中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 董朔晖山东大学 2022年博士导师: 胡三元共378页

摘要 : 研究背景近年来，我国结直肠癌(CRC)的发病率和死亡率均呈攀升趋势，成为严重威胁我国居民生命健康的恶性肿瘤之一。尽管目前已经形成手术治疗、化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗等相互协作的CRC综合治疗体系，但由于CRC的高转移率和高复发率，导... 展开研究背景近年来，我国结直肠癌(CRC)的发病率和死亡率均呈攀升趋势，成为严重威胁我国居民生命健康的恶性肿瘤之一。尽管目前已经形成手术治疗、化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗等相互协作的CRC综合治疗体系，但由于CRC的高转移率和高复发率，导致其预后仍然很差。对于进展和转移的CRC患者，化疗是主要的治疗方法之一，其中氟尿嘧啶(5-FU)及其衍生物是用于CRC单药或联合化疗的一线药物和最关键成分。尽管5-FU及其衍生物在CRC的治疗中具有重要地位，但患者在接受5-FU治疗的过程中会较为普遍地产生耐药，这也是CRC患者治疗失败的重要原因之一。因此，寻找用于CRC细胞5-FU耐药预测和动态监测的分子标志物，深入探究CRC细胞5-FU耐药发生发展的机制，寻找具有普遍适用性的逆转CRC细胞5-FU耐药的治疗手段是当前CRC研究领域的重要基础与临床转化问题。 5-FU是一种抗代谢类的化疗药物，直接参与肿瘤细胞的核苷酸代谢，进而广泛地影响糖类、脂质、氨基酸等物质能量代谢。肿瘤细胞代谢的适应性改变被称为代谢重编程，已有研究表明肿瘤细胞的代谢重编程可以确保能量的供应，并且提供生长、增殖的原料，是肿瘤发生发展和化疗耐药的关键因素，针对代谢重编程的治疗策略可能成为直接或间接提高化疗敏感性的潜在手段。CRC细胞5-FU耐药性获得的过程中发生的代谢重编程尚未被深入研究，因此本研究拟从5-FU耐药CRC发生的糖脂代谢重编程现象为切入点，深入探究相关分子机制，寻找具有普遍适用性的逆转CRC细胞5-FU耐药的策略。葡萄糖代谢重编程将直接影响肿瘤细胞的能量供应模式，并决定其恶性生物学行为，如果能明确CRC细胞出现5-FU耐药时发生的葡萄糖代谢重编程事件，或许可以发现新的CRC细胞5-FU耐药的分子机制，并找到具有普遍适用性的逆转5-FU耐药的方法。最近的研究发现，缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在5-FU耐药的CRC细胞中表达上调，结合HIF-1α对糖酵解的强大调控能力，以及糖酵解增强和化疗耐药之间的相关性，我们推测HIF-1α介导的糖代谢重编程可能会导致CRC细胞对5-FU的耐药。此外，有研究报道CD147与化疗耐药密切相关，已经在卵巢癌、肾癌、卡波西肉瘤的化疗耐药性肿瘤中观察到CD147的过表达，由于CD147是参与乳酸转运的重要膜蛋白而被视为是糖酵解的调控分子，目前尚未有研究揭示CD147在5-FU耐药CRC细胞中的变化与作用，我们推测CD147可能会通过调控糖酵解而影响CRC细胞对5-FU的敏感性。肿瘤细胞除了高度依赖葡萄糖来维持能量代谢并产生增殖和侵袭等表型外，越来越多的研究表明肿瘤细胞的能量供应还依赖于脂代谢重编程。肿瘤细胞较为普遍地表现为对外源性脂肪酸的利用能力下降、脂肪酸从头合成途径增加，以及脂肪酸氧化(FAO)能力增强。但目前尚未有研究深入探究CRC细胞对5-FU耐药时发生的脂代谢重编程事件，因此，本研究拟以此为突破点，探究5-FU耐药CRC细胞的脂代谢重编程事件，并寻找逆转CRC细胞5-FU耐药可能的方法。有研究报道CD147与肿瘤细胞的脂肪酸从头合成途径和FAO有关，考虑到CD147与化疗耐药之间密切的关系，我们推测CD147介导的脂代谢重编程可能会导致CRC细胞对5-FU产生耐药性。研究目的本研究拟探究CRC细胞产生5-FU耐药性的过程中发生的糖脂代谢重编程事件，并探究HIF-1α和CD147是否参与调控糖脂代谢重编程并介导CRC细胞获得5-FU耐药性。评估HIF-1α和CD147能否作为CRC细胞5-FU耐药预测和动态监测的分子标志物，明确HIF-1α和CD147是否有成为5-FU耐药CRC治疗靶点的潜在价值。深入探究HIF-1α和CD147在5-FU耐药CRC细胞中高表达的分子调控机制。研究方法2 首先，构建CRC细胞5-FU耐药的研究模型:通过“药物持续接触浓度递增法”构建获得性5-FU耐药的CRC细胞模型，并通过鉴定5-FU刺激后耐药型CRC细胞增殖能力、‘细胞周期、凋亡等的变化，评估细胞模型的耐药性;BALB/c裸鼠皮下注射细胞悬液构建人源肿瘤细胞系异种移植(CDX)模型;NOD/SCID小鼠皮下种植人肿瘤组织(来源于一例TNMⅢ期的男性直肠癌患者，患者术前接受过含5-FU的新辅助化疗)构建人源肿瘤组织来源移植瘤(PDX)模型。此外，收集42例CRC患者的肿瘤标本和临床病理资料，患者均为TNM分期Ⅲ期或Ⅳ期的CRC患者，根据是否接受术前化疗(含5-FU及其类似物的化疗方案)以及是否对化疗有反应分为无化疗组、反应组、无反应组三个组。为了探究CRC细胞产生5-FU耐药性的过程中发生的糖代谢重编程事件，我们开展了一系列研究:通过流式细胞仪、透射电子显微镜、细胞氧消耗率(OCR)动态监测评估5-FU耐药型CRC细胞线粒体数目、形态和功能的变化，并通过蛋白印迹(WB)和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测线粒体呼吸链的变化;通过检测5一FU耐药型CRC细胞葡萄糖摄取能力、细胞内乳酸含量、细胞乳酸释放量，以及CDX模型肿瘤葡萄糖摄取能力和乳酸含量，来评估5-FU耐药型CRC细胞对葡萄糖和乳酸的代谢特征;接着，通过超高效液相色谱-串联四极杆质谱(UHPLC-MS/MS)、WB、RT-qPCR、细胞外酸化率(ECAR)动态监测评估5-FU耐药型CRC细胞糖酵解途径、磷酸戊糖途径以及三羧酸循环的变化;最后，在CDX模型和CRC患者原发肿瘤标本中检测糖代谢相关酶和膜转运蛋白的表达。为了明确5-FU耐药的CRC细胞发生的脂代谢重编程事件，我们进行了如下研究:检测5-FU耐药型CRC细胞甘油三酯和总胆固醇的含量;在高脂培养基中培养5-FU耐药型CRC细胞，并通过油红O染色来检测脂滴的形成能力和细胞对外源性脂肪酸的处理能力;还通过FAOBlue探针检测5-FU耐药型CRC细胞的FAO能力;最后，在CDX模型和CRC患者原发肿瘤标本中检测FAO相关酶的表达。接着，通过WB、RT-qPCR、免疫细胞荧光等方法检测HIF-1α和CD147在5-FU耐药型CRC细胞中的表达与空间分布。为了探究HIF-1α和CD147是否参与调控糖脂代谢重编程并介导CRC细胞获得5-FU耐药性，我们通过小干扰RNA(siRNA)或慢病毒装载的短发夹RNA(shRNA)构建抑制HIF1A或CD147基因表达的细胞模型。观察抑制HIFlA或CD147基因表达后，5-FU耐药型CRC细胞的耐药性和糖脂代谢重编程事件能否被完全或部分逆转。为了评估HIF-1α和CD147能否作为CRC细胞5-FU耐药预测和动态监测的分子标志物，我们检测并分析了CRC患者的肿瘤组织、循环肿瘤细胞(CTC)和临床病理资料，还分析了GEO数据库的CRC患者数据集。为了明确HIF-1α和CD147是否有成为5-FU耐药CRC治疗靶点的潜在价值，我们在CDX模型和PDX模型中通过抑制基因表达或注射小分子抑制剂分别抑制HIF-1α和CD147的表达，并检测肿瘤增殖能力和对5-FU反应性的变化。最后，探究了HIF-1α和CD147在5-FU耐药CRC细胞中高表达的分子调控机制。为了验证活性氧(ROS)是否可以通过P13K/Akt信号通路调控HIF-1α表达，本研究使用过氧化氢叔丁醇(t-BHP)和N-乙酰半胱氨酸分别构建ROS过载和ROS清除的CRC细胞模型，并通过WB和RT-qPCR检测P13K/Akt信号通路、HIF-1α表达、5-FU耐药性以及糖代谢表型的变化。为了验证Wnt/β-Catenin信号通路是否参与调节HIF-1α的表达，使用13-Catenin的抑制剂或siRNA抑制B-Catenin表达，通过WB、RT-qPCR、免疫荧光、蛋白半衰期检测、免疫共沉淀(co-IP)等方法证明β-Catenin和HIF-1α的是否存在相互作用。为了验证CD147能否通过激活P13K/Ah/mTOR信号通路来上调HIF-1α并激活糖酵解，使用shRNA抑制CD147基因表达，并使用多种激动剂和抑制剂调节PI3K/Ak/mTOR信号通路的活性，来检测HIF-1α的表达和糖酵解活性。为了研究CD147能否通过激活的MAPK信号通路下调PPARa的表达并抑制5-FU耐药CRC细胞的FAO，同样使用shRNA抑制CD147基因表达，还使用了ERKMAPK信号通路的激动剂和抑制剂，检测PPARα如的表达和细胞FAO能力。研究结果通过CCK-8细胞毒性试验检测5-FU耐药型CRC细胞的耐药指数(RI)，RI均大于10，5-FU刺激后检测5-FU耐药型CRC细胞的增殖能力、细胞周期和凋亡的变化，发现其对5-FU反应不敏感，证明5-FU耐药的CRC细胞模型构建成功。此外，还成功构建了CDX模型和PDX模型用于体内实验。检测5-FU耐药型CRC细胞的线粒体，发现线粒体含量下降、形态破坏、OCR显著降低、线粒体呼吸链的成分蛋白表达减少，提示5-FU耐药型CRC细胞的线粒体结构与功能均出现破坏。评估5-FU耐药型CRC细胞对葡萄糖和乳酸的利用能力，发现耐药型细胞葡萄糖摄取能力增强、葡萄糖依赖性增加、乳酸释放能力增加、乳酸作为替代碳源的利用增加，在CDX模型上开展的体内实验也发现葡萄糖摄取能力增强、瘤体乳酸含量增加。通过检测中心碳代谢途径(三羧酸循环、糖酵解、磷酸戊糖途径)中间产物和酶表达的变化，发现5-FU耐药型CRC细胞的三羧酸循环减弱，糖酵解和磷酸戊糖途径增强。评估5-FU耐药型CRC细胞的脂代谢特征，发现5-FU耐药型CRC细胞甘油三酯和总胆固醇含量增加、外源性脂肪酸摄取能力增强、脂滴形成增多、外源性脂肪酸消耗能力减弱、FAO减弱。检测HIF-1α和CD147在5-FU耐药型CRC细胞中的表达，发现HIF-1α在mRNA和蛋白水平表达均升高、蛋白稳定性增加、细胞核内分布增多、对缺氧环境响应更加敏感，发现CD147在mRNA和蛋白水平的表达也均升高、细胞膜上的表达明显增加。通过shRNA抑制HIF1A或CD147基因表达后，5-FU耐药型CRC细胞的耐药性和糖脂代谢重编程事件被部分逆转;提示HIF-1α和CD147参与调控了5-FU耐药型CRC细胞的糖脂代谢重编程并介导CRC细胞获得5-FU耐药性。我们通过分析CRC患者的组织和血液标本，以及临床病理资料，发现CRC对5-FU类药物的耐药与肿瘤细胞中HIF-1α或CD147的表达增加有关，特别是HIF-1α阳性CTC的检出提示5-FU耐药的出现，对CI地患者5-FU类药物的化疗可能有动态监测的价值。此外，对于接受过含5-FU及其类似物化疗的CRC患者，HIF-1α或CD147高表达与无病生存期之间存在显著相关性。但是接受5-FU类药物化疗前，原发肿瘤HIF1AmRNA的水平并不能预测化疗效果。在CDX模型和PDX模型中发现，通过shRNA抑制基因表达或注射小分子抑制剂抑制HIF-1α或CD147的表达，均可以抑制肿瘤在体内的增殖能力，并部分恢复对5-FU的敏感性，表明HIF-1α和CD147是5-FU耐药CRC可能的干预靶点。最后，研究HIF-1α和CD147在5-FU耐药CRC细胞中高表达的分子调控机制，结果表明:在5-FU耐药型CRC细胞中，过载的ROS可以通过激活P13K/Akt信号通路上调HIF-1α的表达，从而导致糖酵解增加和5-FU耐药;β-Catenin可以与耐药型CRC细胞中的HIF-1α结合形成转录复合体，促进HIF-1α迁移进入细胞核，并增加HIF-1α的稳定性;CD147可以通过激活P13K/Akt/mTOR信号通路来上调5-FU耐药CRC细胞中的HIF-1α水平，进而调控耐药型CRC细胞增强的5-FU耐药性和糖酵解;CD147还可以通过激活MAPK信号通路来下调5-FU耐药CRC细胞中的PPARa水平，介导耐药型CRC细胞增强的5-FU耐药性收起

关键词 : 结直肠癌氟尿嘧啶化疗耐药代谢重编程脂肪酸氧化缺氧诱导因子1&alpha

2. Ad-p16、Ad-p53联合紫杉醇治疗乳腺癌的实验研究

[学位论文] 阮永威山东大学 2007年博士导师: 金星共259页

摘要 : 乳腺癌p16，p53基因蛋白及其mRNA表达的研究目的乳腺癌位居女性恶性肿瘤之首，全球每年大约有40万人死于乳腺癌，同时发病率呈逐年上升、发病呈现年轻化之势。大量研究表明，癌基因、肿瘤抑制基因(抑癌基因)的异常与乳腺癌的发生、发展密切相关。如p1... 展开

关键词 : 腺病毒基因载体 p16基因 p53基因基因蛋白乳腺肿瘤动物模型细胞凋亡 mRNA表达

3. 胃癌预后和化疗生存获益预测模型及中性粒细胞促癌机制研究

[学位论文] 江玉明南方医科大学 2018年博士导师: 李国新共233页

摘要 : TNM分期系统是胃癌患者预后预测的重要参考，但是相同分期和化疗方案治疗的患者常常预后差异明显，表明当前的分期系统不能提供充分的预后信息，也不能预测哪些患者从化疗中获益。因此，急需新的策略补充当前分期系统以提高预后预测和治疗选择的准确性... 展开 TNM分期系统是胃癌患者预后预测的重要参考，但是相同分期和化疗方案治疗的患者常常预后差异明显，表明当前的分期系统不能提供充分的预后信息，也不能预测哪些患者从化疗中获益。因此，急需新的策略补充当前分期系统以提高预后预测和治疗选择的准确性。肿瘤进展是“种子”（癌细胞）和“土壤”（间质）相互作用的结果。肿瘤组织浸润的免疫细胞是肿瘤间质的重要组分，在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用，具有重要的预后预测价值，其中中性粒细胞是重要的组分，但其在胃癌中的作用仍不明确。为了更加准确的预测胃癌预后和化疗生存获益，本研究根据胃癌多维度的生物学特征从多角度构建了5组预测模型;同时研究了中性粒细胞促进胃癌进展的机制。获得以下主要结果： 1.免疫评分预测胃癌预后和化疗生存获益以879例胃癌组织免疫组化染色为基础，分析27个免疫特征的表达及与预后的关系，构建了由5个特征组成的免疫评分(ISGC)模型：CD3invasive margin(IM)，CD3center of tumor(CT)，CD8IM，CD45ROCT，CD66bIM。发现ISGC与OS和DFS显著相关，多因素分析显示ISGC是独立的预后预测因素，而且ISGC可以增强TNM分期的预后预测准确性。此外，ISGC高评分的Ⅱ和Ⅲ期患者化疗生存获益更明显。 2.临床病理特征Nomograms预测Ⅱ和Ⅲ期胃癌患者化疗生存获益回顾性分析了1719例Ⅱ和Ⅲ期患者的数据，Cox回归显示年龄，肿瘤位置，分化程度，CEA，CA199，T分期，N分期，辅助化疗与OS和DFS显著相关，整合这些参数构建nomograms模型并且具有良好的预测准确性，利用此模型可以个体化计算患者化疗生存获益。 3.免疫多特征SVM分类器预测胃癌预后和化疗生存获益运用SVM算法整合性别，CEA，淋巴结转移，CD3IM，CD3CT，CD8IM，CD45ROCT，CD57IM，CD68CT，CD66bIM和CD34共11个特征构建了GC-SVM分类器。GC-SVM分类器与OS和DFS显著相关，是独立的预后预测因素，并且有助于鉴别从化疗中获益的Ⅱ和Ⅲ期患者。 4.基于6个生物标志物的SVM模型预测Ⅱ和Ⅲ期患者化疗生存获益以583例胃癌组织免疫组化染色为基础，分析6个肿瘤标志物(PAK6，COX-2，p21WAF1，Ki-67，TS和ERCC1)与化疗反应的关系，发现PAK6高表达减弱对5-FU/oxaliplatin化疗的敏感性，整合6个标志物构建SVM模型（CS-SVM分类器），CS-SVM分类器可帮助鉴别能从5-FU/oxaliplatin化疗中获益的Ⅱ和Ⅲ期患者。 5.Radiomics signature预测胃癌预后和化疗生存获益回顾性分析了1591例患者的增强CT图像，从图像病灶区域提取定量影像组学特征，运用LASSO Cox回归筛选出19个特征构建Radiomics signature，Radiomics signature可以有效的预测预后和增强TNM分期系统的预测能力。而且Radiomics评分越高的Ⅱ和Ⅲ期患者化疗生存获益越明显。 6.IL-17+中性粒细胞通过血管生成促进胃癌进展胃癌组织免疫组化染色发现中性粒细胞主要聚集在侵袭边缘并与胃癌进展密切相关，免疫荧光双染检测发现侵袭边缘的中性粒细胞高表达IL-17。IL-17刺激胃癌细胞产生大量炎症趋化因子，而该类因子能够趋化中性粒细胞。浸润的中性粒细胞能显著产生MMP-9，而这些MMP-9刺激胃癌细胞产生促血管因子，进而促进肿瘤侵袭边缘区域的微血管生成。收起

关键词 : 胃癌化学治疗预后分析中性粒细胞促癌机制生存获益预测模型

4. 整合素β6在胆管癌中的表达状况及作用机制研究

[学位论文] 李泽群山东大学 2017年博士导师: 牛军；张利宁共222页

摘要 : 研究背景和意义：胆管癌(Cholangiocarcinoma)最早在1840年由Durand-Fardel教授报道，该肿瘤是一种胆管上皮源性的、高度恶性的肿瘤。在2010年第七版美国癌症联合委员会(the American Joint Committee on Cancer，AJCC)的分类中，根据发生部位不... 展开研究背景和意义：胆管癌(Cholangiocarcinoma)最早在1840年由Durand-Fardel教授报道，该肿瘤是一种胆管上皮源性的、高度恶性的肿瘤。在2010年第七版美国癌症联合委员会(the American Joint Committee on Cancer，AJCC)的分类中，根据发生部位不同胆管癌可以分为肝内胆管癌(ICC)和肝外胆管癌(ECC)。ICC源于肝内胆管以及其细小分支胆管树的衬覆上皮;而对于ECC，以胆囊管与肝总管汇合处分界，可进一步分为肝门部胆管癌（又称Klatskin瘤）和远端胆管癌。尽管在世界范围内，胆管癌的发病率仅占所有消化系统恶性肿瘤的3％左右，但作为肝胆系统第二常见的原发性恶性肿瘤，其发病率与死亡率，尤其是ICC，近年来持续增高。目前为止，根治性手术切除是胆管癌唯一有效的根治方法。然而，由于该病起病隐匿、无特征性的早期临床表现，且该肿瘤极易发生淋巴结和远端转移，患者往往在确诊时就已经处于肿瘤晚期，失去了根治性切除的机会。此外，胆管癌对辅助放疗及化疗的敏感性低，放化疗并不能有效降低肿瘤复发的风险。上述这些因素导致绝大多数胆管癌患者的预后不良，5年生存率只有5％左右。因此，探寻在胆管癌发生发展过程中，尤其是其侵袭及转移过程中发挥重要作用的分子，明确其侵袭及转移的机制，对于治疗胆管癌和降低死亡率具有十分重要的意义。整合素属于细胞表面黏附分子家族成员，是一类由α亚单位及β亚单位以非共价键结合的方式组成的跨膜糖蛋白受体。整合素αvβ6是迄今为止发现的唯一一种含有β6亚基的整合素，其表达特征为在胚胎发育时期、组织修复时以及在恶性上皮性肿瘤组织中高表达，而在正常上皮组织、上皮良性肿瘤组织以及其它类型恶性肿瘤组织中不表达。现阶段研究已经证实整合素αvβ6在胃癌、结直肠癌(CRC)、胰腺导管腺癌(PDAC)等多种消化道恶性肿瘤中表达显著提高，且αvβ6的表达水平与上述多种肿瘤的侵袭转移能力密切相关。此外，整合素αvβ6可通过活化多种经典的促癌信号通路而促进肿瘤的发生发展。近年来我们团队研究发现αvβ6并不是固定表达于细胞膜表面，而是通过其自身的内吞胞吐循环过程在细胞质与细胞膜之间进行快速地穿梭，该内吞胞吐循环过程对肿瘤细胞与细胞外基质(ECM)之间的相互作用及肿瘤细胞的迁移运动起到了关键促进作用。我们前期研究还发现αvβ6的β6亚基可直接与细胞外调节蛋白激酶2(ERK2)连接，该直接连接可活化ERK2下游相关信号通路并进一步通过介导基质金属蛋白酶(MMPs)的表达而促进肿瘤细胞的侵袭。此外，整合素β6还可以通过与SDF-1及IL-8等趋化因子协同作用，共同促进肿瘤细胞的器官靶向转移。在肿瘤组织中特异性表达的特性及其在促进肿瘤恶行进展过程中发挥的重要作用使得整合素β6成为一个肿瘤诊断与治疗的潜在靶点。但是，作为在多种消化道恶性肿瘤中发挥关键作用的重要分子，整合素β6在胆管癌中的表达情况及作用机制仍然不得而知。 Rac蛋白属于Rho家族小GTP酶的重要成员之一，该家族成员包括Rac1，Rac2，Rac3和Rac1b。目前为止对于该家族成员的相关研究多集中于Rac1方面。Rac1可作为细胞表面受体下游的关键分子，通过调控多种信号通路而维持细胞的各项正常生理功能。研究发现Rac1在包括胃癌、结直肠癌、胰腺癌等多种消化道肿瘤组织中表达升高或活性增强，表达上调及活化后的Rac1参与了肿瘤细胞恶性生物学行为的多个方面，如肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭和转移等过程。其中Rac1对肿瘤细胞侵袭转移的关键促进作用使其成为相关领域的研究热点。该作用涉及侵袭转移过程中的多个重要环节，如细胞伪足的形成、细胞与细胞之间的结合、细胞与ECM之间的结合、ECM中胶原成分的水解等。现阶段研究证实了Rac1在多种胆管癌细胞系中均为高表达，且Rac1对于胆管癌细胞肿瘤微环境的形成、化疗耐药等过程起到至关重要的作用，但有关Rac1促进胆管癌侵袭转移的作用及相应机制目前为止仍知之甚少。为了明确整合素β6在胆管癌中的表达情况及作用机制，为以β6为靶点设计合成抗肿瘤药物提供研究基础与理论支持，本文从以下四个方面进行了研究论证。(1)收集了山东大学齐鲁医院共95例胆管癌患者的病理组织标本及相应临床资料，通过免疫组化的方式检测了整合素β6在胆管癌组织及相应癌旁组织中的表达情况，分析了β6表达情况与患者临床病理特征的关系，并进一步利用ROC分析明确了β6可作为胆管癌诊断的一个免疫组化指标，且β6表达情况可有效预测淋巴结转移。(2)随后通过一系列体外实验证实β6能够显著促进胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。(3)进一步实验我们从多个角度研究发现β6是通过活化Rac1，进而增加F-actin的聚合及MMP-9的分泌而促进胆管癌细胞的迁移侵袭。(4)最后，我们利用裸鼠皮下成瘤动物模型进一步验证了β6促进肿瘤发展的结论。通过本项目研究我们发现了整合素β6在肿瘤发展过程中作用的一个关键靶点——Rac1，鉴于Rac1在肿瘤发生发展过程中起到的关键作用，提示针对性地干预β6将有望减少胆管癌的侵袭转移，对于胆管癌患者的综合治疗具有十分重要的临床意义和应用前景。第一部分：整合素β6在胆管癌组织中的表达情况及临床病理特征的研究目的：明确整合素β6在胆管癌组织及相应癌旁组织中的表达情况，分析β6表达与患者各项临床病理特征的联系，探究整合素β6表达状况的临床病理学意义。方法： 1.收集山东大学齐鲁医院于2006-2013年期间手术切除的胆管癌肿瘤组织及相应癌旁组织病理标本，并采集了相关临床资料，采集的资料包括性别与年龄等一般资料，血清CA19-9水平，血清CEA水平，术后病理信息（包括浸润深度、淋巴结转移情况、肿瘤分化情况等）及远处转移情况等。 2.在患者家属知情同意的基础上，采用免疫组织化学(IHC)的方法从蛋白水平检测胆管癌肿瘤组织及相应癌旁组织中β6的表达情况，并邀请两名病理学家进行免疫组化评分，结合相关临床病理学参数，利用卡方检验将量化的免疫组化评分结果进行统计分析。 3.根据统计学结果进一步利用ROC曲线分析β6作为胆管癌组织免疫组化指标及预测淋巴结转移的敏感性与特异性。结果： 1.研究共收集95例胆管癌组织标本及其相应的癌旁组织标本，免疫组化结果显示整合素β6在胆管癌组织中呈中-高程度表达，其表达位置主要位于细胞膜，胞浆中也可见少量表达，而在相应的癌旁组织中整合素β6几乎不表达。 2.β6的表达情况与淋巴结转移(P=0.0003)、远处转移(P=0.0126)密切相关，而与年龄、性别、血清CA19-9与CEA水平、浸润深度及肿瘤分化情况无关(P＞0.05)。 3.ROC分析胆管癌与癌旁组织β6表达情况的结果表明，β6高表达时其可作为胆管癌诊断的免疫组化标记（曲线下面积AUC=0.876，P＜0.001），其敏感性与特异性分别为78.95％、93.68％。ROC分析伴或不伴有淋巴结转移的胆管癌患者肿瘤组织中整合素β6表达情况的结果表明，当肿瘤组织免疫组化评分＞5分时可有效预测淋巴结转移(AUC=0.701，P＜0.001)，其敏感性与特异性分别为77.55％及63.04％。结论及意义：整合素β6在胆管癌组织中表达明显上调，且其表达情况与患者的淋巴结转移及远处转移情况密切相关。整合素β6可以作为诊断胆管癌的免疫组化标记物，且当肿瘤组织β6表达的免疫组化评分＞5时，患者发生淋巴结转移的可能性大。故我们建议胆管癌手术切除标本常规行β6免疫组化染色，在辅助诊断胆管癌的同时，可用来预测患者淋巴结转移的情况以及推断肿瘤的恶性程度。该部分结果提示整合素β6可能在胆管癌侵袭转移过程中发挥重要作用，为进一步探讨整合素β6对胆管癌细胞恶行生物学行为的作用提供了一定的理论基础。第二部分：整合素β6对胆管癌细胞恶性生物学行为的研究目的：在确定整合素β6在胆管癌组织中表达明显上调且与淋巴结转移及远处转移密切相关后，明确整合素β6对胆管癌细胞的活性、增殖能力、迁移及侵袭能力等恶性生物学行为的作用。方法： 1.利用quantitative Real-time PCR、Western blot检测两种胆管癌细胞系RBE和QBC939细胞中β6的表达情况。 2.分别将胆管癌细胞RBE及QBC939分为4组，对照组(NC)及β6干扰组(siβ6);空白质粒对照组(Mock)及β6过表达组(β6 transfectant)。分别利用quantitative Real-time PCR及Western blot在mRNA水平及蛋白水平检测干扰效果及过表达效果。 3.采用CCK8法检测干扰或过表达整合素β6后胆管癌细胞RBE和QBC939活性的变化。 4.采用MTT法检测干扰或过表达整合素β6后胆管癌细胞RBE和QBC939增殖能力的变化情况。 5.利用细胞划痕实验及Transwell实验检测上述各组胆管癌细胞迁移能力的差异。 6.利用预先包被Matri-gel的Transwell侵袭小室检测干扰或过表达整合素β6后胆管癌细胞侵袭能力的变化情况。结果： 1.胆管癌细胞RBE及QBC939在mRNA水平和蛋白水平均中度表达β6，siβ6可显著降低两种细胞中整合素β6的表达，而转染整合素β6过表达质粒后可在mRNA及蛋白水平上检测到β6表达明显升高。 2.CCK8实验表明干扰β6表达后，两种胆管癌细胞系细胞活性受到明显抑制，而过表达β6后，细胞活性显著增加。 3.MTT实验证实，干扰整合素β6表达可显著抑制胆管癌细胞的增殖能力，反之过表达整合素β6则可促进胆管癌细胞的增殖。 4.细胞划痕与Transwell实验结果表明，干扰整合素β6表达可显著抑制胆管癌细胞的迁移能力，而过表达整合素β6可促进胆管癌细胞的迁移。 5.利用预先包被Matri-gel的Transwell小室我们发现干扰整合素β6表达后，胆管癌细胞的侵袭能力显著降低，而过表达整合素β6可明显提高胆管癌细胞的侵袭能力。结论及意义：本部分内容旨在研究整合素β6对胆管癌细胞各项恶行生物学行为的影响。首先明确了 RBE与QBC939两种细胞系中在mRNA水平及蛋白水平均有中等量β6的表达，故进一步均对两种细胞进行了β6干扰及过表达处理，随后利用CCK8、MTT、细胞划痕及Transwell实验探究了β6对这两种胆管癌细胞的活性、增殖能力、迁移及侵袭能力的影响。本部分实验结果表明，整合素β6可以显著促进胆管癌细胞的活性、增殖能力、迁移能力及侵袭能力。该部分研究丰富了胆管癌发生发展的理论基础，也补充了整合素β6对在胆管癌作用研究方面的空白，并为进一步探究整合素β6促进胆管癌侵袭转移的具体机制研究打下了基础。第三部分：整合素β6通过活化Rac1促进胆管癌细胞侵袭转移目的：研究发现Rac1是肿瘤发生发展尤其是侵袭转移过程中的关键分子，在组织学及细胞学实验确定整合素β6与胆管癌侵袭转移密切相关后，探究整合素β6是否通过Rac1通路促进胆管癌细胞侵袭转移。方法： 1.干扰或过表达β6后，PAK-PBD pull down实验检测细胞Rac1的活性。 2.利用不同浓度的Rac1抑制剂处理胆管癌细胞RBE及QBC939，随后检测处理后胆管癌细胞迁移能力和侵袭能力的变化情况。 3.胆管癌细胞RBE及QBC939利用50μM的NSC23766处理后，分别转染空白质粒及β6过表达质粒，Transwell检测两种胆管癌细胞迁移能力和侵袭能力的变化情况。 4.胆管癌细胞RBE及QBC939均分为四组收起

关键词 : 整合素&beta 6 胆管癌临床病理特征生物学行为

5. TXNL2在肿瘤中的表达和功能研究及sFRP1和sFRP3在胃癌中的表达和功能研究

[学位论文] 瞿颖上海交通大学 2011年博士导师: 刘炳亚;朱正纲;顾琴龙;燕敏;Prof.Xiaojiang Cui 共217页

摘要 : 目的：肿瘤细胞拥有较强的抗氧化能力系统，可中和肿瘤因高代谢率而引起的细胞内ROS水平过高。ROS在研究发现可促进肿瘤的发生和发展，但是过高的过氧化压力超过细胞可中和的能力则会导致细胞不可逆的损伤而影响细胞存活。分子量为38kD的TXNL2是一个T... 展开目的：肿瘤细胞拥有较强的抗氧化能力系统，可中和肿瘤因高代谢率而引起的细胞内ROS水平过高。ROS在研究发现可促进肿瘤的发生和发展，但是过高的过氧化压力超过细胞可中和的能力则会导致细胞不可逆的损伤而影响细胞存活。分子量为38kD的TXNL2是一个Trx相关蛋白，其蛋白结构有Trx和Grx同源结构域。TXNL2在真核细胞中表达，但是其功能没有相关研究报道。胃癌是我国最为常见的恶性肿瘤之一，且进展期胃癌患者占我国胃癌患者大多数。进展期胃癌患者接受胃癌标准根治术后的5年生存率仍不容乐观，其根本原因在于胃癌的病因及发病机制未明。因此，深入研究胃癌发生发展的分子生物学基础，有助于寻找胃癌治疗的新靶点，从而有效改善胃癌患者的预后。约有30-50％的胃癌中存在Wnt信号通路异常激活，sFRP1和sFRP3是Wnt信号通路的调控蛋白，本课题研究的主要目的在于探讨sFRP1和sFRP3在胃癌组织中的表达和功能，并探索其调控机制。方法：通过Oncomine网上数据库分析TXNL2在人肿瘤组织中的表达。通过免疫组化的方法分析其在乳腺癌组织中的表达。构建TXNL2下调的乳腺癌细胞株模型，对影响细胞增殖和转移能力进行体内和体外的研究。通过基因芯片技术分析可能的下游基因，并对信号通路进行具体研究。分析收集带随访资料的85例胃癌的肿瘤组织及其对应癌旁组织，运用免疫组织化学染色的方法，检测sFRP1的表达情况并分析与临床病理资料和病人生存期的相关性。利用稳定过表达sFRP1胃癌细胞株为模型，通过体内和体外实验研究sFRP1对胃癌细胞生长和侵袭中的作用。使用AffymetrixU133 plus2.0 array全基因表达谱芯片对sFRP1过表达细胞和对照细胞进行cDNA microarray分析，分析得到差异表达基因，并筛选信号相关下游通路基因作为后续研究。对90例胃癌组织和10例正常组织进行sFRP3/FRZB免疫组织化学染色，并分析其与临床病理资料的相关性。建立sFRP3/FRZB过表达胃癌细胞株模型，对过表达sFRP3/FRZB在胃癌细胞体内外增殖、侵袭能力的作用进行研究。结果：TXNL2在人肿瘤组织中高表达，TXNL12在人乳腺癌中高表达。抑制TXNL2表达可抑制乳腺癌细胞体内外增殖和转移能力。TXLNL2下调可增加细胞内ROS水平并导致细胞凋亡。TXNL2通过调控ROS水平而调控NF-κB信号通路的活化。TXNL2高表达对乳腺癌病人肺和脑转移有预后提示意义，并且与病人的生存期相关。sFRP1蛋白在胃癌组织中高表达，在正常胃上皮细胞中无/极弱表达。sFRP1蛋白表达高与淋巴结转移及患者生存期短相关，可作为评判胃癌病人预后的潜在指标。过表达sFRP1可促进胃癌细胞在二维和三维条件下的生长。过表达sFRP1可促胃癌细胞迁移、侵袭能力和创伤修复速度。过表达sFRP1可促进胃癌细胞发生EMT转换，过表达sFRP1细胞培养上清可以促进体外血管形成。过表达sFRP1胃癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力增强，免疫组化染色发现sFRP1过表达细胞形成的皮下瘤中分裂相细胞增多、凋亡细胞减少、肿瘤微血管密度增加、MMP蛋白表达增高，与体外实验结果一致。使用人全基因组芯片检测sFRP1过表达引起的基因表达改变发现多种增强成瘤能力的基因(RUNX2、ZEB2、DNMT3L、CD44等)，同时也诱导与肿瘤基质重建相关基因(TGFβ1、VEGF、SEPP1、ILs等)和免疫逃逸相关基因(HL-DRA、PD-L2等)的表达。共表达调控网络分析发现18个与sFRP1过表达具有共表达情况的基因，而在空载体对照组中仅有4个基因。通过Realtime-PCR和ELISA验证了差异表达基因，信号通路研究发现TGFβ1/RUNX2信号通路是介导sFRP1下游的重要途径。sFRP3/FRZB在胃癌组织中高表达，在肠型胃癌中表达高于弥漫型，在高分化胃癌中表达高于低分化胃癌。过表达sFRP3/FRZB抑制胃癌细胞体内外增殖能力，促进细胞凋亡。sFRP3/FRZB过表达可抑制胃癌细胞侵袭能力。结论：TXNL2是调控细胞内环境稳定的重要分子，并在乳腺癌中具有诊断和预后价值。sFRP1蛋白是调控胃癌细胞生长和肿瘤微环境重建的关键分子，可作为胃癌预后的潜在指标和治疗靶点。sFRP3/FRZB是抑制胃癌细胞增殖和促进胃癌细胞分化的重要分子。收起

关键词 : 胃癌 sFRP1蛋白 sFRP3蛋白肿瘤细胞 TXNL2分子

6. 消肿乳糜清片剂治疗继发性淋巴水肿的实验研究和MTS继发下肢DVT的回顾性分析研究

[学位论文] 靳松山东大学 2018年博士导师: 李胜；金星共212页

摘要 : 本文主要从以下几个部分展开论述：第一部分消肿乳糜清片剂治疗继发性淋巴水肿的实验研究目的：本研究通过构建鼠尾淋巴水肿模型，研究激光扫描共聚焦显微镜诊断继发性淋巴水肿的可行性，并探讨中药乳糜消肿片剂治疗继发性淋巴水肿... 展开本文主要从以下几个部分展开论述：第一部分消肿乳糜清片剂治疗继发性淋巴水肿的实验研究目的：本研究通过构建鼠尾淋巴水肿模型，研究激光扫描共聚焦显微镜诊断继发性淋巴水肿的可行性，并探讨中药乳糜消肿片剂治疗继发性淋巴水肿的疗效及分子作用机制，为中医中药治疗淋巴水肿提供理论依据和实验基础。内容： 1.建立鼠尾淋巴水肿模型并应用激光扫描共聚焦显微镜技术进行评估研究; 2.探讨消肿乳糜清片剂治疗继发性淋巴水肿的疗效; 3.探讨消肿乳糜清片剂治疗继发性淋巴水肿的分子机制。方法：试验一激光共聚焦显微镜技术对鼠尾淋巴水肿模型的评估研究 1.动物模型的建立和分组:选用6-8周龄的Wistar大鼠，通过外科手术切断并结扎鼠尾淋巴管建立鼠尾淋巴水肿模型。分为淋巴水肿组、假手术组和空白对照组，共3组，每组6只。 2.鼠尾淋巴水肿的评估 1)鼠尾直径变化率:分别在术前及术后1、3、5、7、9、11、14、21、28、35、42天观察鼠尾皮肤的变化并用游标卡尺测量距根部20mm处鼠尾直径。鼠尾直径变化率=（术后鼠尾直径-术前鼠尾直径）/术前鼠尾直径。 2)利用核素显像检测术后7天各组鼠尾淋巴回流变化。 3)利用激光共聚焦显微镜检测术后7天各组鼠尾皮肤变化。利用ImagJ软件测量表皮棘细胞层灰度值，每张图片测量3次后取平均值。试验二消肿乳糜清片剂治疗继发性淋巴水肿的疗效及分子机制研究 1.动物模型的建立、分组和药物干预:选用6-8周龄的Wistar大鼠，造模方法同试验一。分为治疗组:(1)低剂量消肿乳糜清片剂组、(2)中剂量消肿乳糜清片剂组、(3)高剂量消肿乳糜清片剂组;对照组:(1)淋巴水肿组、(2)地奥司明组、(3)空白对照组。共6组，每组8只。消肿乳糜清片剂低、中、高剂量组的给药剂量分别为1g/kg、2g/kg、4g/kg。地奥司明组的给药剂量为0.4g/kg。从术后第1天开始，每天1次灌胃给药，连续给药28天，观察疗效。 2.干预后鼠尾淋巴水肿的评估 1)鼠尾直径变化率:分别在术前及术后1、3、5、7、9、11、14、21、28天观察鼠尾皮肤的变化并用游标卡尺测量距根部20mm处鼠尾直径。鼠尾直径变化率=（术后鼠尾直径-术前鼠尾直径）/术前鼠尾直径。 2)利用核素显像检测术后28天各组鼠尾淋巴回流变化。 3)利用激光共聚焦显微镜检测术后28天各组大鼠鼠尾皮肤变化。利用ImagJ软件测量表皮棘细胞层灰度值，每张图片测量3次后取平均值。结果：试验一激光共聚焦显微镜技术对鼠尾淋巴水肿模型的评估研究 1.成功建立鼠尾淋巴水肿模型:淋巴水肿组术后第1天鼠尾开始出现肿胀，并逐渐加重，术后第7天达水肿高峰，严重者皮肤可出现水疱。随后鼠尾水肿逐渐消退，术后42天仅有轻度肿胀，伤口瘢痕愈合，但鼠尾皮肤发硬、纤维化。假手术组术后鼠尾轻度肿胀，术后7天伤口自行愈合。 2.鼠尾淋巴水肿的评估结果 1)鼠尾直径变化率结果:术后第1天，淋巴水肿组的鼠尾直径较正常对照组增加0.188，有统计学差异(P＜0.0001);假手术组的鼠尾直径较正常对照组增加0.01，无统计学差异(P=0.5747)。术后第7天，淋巴水肿组的鼠尾直径较正常对照组增加0.595，统计学差异最大(P＜0.0001);假手术组的鼠尾直径较正常对照组增加0.012，无统计学差异(P=0.78)。 2)核素显像结果:淋巴水肿组手术部位及远端皮内、皮下出现大量的示踪剂滞留，近端淋巴链及淋巴结未见显影。正常对照组鼠尾淋巴链显影清晰，盆腔巴结呈圆形或卵圆形，形态清楚。 3)共聚焦显微镜结果:正常对照组表皮层次清晰，棘细胞层细胞分布均匀，无扩大。淋巴水肿组表皮层次不清晰，棘细胞层细胞水肿扩大，透光度增加。淋巴水肿组与正常对照组在术前无明显统计学差异(P=0.4315)。术后第7天，淋巴水肿组较正常对照组增加25.32，两组间有显著统计学差异(P＜0.0169)，假手术组与正常对照组在术后第7天无统计学差异(P＞0.5667)。试验二消肿乳糜清片剂治疗继发性淋巴水肿的疗效及分子机制研究 1.干预后鼠尾的外观变化:除正常对照组外，余各组术后第1天鼠尾均开始出现肿胀，并逐渐加重，淋巴水肿组肿胀最重，高剂量消肿乳糜清片剂组最轻。术后第7天达水肿高峰，随后鼠尾水肿逐渐消退，术后28天仅有轻度肿胀，伤口瘢痕愈合。 2.干预后鼠尾淋巴水肿的评估结果 1)鼠尾直径变化率结果:术后第1天，空白对照组鼠尾直径变化率较淋巴水肿组下降0.21（P＜0.0001），余各组与淋巴水肿相比无统计学差异。术后第7天，各组鼠尾直径变化率均较淋巴水肿组降低，其中高剂量组降低0.17(P＜0.0001)，有统计学差异。与淋巴水肿组相比，低剂量药物组鼠尾直径变化率在术后28天降低0.02(P=0.1657)。随着药物浓度的增加，淋巴水肿的程度逐渐减轻，中剂量药物组鼠尾直径变化率在术后28天降低0.04(P=0.01)，高剂量组鼠尾直径在术后28天降低0.12(P＜0.0001)，有统计学差异，未发现阈值饱和效应。 2)核素显像结果:术后28天淋巴水肿组、低剂量组:鼠尾远端皮内、皮下出现较多示踪剂滞留，鼠尾淋巴链出现不完全性中断，盆腔淋巴结未见显影。中剂量组、高剂量组、地奥司明组:鼠尾淋巴链显影欠清晰，盆腔淋巴结部分显影。空白对照组:鼠尾淋巴链显影清晰，盆腔淋巴结呈圆形或卵圆形，形态清楚。 3)共聚焦显微镜结果:术后28天淋巴水肿组棘细胞层平均灰度值为200.80±8.98，低剂量组为194.30±12.54，中剂量组为192.81±11.09，高剂量组为178.95±11.57，地奥司明组为185.80±11.93及空白对照组为178.50±15.30。低剂量组灰度值在术后28天较淋巴水肿组降低6.5(P=0.2869)，无统计学差异。随着药物浓度的增加，淋巴水肿的程度逐渐减轻，高剂量组灰度值在术后28天较淋巴水肿组降低21.85(P=0.0008)，有统计学差异。结论： 1.使用切断并结扎鼠尾淋巴管的方法可成功构建鼠尾淋巴水肿模型，激光共聚焦显微镜技术可定性、定量地评估动物模型淋巴水肿的状态和程度。 2.低剂量消肿乳糜清片剂对外科手术后鼠尾淋巴水肿有治疗作用，随着药物浓度的增加，对继发性淋巴水肿的治疗作用也逐渐增加，高剂量消肿乳糜清片剂对继发性淋巴水肿的治疗作用最明显。 3.消肿乳糜清片剂通过增加淋巴管内皮细胞VEGF-C的表达，促进淋巴管的形成与再生。第二部分 MTS继发下肢DVT的回顾性分析研究目的：本研究的主要目的: (1)了解2014年6月-2016年9月在济宁医学院附属医院诊治的146名急性下肢DVT患者的发病特点，与国内外同类研究结果进行比较，总结出鲁西南地区该疾病的流行病学特点，并期待发现新的规律。 (2)探讨CDT和CDT联合骼静脉支架置入两种手术方式治疗MTS继发下肢DVT的疗效差别，并通过随访了解骼静脉支架的近期和中期通畅率。方法：本研究经济宁医学院附属医院伦理委员会审查通过，收集从2014年6月-2016年9月在济宁医学院附属医院血管外科诊治的146名急性下肢DVT患者的临床资料，并进行回顾性分析。由于本研究为回顾性研究，免除签署患者知情同意书。效应指标包括:性别、年龄、高危因素、发病部位、D一二聚体、下肢静脉彩超、静脉造影、肺动脉CTA.骼血管CTA、导管接触溶栓、骼静脉支架置入及随访结果。利用EmpowerStates软件进行统计分析。结果： 1.MTS并DVT组与非MTS并DVT组性别、年龄相比，两组性别差异有统计学意义(P<0.001)，年龄差异无统计学意义(P=0.759)。 2.MTS并DVT组与非MTS并DVT组高危因素相比，两组差异无统计学意义 (P=0.179)。 3.MTS并DVT组与非MTS并DVT组发病时间、部位相比，两组发病时间差异无统计学意义(P=0.460 )，两组发病部位差异有统计学意义(P<0.001)。结论：在本研究中，MTS好发于女性患者，容易继发左下肢深静脉血栓形成，以中央型和混合型多见。骼血管CTA诊断MTS的准确性高。合并MTS的急性下肢DVT发生肺栓塞的机率低，MTS是影响肺栓塞发生的独立危险因素。血管腔内治疗合并MTS的下肢DVT近期效果良好，通畅率高。收起

关键词 : 继发性淋巴水肿消肿乳糜清片剂实验药理下肢深静脉血栓发病机制手术治疗疗效评价

7. 基于公共数据库的乳腺癌免疫相关预后因子的分析及功能研究

[学位论文] 李政山东大学 2022年博士导师: 杨其峰共210页

摘要 : 研究背景：乳腺癌是女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，对全球女性的生命健康构成了巨大威胁。传统的乳腺癌临床病理分期结合分子生物学特征为乳腺癌患者的预后评估提供了临床可用的标准，但是乳腺癌是一种异质性疾病，那些具有相似临床特征的... 展开研究背景：乳腺癌是女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，对全球女性的生命健康构成了巨大威胁。传统的乳腺癌临床病理分期结合分子生物学特征为乳腺癌患者的预后评估提供了临床可用的标准，但是乳腺癌是一种异质性疾病，那些具有相似临床特征的患者可能会有不同的临床结局。在癌症个性化治疗的时代，这些传统预后因素已不再满足最佳的患者管理需求。因此，近年来大量的研究正致力于开发和验证生物分子标志物，这些分子标志物可更加准确地评估乳腺癌患者的预后和治疗反应，帮助患者制定个性化的治疗方案，同时助力于乳腺癌新型治疗靶点的开发。肿瘤微环境(tumor microenvironment，n伍)由多种细胞和细胞因子组成，是高度异质性的网络系统。TME的异质性导致了乳腺癌患者不同的治疗反应和临床结局，同时阻碍了精准医学在乳腺癌中的实现。肿瘤浸润免疫细胞作为TME中的主要细胞，可以发挥抗肿瘤或促肿瘤的双重作用。大量研究表明，免疫抑制性TME对于免疫疗法和其它癌症疗法的临床效果具有重要影响。因此，继续深入地了解肿瘤免疫，将有助于开发更为可靠的乳腺癌预后和预测分子标志物，这对于评估患者预后和优化治疗决策至关重要。生物信息技术的发展极大地扩充了公共数据资源，这对于进一步深入研究乳腺癌分子标记物具有重要意义。论文的第一部分从整体乳腺癌患者的角度出发，探索了乳腺癌免疫相关预后长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)并成功构建预后模型。由于三阴性乳腺癌(triple-negativebreastcancer，TNBC)是乳腺癌中最具侵袭性的亚型，并且缺乏特异性的生物学靶点，因此在临床治疗上面临诸多挑战。随着免疫疗法的兴起，TNBC展示出其在免疫治疗上的优势。但是，目前免疫治疗也有患者反应率不高等诸多问题存在。如何更好地预测TNBC患者的预后和治疗反应是一个重要课题。从论文的第二部分开始将主要精力转移到TNBC亚型，确认了影响TNBC患者预后的关键免疫相关基因PPP2R2B。论文的第三部分重点对PPP2R2B在TNBC中发挥的生物学功能和分子机制进行分析，同时结合体外实验对PPP2R2B的部分生物学功能进行验证。第一部分乳腺癌免疫相关预后因子的筛选及预后模型的构建研究目的： 1.筛选乳腺癌免疫相关预后lncRNA并构建预后模型。 2.lncRNA预后模型结合传统临床病理特征构建列线图。 3.探索预后模型内lncRNA潜在的生物学功能和分子机制。研究方法：基于TCGA和GEO数据库的乳腺癌基因表达谱，利用基因共表达分析识别免疫相关lncRNA。通过结合Kaplan-Meier法、单因素Cox回归和lasso回归分析筛选预后相关IncRNA并利用多因素Cox回归分析构建预后评估模型。经外部数据集验证模型的预测效能后，将预后模型结合临床病理因素构建列线图。最后，使用整合的生物信息学方法探索了模型内潜在的生物学功能和分子机制。研究结果： 1.识别乳腺癌免疫相关预后lncRNA并构建了由6个lncRNA组成的预后模型，该模型可准确地将乳腺癌患者进行风险分层。 2.外部数据集的验证结果显示，该模型在乳腺癌患者的预后预测方面表现优异，并且是乳腺癌患者的独立预后因素。 3.与目前的基因检测方法相比，lncRNA模型的预测效能不受临床分期的影响，并且对Basal-like亚型患者的总生存期也有预测价值。 4.lncRNA模型结合年龄和AJCC分期构建列线图，提高了模型的临床实用性和预测准确性。 5.lncRNA模型的风险值与CD8+T细胞的浸润水平显著负相关，同时高风险组的免疫反应相关信号受到明显的抑制。 6.WGCNA分析显示内质网蛋白加工和抗原加工呈递通路的紊乱可能是影响高风险组CD8+T细胞浸润的关键因素。研究结论 1.lncRNA模型在乳腺癌患者的预后评估方面表现优异，并且使用范围较目前的基因检测方法更为广泛。 2.列线图为乳腺癌患者的预后预测提供了实用性的临床指标。 3.lncRNA模型可以准确地预测肿瘤内CD8+T细胞的浸润水平;模型内的lncRNA有潜力成为乳腺癌患者的新型治疗靶点。第二部分三阴性乳腺癌免疫相关预后因子的鉴定与分析研究目的： 1.整合并优化多种生物信息学方法以提高基因筛选的准确性。 2.筛选影响TNBC患者预后的关键免疫相关因子。 3.评估关键免疫相关因子的预后价值。研究方法： CIBERSORT算法结合WGCNA分析识别TNBC中与CD8+T细胞浸润高相关的生物学模块，将模块内的关键基因通过ssGSEA方法整合成新免疫信号。基于该免疫信号，利用迭代lasso识别影响TNBC患者预后的关键基因。外部数据集评估候选基因对免疫浸润的影响。乳腺癌进展细胞系模型评估候选基因在乳腺癌演进中的作用。免疫组化检测候选基因在TNBC组织中的表达情况。利用多种生存分析方法评估候选基因的预后价值。研究结果： 1.WGCNA结合ssGSEA分析构建与CD8+T细胞浸润高相关的免疫信号，该免疫信号是机体抗肿瘤免疫反应的核心信号。 2.迭代lasso分析显示PPP2R2B为影响TNBC患者预后的关键因子。 3.Q-PCR实验结果表明，从正常乳腺上皮细胞到乳腺癌细胞的恶性演进中，PPP2R2B基因表达呈梯度性下降趋势。免疫组化检测结果显示，PPP2R2B蛋白在TNBC组织的染色强度较正常乳腺组织明显降低。 4.外部数据集评估PPP2R2B与免疫浸润细胞的关系，结果显示PPP2R2B与CD8+T、Th1和M1细胞的浸润显著正相关，而与M2细胞的浸润显著负相关。 5.PPP2R2B高表达TNBC患者的总生存期显著延长，并且不受其它临床病理因素的影响。除TNBC外，PPP2R2B对HER2患者的预后也有显著影响。研究结论： 1.本研究中整合优化后的筛选方法极大地提高了基因筛选的准确性。 2.PPP2R2B为影响TNBC患者预后的关键免疫相关因子，并与乳腺癌的发生发展密切相关。 3.除TNBC外，PPP2R2B对HER2患者的预后也有重要的预测价值。第三部分三阴性乳腺癌中PPP2R2B的多组学分析和功能研究研究目的： 1.整合多组学数据分析PPP2R2B的功能和分子机制。 2.利用体外实验验证PPP2R2B的生物学功能。研究方法：整合并分析乳腺癌多组学数据，包括mRNA、拷贝数变异、体细胞突变、甲基化、药物敏感性数据和临床病理信息，重点评估PPP2R2B在TNBC中的免疫功能和分子机制，同时结合体外实验对PPP2R2B的部分生物学功能进行验证。研究结果： 1.GO、GSEA和GSVA分析显示PPP2R2B与抗原处理呈递和T细胞反应的免疫信号显著相关。 2.识别出与PPP2R2B强正相关的3个基因GZMA、PRF1和IFNG，并利用TNBC数据集和TCGA泛癌数据集证明了PPP2R2B与三个基因之间的关系具有高度保守性。 3.体外实验结果显示，PPP2R2B可以诱导巨噬细胞向M1表型极化，并促进M1细胞的迁移能力;同时，PPP2R2B也可以通过非免疫的方式抑制TNBC细胞的耐药和转移能力。 4.在基因组水平上，PPP2R2B高低表达组在拷贝数变异、体细胞突变和甲基化方面均表现出明显的差异性特征。 5.PPP2R2B高表达患者表现出更高的淋巴细胞浸润水平和TCR丰度。 6.PPP2R2B高表达患者表现出对化疗药物更高的敏感性;此外，PPP2R2B高表达患者更易获得新辅助化疗(NAC)后的病理完全缓解(pCR)。研究结论： 1.PPP2R2B是TNBC重要的免疫相关肿瘤抑制因子，在抗肿瘤免疫反应中发挥着重要作用，同时与TNBC的转移和耐药密切相关。 2.在TNBC中，PPP2R2B的表达下降与启动子区特定位点的高甲基化有关。 3.PPP2R2B可作为TNBC患者的关键预后和预测因子，并有潜力成为新的治疗靶点。收起

关键词 : 三阴性乳腺癌免疫相关预后因子基因筛选生物学功能

8. 胃癌发生和转移相关的转录组分析及COL10A1促胃癌转移的研究

[学位论文] 李婷婷南方医科大学 2019年博士导师: 李国新共210页

摘要 : 目的和意义: 尽管在过去几十年中手术和化疗在肿瘤治疗上取得很大进展，但胃癌(GC)仍是全球癌症相关死亡率的第三大常见原因，其占所有癌症相关死亡人数的8.8％。早期检测中缺乏生物标志物和发生腹膜转移是胃癌治疗失败的主要原因。所以找到预测... 展开目的和意义: 尽管在过去几十年中手术和化疗在肿瘤治疗上取得很大进展，但胃癌(GC)仍是全球癌症相关死亡率的第三大常见原因，其占所有癌症相关死亡人数的8.8％。早期检测中缺乏生物标志物和发生腹膜转移是胃癌治疗失败的主要原因。所以找到预测疾病进展的分子生物标志物可能促进胃癌药物的开发和治疗策略的改善。方法: 高通量mRNA测序(RNA-seq)结果显示X型胶原蛋白1(COL10A1)是疾病进展相关基因。103例胃癌患者的组织样本QPCR分析结果显示，COL10A1mRNA高表达与胃癌转移和存活率降低存在显著相关性。使用UCSC基因组网站和JASPAR数据库分析COL10A1的启动子序列，预测潜在的转录因子SOX9结合位点。收集胃癌患者的癌组织和对应的正常胃粘膜组织，利用免疫组化技术进行SOX9和COL10A1表达的定位定量检测分析。同时，收集受检患者的临床资料及随访生存预后的相关信息。接着通过QPCR和Western blot实验分别在转录水平和翻译水平验证SOX9和COL10A1的临床相关性。构建过表达COL1OA1和敲低COL10A1的稳转细胞株，同时用转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激胃癌细胞株，通过Western blot实验检测TGF-β信号通路相应指标的变化，以及与肿瘤转移相关的EMT指标和金属基质酶家族蛋白的变化，验证COL1OA1与TGF-β信号通路之间的关系。内容: 在本研究中，证明了SOX9和COL10A1在胃癌组织中表达上调。观察到在胃癌细胞株和组织中SOX9和COL10A1的表达模式之间存在正相关。电泳迁移率变动分析(EMSA)，染色质免疫沉淀(ChIP)分析和荧光素酶报告基因的结果表明，SOX9可以直接与COL10A1基因启动子结合并激活其转录。生物功能学实验表明，COL10A1能够促进胃癌细胞的迁移和侵袭。敲低COL10A1可以抑制裸鼠转移模型中的肺部和腹腔内转移。此外，用TGF-β1处理细胞后，可以上调Smad2的磷酸化水平并增加SOX9和COL10A1的表达。证实COL10A1是上皮-间质转化(EMT)的潜在诱导物。SOX9对于COL10A1介导的EMT和细胞迁移、侵袭和转移至关重要。SOX9和COL10A1的共表达与肿瘤进展相关，并且强烈预测胃癌患者的总体预后。总之，本研究阐明了COL10A1与TGF-β1-SOX9轴之间的机制联系。结论: mRNA表达谱分析结果表明COL10A1mRNA水平在胃癌的发生和转移过程中显著升高。COL10A1在胃癌组织中显著过表达并且能够增强体内肿瘤细胞的转移和侵袭能力。COL10A1mRNA和蛋白质表达增加与胃癌患者的生存期缩短有关。此外，COL10A1通过SOX9的正转录调节和TGF-β信号通路的参与促进肿瘤细胞迁移和侵袭。因此，本研究不仅阐明了COL10A1在胃癌进展中的确切机制，而且还提供了癌症相关细胞外基质的分子研究方向，并可作为胃癌临床结果的预测指标。收起

关键词 : 胃癌细胞转移病理机制 X型胶原蛋白1 转录组测序

9. 条件性基因敲除方法研究Ash2l在小鼠肝脏及胚胎成纤维细胞中的功能

[学位论文] 梁玮丽山东大学 2016年博士导师: 马榕；Bernhard Luescher 共207页

摘要 : 既往的研究已经证明了ASH2L蛋白可以通过影响KMT2酶的活性而影响组蛋白修饰等基因的表观遗传调控。在ASH2L功能研究中，已经发现其在维持ES细胞多向分化潜能及胚胎发育等方面的作用，但具体到ASH2L与癌症的关系上却面临着困境。本课题组前期实验试图利... 展开既往的研究已经证明了ASH2L蛋白可以通过影响KMT2酶的活性而影响组蛋白修饰等基因的表观遗传调控。在ASH2L功能研究中，已经发现其在维持ES细胞多向分化潜能及胚胎发育等方面的作用，但具体到ASH2L与癌症的关系上却面临着困境。本课题组前期实验试图利用ASH2L的过表达方式研究其在肝癌发生中的作用但未获成功。本研究在前期研究的基础上，转换研究角度，不再通过ASH2L过表达的方式研究ASH2L的功能，而是通过敲除Ash2l方式反向推导Ash2l蛋白的功能，这为深入研究ASH2L的功能奠定基础。目的： 1.构建条件性基因敲除动物模型，研究敲除Ash2l对小鼠肝脏及个体发育的影响。 2.在小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中条件性地敲除Ash2l，研究其对细胞生理功能的影响，并探讨其可能的机制。方法: 一、将基因型为Ash2lfl/fl的小鼠与Ash2l+/+ Tg(AlbCre)的小鼠交配，得到子代Ash2l+/flTg(AlbCre)小鼠，让其后代继续交配，获得实验组Ash2l敲除（Ash2l KO）小鼠Ash2lfl/flTg(AlbCre)及不同基因型的对照组小鼠(Ash2lfl/fl，Ash2l+/fl，Ash2l+/flTg(AlbCre)，Ash2l+/+，Ash2l+/+Tg(AlbCre)）。所获小鼠进行以下实验: 1.每天观测小鼠的体重、一般情况、日常行为及临床监测指标等，并且给予评分，当实验组小鼠评分超过20分时终止实验。 2.处死小鼠前，称重小鼠并用毛细玻璃管从小鼠眼内眦眼眶后静脉丛取血。分离获得血清，进行碱性磷酸酶(ALP)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及总胆红素(TBIL)等与肝功能相关的酶学检测。 3.采用PCR方法检测Ash2l在DNA和RNA水平上的敲除效率。 4.采用Western blot方法检测蛋白水平上Ash2l的表达情况。 5.采用HE、PAS、Gomori染色等方法评价敲除Ash2l后肝脏组织学变化。 6.采用免疫组织化学方法对小鼠肝脏组织切片进行染色，分析Ash2l、H3K4me3、Ki67和γH2A.X等的含量。 7.小鼠肝组织切片TUNEL染色及cleaved caspase-3免疫组织化学染色检测肝细胞凋亡的情况。二、将基因型为Ash2lfl/fl的小鼠与Ash2l+/+ Tg(CA GCre ERT2)的小鼠交配，让其后代继续交配，从孕13.5天的雌鼠体内筛选基因型为Ash2l+/+ Tg(CAG-CreERT2)和Ash2lfl/flTg(CA GCreERT2)的小鼠胚胎，制备原代小鼠胚胎成纤维细胞(pMEFs)。采用磷酸钙瞬时转染的方法将含有p19ARF的质粒转染包装细胞Plat-E，并收集生成的逆转录病毒感染pMEFs。被病毒感染的pMEFs再经过相应抗生素筛选2周，获得永生化小鼠胚胎成纤维细胞(iMEFs)。所制备的pMEFs和iMEFs于对数生长期内进行以下实验: 1.采用PCR和Western blot的方法分别检测Ash2l在DNA水平上的敲除效率和蛋白水平上的表达情况。 2.通过绘制细胞生长曲线及亚甲蓝染色方法监测细胞的生长情况。 3.采用PI染色结合流式细胞技术研究细胞周期的分布。 4.采用AnnexinⅤ-FITC/PI染色结合流式细胞技术检测细胞凋亡。 5.采用β-半乳糖苷酶染色方法检测细胞衰老。结果：一、敲除Ash2l引起小鼠肝脏损伤。经过在DNA、RNA及蛋白水平上对Ash2l敲除效率的验证，成功构建了肝细胞特异性基因敲除小鼠模型。Ash2l KO小鼠形体较小，生长迟缓，活动减少。在终止实验前，6只Ash2l KO小鼠死亡，平均死亡年龄26.17±9.19天。与对照组相比，存活的雌性和雄性Ash2l KO小鼠的体重均明显下降(雌鼠:7.45±2.36g(KO) vs.11.19±4.61 g(C)，P＜0.05;雄鼠:6.56±1.05g(KO) vs.8.06±1.84g(C),P＜0.05)。血清酶学检测显示:Ash2l KO小鼠较对照组小鼠的ALP、ALT、AST水平明显升高(ALP:2022.20±195.70 U/L(KO) vs.467.05±52.01 U/L(C)，P＜0.001;ALT:110.68±17.77 U/L(KO) vs.49.96±6.70 U/L(C)，P＜0.001;AST:248.34±37.75U/L(KO) vs.104.31±17.52U/L(C),P＜0.001);TBIL水平也有所升高，但差异不具有统计学意义(48.26±12.33μmol/L(KO)vs.17.90±10.42μmol/L(C),P=0.070)。小鼠肝脏的组织学分析显示，Ash2l KO小鼠肝细胞内Ash2l蛋白表达下降同时伴有H3K4me3的缺失，但在肝脏其他类型的细胞中，仍可见Ash2l蛋白及H3K4me3的存在，如Kupffer细胞和内皮细胞等。小鼠肝组织切片HE染色显示，不同基因型对照组小鼠的肝细胞形态学一致，未见明显异常，而Ash2l KO小鼠肝细胞胀大，胞浆呈疏松态，出现气球样变，并伴有羽毛状变性。且随着小鼠天龄的增加，Ash2l KO小鼠肝脏的胆管反应明显。PAS染色显示其含有蜡样质的巨噬细胞增多，改良的Gomori染色显示其部分区域内肝细胞塌陷，门静脉桥接纤维化。在超过11天龄的小鼠肝脏细胞中，敲除Ash2l可以引起Ki67升高，肝细胞核变大、深染。此外，Ash2l KO和对照组小鼠的肝细胞在cleaved caspase-3和TUNEL染色上无明显差异，在部分Ash2l KO小鼠肝细胞中γH2A.X升高。二、敲除Ash2l抑制细胞增殖。经过在DNA及蛋白水平上对Ash2l敲除效率的验证，成功建立了可诱导Ash2l敲除的MEFs。细胞生长曲线及亚甲蓝染色结果显示，敲除Ash2l可抑制MEFs的增殖。细胞周期分析结果显示，Ash2l KO pMEFs明显阻滞于G0/G1期，同时伴有S期细胞比例的明显下降。运用流式细胞技术检测经AnnexinⅤ-FITC/PI染色的Ash2l KO MEFs的凋亡情况时发现:在干扰Ash2l表达7天后，与对照组相比，iAsh2lfl/flMEFs在FSC和SSC轴上分布弥散，细胞凋亡显著增加(AnnexinⅤ+:18.19±1.15％(+ HOT) vs.7.55±1.49％(-HOT),P＜0.05; AnnexinⅤ+PI-:10.38±0.49％(+ HOT) vs.0.92±0.07％(-HOT)，P＜0.001），而HOT的诱导并不能促进iAsh2l+/+MEFs的凋亡(AnnexinⅤ+:11.01±0.27％(+HOT) vs.11.92±1.33％(-HOT),P=0.359; AnnexinⅤ+PI-:2.14±0.17％(+HOT) vs.2.25±0.49％(-HOT)，P=0.739）。与iMEFs细胞凋亡检测结果一致，经过HOT诱导7天后，pAsh2lfl/lMEFs与对照组相比，凋亡细胞和早期凋亡细胞的比例均显著升高(AnnexinⅤ+:34.13±0.85％(+HOT) vs.22.93±0.37％(-HOT)，P＜0.001; AnnexinⅤ+ PI-:22.30±0.95％(+HOT) vs.13.00±0.50％（-HOT），P＜0.001），pAsh2l+/+MEFs在经过HOT处理后与对照组相比无明显差异(AnnexinⅤ+:24.62±1.72％(+HOT) vs.26.87±1.42％（-HOT),P=0.157; AnnexinⅤ+PI-:13.60±0.46％(+HOT) vs.14.10±1.21％（-HOT），P=0.541）。此外，收集悬浮细胞进行细胞凋亡检测发现，iAsh2lfl/flMEFs在经过HOT诱导处理7天后有63.90±0.61％的悬浮细胞处于早期凋亡阶段。对照组iAsh2l+/+MEFs（±HOT）及iAsh2lfl/flMEFs（-HOT）由于悬浮细胞极少，无法收集到足够的细胞用于凋亡检测。结论： 1.成功构建的肝细胞特异性基因敲除动物模型证明，敲除Ash2l基因导致小鼠出生后肝脏功能受损、个体发育迟缓甚至死亡。 2.Ash2l KO小鼠肝脏组织学的改变可能是由Ash2l蛋白缺失引起的H3K4me3修饰异常所致。 3.成功构建的可诱导条件性基因敲除MEFs证明，敲除Ash2l基因可以抑制细胞的增殖。 4.Ash2l蛋白缺失引发的细胞生长受抑可能是通过促进细胞衰老及一定程度上的细胞凋亡而形成的。收起

关键词 : 肝癌 Ash2l基因条件性基因敲除肝脏发育胚胎成纤维细胞组蛋白修饰

10. CREB3L4对肝细胞肝癌的作用效应与分子机制

[学位论文] 姜政辰山东大学 2023年博士导师: 胡三元共203页

摘要 : 研究背景原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，肝细胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是原发性肝癌的主要病理类型，由于其早期症状不明显，多数患者一经发现已经是晚期,失去手术治疗的宝贵时机，无法进行根治性切除。并且HCC具有恶性程度高、转... 展开研究背景原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，肝细胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是原发性肝癌的主要病理类型，由于其早期症状不明显，多数患者一经发现已经是晚期,失去手术治疗的宝贵时机，无法进行根治性切除。并且HCC具有恶性程度高、转移早、易复发、对放化疗不敏感等特点，严重威胁患者的生命健康。因此，探索HCC的发生发展机制、寻找新的治疗靶点成为亟待解决的临床问题。索拉非尼是一种小分子多激酶抑制剂，是临床上晚期HCC患者治疗的一线药物。目前研究认为，索拉非尼通过下调丝氨酸-苏氨酸激酶(Serine/threoninekinase-1,Raf-1)和血管内皮生长因子受体(Vascularendothelialgrowthfactorreceptor,VEGFR)的活性抑制肿瘤细胞增殖和血管生成等机制发挥抗癌作用。索拉非尼虽然可以有效延长患者的生存时间，但是随着使用时间的延长以及个别患者体质问题，不少HCC患者后期出现治疗效果不佳等耐药性现象，最终导致预后不良。因此，研究HCC细胞对索拉非尼的耐药机制具有重要的临床意义，也是目前肿瘤学领域的研究热点之一。 CREB3L4是CREB3家族中的一员，最初是由Qi等人在2002年发现。它由位于人染色体lq21.3的CREB3L4基因编码，其从N端到C端包括:介导序列特异性DNA结合的反式激活域(Trans-activationdomain,TAD)、一个由约30个残基组成的保守域ATB、bZIP结构以及一个跨膜结构域(Transmembranedomain,TMD)等结构。数据库检索发现，白血病、淋巴细胞瘤以及肝、肾、脑、前列腺、乳腺等多种实体肿瘤在CREB3L4染色体定位附近有异常出现。后续研究证实，CREB3L4在前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多种实体肿瘤中高表达，可促进肿瘤的发生发展，被认为是潜在的治疗靶点。但CREB3L4是否在肝癌的发生发展以及索拉非尼耐药性产生中发挥作用尚不明确。本课题旨在探讨CREB3L4在HCC增殖中的作用及其对索拉非尼化疗敏感性的调控作用及其机制，为HCC的靶向治疗提供新思路。研究目的 (1)探讨CREB3L4在HCC组织中的表达水平及其对疾病预后的作用。 (2)探讨CREB3L4在HCC进展中的作用及分子机制。 (3)探讨CREB3L4对索拉非尼对HCC耐药产生的分子机制。第一部分CREB3L4在肝细胞肝癌中的表达及其对生物学功能的影响材料方法 1.数据库预测CREB3L4在HCC组织中表达水平以及与预后的关系 GEPIA数据库是目前肿瘤科研工作者常用的数据分析平台。因此，本研究此数据库中进行预测CREB3L4在HCC组织中的表达情况以及CREB3L4与HCC患者预后的关系。 2.检测CREB3L4表达水平及与患者预后的关系应用83例HCC组织及其配对的癌旁组织的石蜡切片，常规行CREB3L4免疫组织化学染色，检测其在HCC组织中的表达。应用ImageJ软件分析CREB3L4在HCC组织及其配对的癌旁组织中的表达水平，并分析CREB3L4的差异表达与患者临床病理分期的关系。另外收集20例HCC组织及其配对的癌旁组织蛋白样品，westernblot法检测CREB3L4的表达水平，应用ImageJ和GraphPadPrism9.3软件对HCC组织及其配对的癌旁组织中CREB3L4表达水平进行定量和统计学分析。 3.检测CREB3L4对HCC细胞增殖的调控效应在HCC细胞系HUH7和Hep3B中分别转染特异性CREB3L4短发夹RNA(shCREB3L4),并以非特异性无义序列(shNC)转染组作为对照。Westernblot、qRT-PCR鉴定转染效率，用于构建CREB3L4敲减细胞模型。在HCC细胞系HUH7和Hep3B中分别转染HA-CREB3L4质粒，以HA-vector转染组作为对照。Westernblot、qRT-PCR鉴定转染效率，用于构建CREB3L4过表达细胞模型。CCK-8、EdU及集落形成实验检测CREB3L4敲减和过表达细胞模型的细胞增殖能力的变化。 4.检测CREB3L4对HCC肿瘤干细胞标记物的调控作用常规qRT-PCR检测CD44、CD133和AFP等肝癌干细胞的标志物在CREB3L4敲减和过表达细胞模型中的表达水平，以明确CREB3L4在维持肝癌干性中的作用。 5.构建裸鼠异种移植瘤模型，检测CREB3L4对HCC细胞增殖的调控作用裸鼠左侧腹股沟皮下注射10＾7个HUH7细胞(体积0.1ml)。当出现肉眼可见的肿瘤时，向肿瘤内注射shCREB3L4质粒，以等量shNC注射组作为对照。在第一次注射后第28天处死裸鼠，剥离皮下的肿瘤组织，进行质量和体积的测量，随后常规石蜡包埋，连续切片（厚5μm）,免疫组织化学染色检测CREB3L4和Ki67的表达水平。实验结果 1.数据库预测CREB3L4在HCC组织中高表达 GEPIA数据库检索发现，CREB3L4在HCC组织中的表达水平显著高于正常肝组织。比较CREB3L4高表达的患者与低表达患者总生存期和无病生存期发现，与CREB3L4低表达的患者相比，CREB3L4高表达患者的生存期有降低趋势，但没有统计学差异。 2.HCC组织中CREB3L4高表达且与临床病理分期正相关免疫组织化学染色结果显示，CREB3L4在正常肝组织中不表达或呈现低表达，而在HCC组织中呈高表达，且其免疫反应阳性沉淀物主要位于细胞核。统计学分析发现，CREB3L4的表达与HCC患者的TNM分期呈现正相关。按CREB3L4表达量的中位数将83例HCC患者分为CREB3L4高表达组和低表达组，分别绘制生存曲线，发现高表达组的患者存活期显著低于低表达组的患者，提示CREB3L4高表达与HCC的肿瘤分期及不良预后呈正相关。在20对HCC患者的肝癌组织和配对的癌旁组织进行westernblot检测发现，与癌旁组织相比，HCC组织中CREB3L4的表达显著升高。 3.CREB3L4促进HCC细胞的增殖能力 CCK-8染色显示，在CREB3L4过表达的HUH7和Hep3B细胞模型中，细胞的增殖活性增加。在CREB3L4敲减的HUH7和Hep3B细胞模型中，细胞的增殖活性下降。集落形成实验结果显示，CREB3L4过表达的HUH7和Hep3B细胞集落形成的数量和面积均高于对照组。CREB3L4敲减的HUH7和Hep3B细胞集落形成的数量和面积均低于阴性对照组。 EdU实验结果显示，上调CREB3L4表达后，EdU阳性的HUH7和Hep3B细胞显著高于对照组。而下调CREB3L4表达后，EdU阳性的HUH7和Hep3B细胞数显著低于对照组。综上所述，CCK-8实验、集落形成实验和EdU实验的结果均显示，CREB3L4可以上调HUH7和Hep3B细胞的增殖能力。 4.CREB3L4提高HCC肿瘤干细胞标记物水平，促进肿瘤的恶性程度 qRT-PCR检测显示，在CREB3L4过表达的HUH7细胞模型中，CD44、CD133和AFP水平显著高于空载对照组。与此相反，CREB3L4敲减后，CD44、CD133和AFP的表达著低于阴性对照组。 5.CREB3L4显著促进裸鼠异种移植肿瘤的生长裸鼠异种移植瘤实验显示，shCREB3L4注射组肿瘤的质量和体积减小。免疫组织化学染色显示，CREB3L4敲减后，Ki67的表达降低。以上结果提示CREB3L4可促进裸鼠异种移植肿瘤的生长。第二部分CREB3L4激活mTORC1信号通路促进HCC细胞的恶性表型材料方法 1.检测CREB3L4在HCC中发挥效应的信号转导通路利用CREB3L4过表达或敲减的HUH7和Hep3B细胞模型,westernblot检测mTOR、MAPK、AKT、NF-κB等信号通路分子的表达水平，以明确介导CREB3L4调控HCC细胞的主要信号通路。用mTORC1通路抑制剂(Rapamycin,100nM)预处理CREB3L4过表达的细胞模型，westernblot检测mTORC1通路的关键信号分子的表达水平，以进一步验证mTORC1信号通路在CREB3L4对HCC细胞调控中的作用。 2.探究CREB3L4调控HCC增殖能力的机制在HUH7和Hep3B细胞转染HA-CREB3L4质粒，构建CREB3L4过表达的细胞模型，用mTORC1特异性阻滞剂Rapamycin预处理，进行细胞功能学恢复实验。CCK-8实验和集落形成实验检测细胞增殖能力，以明确mTORC1信号通路在CREB3L4促进HCC增殖中的作用。 3.探究CREB3L4激活mTORC1信号通路的机制 3.1探究CREB3L4与Rheb的相关性 GEPIA数据库是常用的肿瘤检索数据库，可以查询多种基因在不同肿瘤中的表达情况及与特定分子的相关性。因此，在数据库中进行预测Rheb在HCC组织中的表达，分析Rheb与CREB3L4的相关性。为明确CREB3L4是否通过Rheb调节mTORC1信号通路，在CREB3L4过表达的HUH7和Hep3B细胞模型，使用qRT-PCR和westernblot检测Rheb的表达水平。Westernblot检测裸鼠异种移植的肿瘤组织中Rheb、p-mTORC1、mTORC1、CREB3L4等的表达水平。Westernblot检测Rheb和p-mTORC1在20例临床HCC组织和配对的癌旁组织中的表达水平。 3.2探究CREB3L4激活mTORC1信号通路的具体机制利用JASPAR数据库，预测CREB3L4与Rheb的结合位点，针对CREB3L4的预测结合位点设计引物，进行ChIP-PCR检测。随后进行双荧光素酶报告基因实验，检测CREB3L4与Rheb基因的启动子区的结合能力。实验结果 1.CREB3L4正向调控mTORC1信号通路成功建立CREB3L4过表达及敲减的细胞模型后，westernblot检测结果显示，CREB3L4过表达后，mTORC1的磷酸化水平明显上升，其下游分子S6K1、S6和4E-BP1等的磷酸化水平也明显上升。CREB3L4敲减后，p-mTORC1、p-S6K1、p-S6和p-4E-BP1表达明显下降。为了进一步验证CREB3L4对mTORC1信号通路调控作用，使用mTORC1的抑制剂Rapamycin预处理CREB3L4过表达的HUH7和Hep3B细胞模型。Westernblot检测发现，与对照组相比，Rapamycin预处理组的p-mTORC1的表达降低，逆转了CREB3L4对mTORC1信号通路的激活作用。上述结果提示在HCC细胞中，CREB3L4正向调控mTORC1信号通路。 2.CREB3L4通过mTORC1信号通路促进HCC细胞的增殖为观察CREB3L4是否通过mTORC1通路促进HCC细胞增殖，用mTORC1的抑制剂Rapamycin预处理CREB3L4过表达的HUH7和Hep3B细胞模型，分别使用CCK-8实验和集落形成实验检测CREB3L4对HCC细胞增殖的调控是否依赖mTORC1信号通路的活化。结果发现，在HUH7和Hep3B细胞中过表达CREB3L4后，细胞的增殖能力显著增加。而Rapamycin干预后，CREB3L4促进HCC细胞增殖的能力被逆转。 3.CREB3L4通过调控Rheb的转录激活mTORC1信号通路 3.1CREB3L4与Rheb在HCC 收起

关键词 : 肝细胞肝癌 CREB3L4 mTORC1 索拉非尼化疗敏感性