞速发展，研究者从S-层蛋白的蛋白分子层面深入研究... 展开嗜酸乳杆菌是乳酸菌中重要成员之一，在粘附宿主肠道细胞、与致病菌竞争粘附位点、调节机体免疫功能上发挥着重要作用。作为粘附因子的S-层蛋白，受到越来越多学者的关注与研究。随着基因工程技术的飞速发展，研究者从S-层蛋白的蛋白分子层面深入研究到了基因分子层面。研究表明嗜酸乳杆菌还有另外一个S-层蛋白基因slpB，与slpA基因不同的地方slpB属于沉默基因，对于基因slpB研究报道很少，对于其是否具有粘附功能还需要进一步探索。本课题的主要研究方法与结果如下: 1、以提取的嗜酸乳杆菌全基因组为模板成功克隆出slpB基因，条带大小接近1300bp，与NCBI报道L.acidophilus NCFM基因库中slpB基因大小一致。构建了重组质粒pET-28a-slpB，经过双酶切验证，得到约1300bp的目的片段和约5400bp的载体片段，与预测值相符。测序结果与NCBI数据库比对结果正确。 2、对构建的重组质粒pET-28a-slpB进行了表达，确定了目的蛋白上清表达高于沉淀表达。通过控制变量法得到了最佳的诱导表达条件:诱导温度37℃、IPTG终浓度1mM、诱导时间14h。通过目的蛋白上的His-tag标签进行纯化蛋白，经过Western-blot和SDS-PAGE检测分析得出His-slpB融合蛋白成功表达及纯化。后期对纯化的蛋白进行透析、浓缩，通过Bradford法检测得出蛋白浓度为0.6mg/mL。 3、将嗜酸乳杆菌正常表达的蛋白进行提取纯化，将从嗜酸乳杆菌表面提取的蛋白命名为SA，沉默基因slpB在大肠杆菌中表达的蛋白命名为SB。SA的β-折叠含量略高于SB，表明比SB结构稳定。通过二级结构表征两种蛋白两端氨基酸组成具有较高的一致性。两种蛋白均对胃蛋白酶具有良好的耐受能力，对胰蛋白酶耐受性较弱。更多的SB可以绑定到保加利亚乳杆菌和乳酸乳球菌的细胞壁上，在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞绑定能力上，SB优于SA。在对Caco-2细胞粘附上SA优于SB。综上所述，本研究将沉默基因slpB进行了表达，对S-层蛋白结构与相关功能进行了测定分析，为S-层蛋白的开发与利用提供了一定的理论基础。收起

关键词 : 嗜酸乳杆菌 slpB基因基因克隆 S-层蛋白粘附功能

8. 嗜酸乳杆菌JQ-1胞壁蛋白酶的分离纯化及其水解酪蛋白产ACE抑制肽的研究

[学位论文] 任晓芬宁波大学 2014年硕士导师: 潘道东共77页

摘要 : 研究发现，嗜酸乳杆菌发酵酪蛋白所制备的水解产物具有降血压的功能，主要是由于乳杆菌的蛋白水解系统能分解酪蛋白产生活性多肽，这些多肽大都具有抑制血管紧张素转移酶(Angiotensin I-Converting Enzyme，ACE)作用，从而达到降血压等效果。本文就嗜... 展开研究发现，嗜酸乳杆菌发酵酪蛋白所制备的水解产物具有降血压的功能，主要是由于乳杆菌的蛋白水解系统能分解酪蛋白产生活性多肽，这些多肽大都具有抑制血管紧张素转移酶(Angiotensin I-Converting Enzyme，ACE)作用，从而达到降血压等效果。本文就嗜酸乳杆菌JQ-1产胞壁蛋白酶的培养及发酵条件进行优化，并进行分离纯化，水解酪蛋白条件优化，及其水解对于酪蛋白结构及功能特性的影响进行了研究。通过正交试验确定了嗜酸乳杆菌JQ-1产胞壁蛋白酶的最优培养条件：含2%葡萄糖和1%牛肉蛋白胨的MRS改良培养基。通过单因素试验和响应面分析法确定了嗜酸乳杆菌产胞壁蛋白酶的最佳发酵条件：初始pH值8.0、发酵温度37℃、发酵时间20h。验证试验结果表明响应面分析法对优化产酶条件是可行的。采用溶菌酶结合非离子表面活性剂法对胞壁蛋白酶进行提取，得出其最佳提取条件为：菌粉与裂解液比例为1：5，33℃下保温4.0h，离心取得的上清液即为粗酶液。通过聚乙二醇-20000浓缩，DEAE-Sephadex A-25和Sephadex G-100两步层析对粗酶液进行分离纯化，蛋白酶提纯倍数达到50.951倍，最后回收率为12.569%，且SDS-PAGE检测蛋白酶为单体结构，分子量为45kD。用纯化后CEP水解β-酪蛋白，水解液ACE抑制率为48%。采用单因素试验和响应面中心组合设计确定了嗜酸乳杆菌JQ-1胞壁蛋白酶水解β-酪蛋白的最优条件，按[E]/[S](w/w)为0.08的量加入蛋白酶，调pH至8.0，在42℃下酶解4h后灭酶活，最后产品ACE抑制率为72.91%，总肽含量为12.68mg/ml。验证试验结果表明响应面分析法对于优化酶解条件是可行的。扫描电镜图显示β-酪蛋白酶解物的表面结构紧密性逐渐减弱，并伴有较多小孔洞出现；差示扫描量热法DSC表明酪蛋白酶解物具有较高的热稳定性；此外CEP酶解使得酪蛋白酶解物中游离巯基含量增加，同时导致其酶解物抗氧化性的增加。 FTIR分析表明 CEP酶解改变了酪蛋白各种构象所占的比例，酪蛋白二级结构发生了不同程度的变化；纳米粒度分析表明酪蛋白颗粒大小随水解的加深先减小后增大，其水解物颗粒在 DH4.5%时最小，乳化稳定性最大；酪蛋白的乳化性随水解的加深先增大后减小，DH7.1%时增至最大，与其溶解性的变化趋势一致；此外酪蛋白的酶解物具有一定的ACE抑制活性及抗氧化性，且 DPPH清除能力在一定范围内随水解度及浓度的增大而增大，当 DH为8.3%，浓度为5mg/ml时，DPPH清除能力增大至35.00%。收起

关键词 : 嗜酸乳杆菌 JQ-1胞壁蛋白酶分离纯化水解酪蛋白 ACE抑制肽

9. 鹅皮胶原蛋白的提取及功能性研究

[学位论文] 丁琳宁波大学 2014年硕士导师: 潘道东共76页

摘要 : 浙东白鹅是我国的地方优势品种，在浙江地区有着广泛的养殖。过去生鹅皮常用来制作鹅裘皮，但随着制革行业对于鹅皮的需求量减少，越来越多的鹅皮被直接丢弃，既造成了生物资源的极大浪费，又造成环境污染。胶原蛋白的提取方法主要有酸法，碱法... 展开浙东白鹅是我国的地方优势品种，在浙江地区有着广泛的养殖。过去生鹅皮常用来制作鹅裘皮，但随着制革行业对于鹅皮的需求量减少，越来越多的鹅皮被直接丢弃，既造成了生物资源的极大浪费，又造成环境污染。胶原蛋白的提取方法主要有酸法，碱法和酶法等，而胶原肽一般通过水解胶原蛋白或明胶的方法获得的。研究表明，胶原肽具有诸多生理活性--抗氧化功能、降血压作用、提高机体对矿物元素的吸收能力、增强免疫力、抗菌作用等。本文以浙东白鹅鹅皮为研究对象，研究鹅皮胶原活性肽提取的最佳工艺，再分别探讨鹅皮胶原活性肽的体内和体外生理功能。主要研究成果如下：一、响应面优化酸提鹅皮胶原蛋白的工艺：使用乙醚去除鹅皮脂肪；选用乳酸为浸提溶液，控制pH1.9、料液比1:50(g/mL)、浸提时间为60 h，鹅皮胶原蛋白提取率最高，且纯度最好，分别为30.12%和92.01%。所得鹅皮胶原蛋白经分析鉴定为具有完整三螺旋结构的Ⅰ型胶原蛋白。二、选取风味蛋白酶和木瓜蛋白酶双酶复合水解鹅皮胶原蛋白，以水解率，DPPH·清除率，苦味值为指标，四因素三水平正交优化后得到最佳工艺。在木瓜蛋白酶:风味蛋白酶=1:1的比例下，加酶量4000 U·g-1，温度50℃，pH6.0，水解5 h后，所得鹅皮胶原蛋白肽的水解度和DPPH·清除率最高，分别为28.3%和89.2%，且没有苦味。经Sephadex G-75分离纯化后获得DPPH·清除率最高的P4组分，经分析鹅皮胶原多肽P4组分感官评价、溶解能力和乳化能力均较好。三、建立D-半乳糖致衰小鼠模型，观察鹅皮胶原多肽P4组分对小鼠体内抗氧化性的影响。小鼠的安全性试验表明胶原多肽对小鼠生长无抑制性和致敏性。在此基础上，进行小鼠分组试验，将小鼠分为正常对照组、D-半乳糖致衰模型组、低剂量鹅皮胶原蛋白肽灌胃组、高剂量鹅皮胶原蛋白肽灌胃组和VE对照组。试验表明灌胃高低浓度的鹅皮胶原蛋白肽后的致衰小鼠血清中的总胆固醇(TC)含量、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量、动脉硬化指数(LDL-C/HDL-C)等指标都显著降低，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量和抗动脉粥样硬化因子(HDL-C/TC)水平显著增加；试验还表明，灌胃鹅皮胶原多肽 P4组分后，致衰小鼠血清和肝脏中的MAD含量降低，SOD、TAC、GSH-Px及CAT等酶酶活显著提高。此外，对小鼠脾脏指数及胸腺指数的测定发现鹅皮胶原多肽 P4组分对小鼠免疫能力有一定提高作用。四、体外培养小鼠 B16黑素瘤细胞，研究鹅皮胶原多肽 P4对小鼠 B16黑色素瘤细胞黑素中合成的影响。当鹅皮胶原多肽P4浓度达到100μg/ml时，黑素降低33.11%（P<0.01），酪氨酸酶活性降低27.76%（P<0.01）；使用含有鹅皮胶原多肽 P4的完全培养液培养 B16黑素瘤细胞时，细胞中 GSH水平升高，GSSH水平降低，有效地提高了细胞内还原能力；随着鹅皮胶原多肽 P4浓度的升高，cAMP含量逐渐下降，在浓度为50μg/ml时，细胞中 cAMP含量下降40.75%（P<0.01），抑制了B16黑素细胞中黑素的合成。收起

关键词 : 鹅皮胶原蛋白抗氧化性酪氨酸酶提取工艺

10. 吸收嘌呤核苷的乳酸菌筛选及其降血尿酸功能研究

[学位论文] 徐珏南京师范大学 2021年硕士导师: 潘道东共75页

摘要 : 现阶段，我国人民饮食结构呈现多元化，高嘌呤食物摄入量增多，高尿酸血症等疾病的发病率也明显增加。此现象虽已得到重视，但患者尿酸的综合管理仍然不理想，现行药物治疗副作用不可轻视且严格的饮食的控制极困难，有报道称肠道菌群与高尿酸血症的发... 展开现阶段，我国人民饮食结构呈现多元化，高嘌呤食物摄入量增多，高尿酸血症等疾病的发病率也明显增加。此现象虽已得到重视，但患者尿酸的综合管理仍然不理想，现行药物治疗副作用不可轻视且严格的饮食的控制极困难，有报道称肠道菌群与高尿酸血症的发病有必然关系。而作为人体肠道内的有益菌——乳酸菌，其本身也具有益生性，口服乳酸菌干预尿酸的代谢，或可作为治疗高尿酸血症和痛风的新方法。因此，本研究经过筛选得到了一株具备高效吸收嘌呤核苷作用的乳酸菌，并探究了其生理及益生特性。基于转录组学探究了菌株吸收降解嘌呤核苷的机制，通过构造高尿酸血症大鼠模型评估了该菌株对高尿酸血症及引发的痛风性肾病的缓解治疗效果，以期为微生态缓解高尿酸血症及痛风类疾病开发提供新思路。主要研究结果归纳如下： 1.分离筛选出1株吸收嘌呤核苷能力比较强的短乳杆菌属菌株，该菌分类命名为短乳杆菌（Lactobacillusbrevis）PDD-5株，保藏编号为CGMCCNo.20573。其对肌苷、鸟苷的吸收率分别为68.86%、95.75%。经益生特性结果分析，菌株显著抑制大肠杆菌等致病菌，且其有较好的耐酸耐胆盐特性及较强疏水性。 2.通过对短乳杆菌PDD-5进行高通量测序，根据L.brevisATCC14869的参考基因对照得出共有1158个基因表达显著，其中有605个基因表达显著上调，553个基因表达显著下调，并通过KEGG数据库富集信号通路。选择嘌呤代谢通路进行分析推测出短乳杆菌PDD-5可以高效代谢嘌呤核苷，且短乳杆菌PDD-5不含有组成与黄嘌呤氧化酶功能相似的酶的基因，代谢产物黄嘌呤没有大量代谢成尿酸，而是被代谢成碳酸氢根离子与氨。 3.通过构建高尿酸血症大鼠模型验证短乳杆菌PDD-5对高尿酸血症动物模型的保护治疗作用，且可有效间接缓解高尿酸血症引发的尿酸性肾病的相关症状。具体表现为：乳酸菌可在肠道内定植并吸收降解肌苷及鸟苷，从而降低大鼠的血尿酸、肌酐及尿素氮水平，尿酸盐结晶减少，以缓解尿酸性肾病，降低肾脏组织中caspase-1的表达，从而减少白细胞介素IL-1β，抑制NLRP3炎性体活性来缓解高尿酸血症引发的尿酸性肾病。综上，本课题发现通过筛选吸收嘌呤核苷能力较强的菌株并且基于转录组学探究了短乳杆菌PDD-5在嘌呤代谢通路中的特异性，分析出短乳杆菌PDD-5或可将嘌呤核苷类物质吸收降解成碳酸氢根离子辅助降尿酸，并通过动物实验证明该菌株保护治疗高尿酸血症及其引发的尿酸性肾病是可行的，可为后续微生态缓解治疗高尿酸血症、痛风类疾病以及乳酸菌的研究提供理论依据。收起

关键词 : 高尿酸血症痛风类疾病乳酸菌菌株筛选嘌呤核苷吸收能力降血尿酸功能