中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 张菁重庆大学 2021年博士导师: 龙彬共368页

摘要 : 渝东南地区位于鄂湘渝黔交界地带，连接着西南山地与华中地区，是土汉苗多民族聚居地区，也是巴楚之间重要的交通廊道与枢纽。其多山纵贯、平坝散布的地理环境，立体分异的自然资源和气候，多民族杂居的民族特征，以及从“蛮化”到“汉化”的区域发展... 展开渝东南地区位于鄂湘渝黔交界地带，连接着西南山地与华中地区，是土汉苗多民族聚居地区，也是巴楚之间重要的交通廊道与枢纽。其多山纵贯、平坝散布的地理环境，立体分异的自然资源和气候，多民族杂居的民族特征，以及从“蛮化”到“汉化”的区域发展历史赋予了这一地区多样化的传统村落景观。而相对区隔的交通环境和落后的经济发展也使得这一地区至今仍保留了相对丰富且原生态的景观载体。论文从地域的自然历史文化出发，结合渝东南传统村落的样本分析，以流域和民族为线索，系统论述了民族交界地区传统村落景观特征的多样性与交融性，解释了该地区传统村落景观的动态变化机制，并结合该地区传统村落景观特征的当代变迁，提出了具有针对性的保护策略。选题针对当前民族地区传统村落保护的现实问题，具有比较重要的理论价值与现实意义。论文在“以景观特征为对象，以流域分异为线索，以民族关系为逻辑”的研究思路下，以传统村落景观系统的层次性与生成性特征为研究依据，通过对渝东南传统村落的自然生态景观、经济生产景观、群体聚落景观和家庭宅屋景观四个层次的景观特征要素提取与分类，将村落的地理单元、主要产业、空间模式、街巷格局、文化空间和宅屋形式等要素的空间分布与特征进行不同流域间的比较，以典型个案研究结合定量数据分析，系统探讨了传统村落景观特征在渝东南地区以流域为核心，自北向南的分异特征。并以土汉苗三个民族族群“从区隔到融合”的历史发展过程为阶段划分的依据，对景观特征生成萌芽期、形成期、成熟期三个阶段的驱动因素、压力作用、景观状态、限制影响和文化回应进行梳理，提取出景观特征的生成机制。论文主要结论如下：1.景观特征是传统村落景观系统构成与生成机制的重要研究范畴。2.渝东南传统村落景观受到地理区隔与民族交往的双重作用。3.渝东南传统村落景观特征是以自然生态景观和经济生产景观为主导要素，以群体聚落景观和家庭宅屋景观为辅助要素相互作用而综合构成的。4.渝东南传统村落景观特征整体上呈现出与流域相关的分异特征，呈现自北向南的渐变规律，山脉的阻隔效应与河流的孔道效应是渝东南地区传统村落景观分异和文化交流的主要影响因素。5.基于流域分异的视角，以毛坝盖-广沿盖为界将渝东南地区的传统村落景观特征划定为南北两个大的文化区域和五个景观特征区。6.渝东南传统村落多样化的景观特征是不同历史阶段主导外力与内部适应力交互作用的结果：在萌芽期，景观特征生成以自然山水与民族隔离的双重区隔下的自然适宜机制为主导；在形成期，景观特征生成以土汉之间局部交往下的资源竞争机制为主导；在成熟期，景观特征生成以民族全面融合后的社会转变机制为主导。7.渝东南地区景观特征的生成符合“点-轴”渐进式扩散规律，是景观系统随复杂性增强而逐级分叉的结果，也是自组织适应与他组织选择交互作用的结果。本研究全面系统的提炼了土苗汉民族交界地区的传统村落景观要素及其特征，划定了区域传统村落景观特征的分类和分区，对民族交界地带传统村落景观特征的多样性给出了合理的解释，并揭示了其内在的生成机制。研究成果有助于充实与完善传统村落景观的理论框架体系，助力民族地区的人居环境建设与景观保护，并为渝东南传统村落保护与地方性景观营造提供参考。收起

关键词 : 传统村落景观特征生成机制

2. 清华简《书》类文献《说文》未见字集释与研究

[学位论文] 张菁哈尔滨师范大学 2020年硕士导师: 徐广才共338页

摘要 : 清华简是2008年入藏清华大学的一批重要的战国中晚期楚系竹简，具有重要的研究价值，自2010年至2018年共发布《书》类文献14篇。目前从《书》类文献角度进行的研究还不多见，本文以清华简《书》类文献《说文》未见字为研究对象，收集诸家释读意见，并... 展开

关键词 : 清华简《书》《说文》未见字集释

3. 印楝素和喜树碱抑制果蝇雌性生殖干细胞增殖的作用机理

[学位论文] 张菁华南农业大学 2021年博士导师: 钟国华共181页

摘要 : 生殖干细胞（Germlinestemcell,以下简称GSC）具有自我更新能力和向生殖细胞分化的能力，在维持自身数量的同时，不断产生分化的生殖细胞，对于维持种群繁衍与稳定具有决定性意义，是“生命之母”。本文以黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）作为工具... 展开生殖干细胞（Germlinestemcell,以下简称GSC）具有自我更新能力和向生殖细胞分化的能力，在维持自身数量的同时，不断产生分化的生殖细胞，对于维持种群繁衍与稳定具有决定性意义，是“生命之母”。本文以黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）作为工具，研究比较了印楝素、喜树碱等10种植物源杀虫活性化合物对果蝇雌性生殖干细胞（femaleGSC）分化的影响，通过单细胞测序、免疫荧光、原位杂交、RNAi、过表达等技术方法，基本阐明了印楝素和喜树碱对昆虫GSC维持和分化的调控机制。主要结果如下： 1、研究比较了10种代表性植物源化合物对果蝇GSC维持、分化与生殖力的影响。在供试10种化合物中，明确印楝素和喜树碱能够以不同方式显著影响果蝇GSC的维持与分化，印楝素能够减少GSC数目，喜树碱能减少GSC数目、增加CB数目。活性测定表明，印楝素处理可抑制果蝇生殖能力。利用毛细管法和亮蓝法测定表明，饥饿果蝇对印楝素50mg/L和100mg/L无明显拒食作用。印楝素处理对卵巢保幼激素和胰岛素滴度无显著影响，但显著上调卵巢中蜕皮激素滴度。印楝素处理导致卵巢中护卫细胞数目减少，不影响其他微环境（niche）相关通路。印楝素100mg/L处理能显著诱导果蝇卵巢中GSC和其他生殖细胞发生细胞凋亡。 2、深入研究了印楝素诱导果蝇GSC细胞凋亡的调控机制。印楝素50mg/L处理后，果蝇通过miR-bantam下调生殖细胞hid的表达，但不抑制GSC凋亡产生，却导致GSC严重丢失；相反hid高表达能够援救（rescue）印楝素50~100mg/L处理引起的GSC丢失。细胞凋亡基因rpr过表达同样也能援救印楝素处理导致的GSC丢失。利用p35过表达不能援救印楝素引起的GSC数目减少。通过DIAP1过表达抑制护卫细胞凋亡，能够暂缓卵原区GSC丢失。护卫细胞通过p35过表达抑制凋亡，对GSC丢失无显著影响。 3、运用单细胞测序技术研究印楝素影响果蝇GSC自我更新的调控机制。制作果蝇成虫卵巢单细胞悬液，运用10XGenomics技术进行单细胞分离测序，通过已知的细胞标记基因分选出生殖细胞群Cluster14，并对生殖细胞群上调基因进行GO分析和KEGG分析，明确不同细胞类型的功能。对生殖细胞群进行拟时分析，结果表明Cluster0位于分化发育的起点，为未分化细胞群，随后分化能够形成2个分支，其中一个分支为Cluster2，可能为生殖干细胞分化成后期生殖细胞的过渡细胞，另一个分支为滋养细胞和卵母细胞。利用vasa、myc、bam和nanos在未分化细胞群Cluster0中分选出29个GSC，其中野生型GSC有23个，印楝素处理的GSC有6个。将29个GSC与其余Cluster0中未分化细胞进行差异分析，其中40个基因上调，1个基因下调；将29个GSC与其余Cluster14中的生殖细胞进行差异分析，其中936个基因上调，76个基因下调；合并分析后发现33个GSC中高表达基因，可作为新的GSC标记基因。对印楝素处理的6个GSC与对照23个GSC进行差异性分析，结果表明印楝素处理后会导致GSC中128个基因上调，32个基因下调。对其中候选9个基因进行基因功能的验证，结果表明其中6个基因对GSC维持和分化具有相关性，这6个基因处于4个不同调控网络，表明印楝素可在不同层次对GSC产生影响。 4、系统研究了喜树碱对果蝇GSC维持与分化的调控机制。活性测定表明，喜树碱处理果蝇能显著抑制生殖能力，急性致死作用、拒食作用不明显。喜树碱处理后，导致卵巢护卫细胞异位以及滤泡细胞减少，不影响微环境中其他信号的表达。喜树碱处理后包囊母细胞和2-cells细胞周期停滞在G1/S和S期，bam下调导致2-cells的数目显著增加，bam回补能够援救停滞的细胞周期，使其向后分化。喜树碱能够通过topI导致GSC数目降低，在topI被干扰后，卵巢出现异常形态，且出现异常形态的卵巢在干扰组中比喜树碱处理的更多。综合比较喜树碱与印楝素对GSC分化的调控机制可知，植物源化合物对GSC分化的影响既有共性也有个性特征，这可能与其结构类型和作用靶点的差异有关。本论文将天然源农药作用机制、昆虫毒理学与果蝇遗传实验技术相结合，通过系统研究印楝素、喜树碱等对昆虫GSC分化的调控机制，深入探讨了代表性植物源农药对果蝇GSC命运影响，发现了印楝素和喜树碱调控昆虫生殖的新机理。本论文结果在理论上有助于丰富植物保护、尤其是生物农药毒理学研究内容，推动农业昆虫干细胞的研究，为害虫防治提供新思路，为创制新农药等提供理论基础。收起

关键词 : 印楝素喜树碱果蝇雌性生殖干细胞单细胞测序

4. 社会结构与居住形态——重庆近代城市居住建筑形态研究

[学位论文] 张菁重庆大学 2013年硕士导师: 龙彬共157页

摘要 : 重庆作为中国的历史文化名城，从其得“重庆”之名开始，距今已有800余年。独特的城市发展和地域条件使重庆形成了其所特有的城市居住形态。就其城市发展而言，从1891年正式开埠到新中国成立的近代时期足城市的重要变革期。这个时期城市的社会、经济、... 展开重庆作为中国的历史文化名城，从其得“重庆”之名开始，距今已有800余年。独特的城市发展和地域条件使重庆形成了其所特有的城市居住形态。就其城市发展而言，从1891年正式开埠到新中国成立的近代时期足城市的重要变革期。这个时期城市的社会、经济、文化都发生了根本性的变化:从传统的以商业、农业为核心产业，城乡一元化的西部商贸中转港口，转变为近代化的以工商业为核心产业，城乡二元化的全国政治、经济、文化中心。因此这个时期的城市居住形态展现出前所未有的丰富性和复杂性。这些复杂多样的生活方式和居住建筑形式是重庆现代城市居住形态的历史根源，也是梳理重庆城市空间格局演变的不可缺少的一环。本文的研究正是基于对重庆近代这一特殊历史时期的关注，通过对居住形态的理论研究，提出从居住形态的主体性出发，以重庆近代城市发展为角度，分析城市发展与居住建筑分布的关系，并通过对近代重庆社会人群的居住生活方式的分析，探寻其对建筑形式的影响，并得出近代重庆各阶层多样化居住建筑形式特征。全文首先通过对居住形态这一概念及其结构的研究，对居住形态核心要素进行了梳理，得出居住生活方式与居住建筑形式是居住形态缺一不可的两个组成部分。接下来通过对近代重庆所经历开埠，设市和陪都三个阶段的社会、经济、文化的历史背景研究，对近代重庆社会人口结构变化进行分析，得出近代居住建筑所呈现的住宅的阶层性现象，并将其分为社会上层、中层、下层三类人群服务的住宅类别。在此基础上，将近代重庆居住形态纳入到近代重庆城市发展的总体格局，就城市居住空间分布格局和上、中、下三个阶层的居住建筑形态进行分析。通过对这三类住宅使用者居住生活方式的研究，梳理出其对建筑形式的影响，并从平面、立面和空间三个方面对建筑形态特征进行分析，得出重庆近代城市居住建筑形态的整体图景及其蕴含的居住生活方式。此部分为论文的核心章节。本文的研究，是对重庆近代建筑史的深入和完善，也是对重庆城市居住形态研究的充实。更为重要的是，尝试揭示出重庆近代居住形态的阶层分异现象，得出城市社会结构、城市居民居住生活方式与居住建筑形式的关系。收起

关键词 : 城市住宅社会结构居住空间建筑形态

5. 《庄子》的动物书写研究

[学位论文] 张菁汕头大学 2022年硕士导师: 张艳艳共151页

摘要 : 就研究对象而言，学界对于《庄子》中动物书写的研究已蔚然可观，但在新冠疫情肆虐的当下，以《庄子》中的动物书写为切入点，重新思考人类与动物之间的关系依旧是具有较强现实意义的。而从研究方法上看，罗兰·巴特的作品在思想和写作形式上都与《庄... 展开就研究对象而言，学界对于《庄子》中动物书写的研究已蔚然可观，但在新冠疫情肆虐的当下，以《庄子》中的动物书写为切入点，重新思考人类与动物之间的关系依旧是具有较强现实意义的。而从研究方法上看，罗兰·巴特的作品在思想和写作形式上都与《庄子》有较多契合之处，同时其叙事学理论的适用范围囊括了不同时代、国度和形式的内容，其叙事学本身包含的内容又横跨经典和后经典两个阶段，因此能为《庄子》中动物书写的研究提供有效而丰富的方法论资源，助力开拓出新的研究成果。本文第二部分通过截取《庄子》中所有涉及动物的文句，在内容和形式层面上分别进行了分类细化，内容上补充进“动物身体部位”“与动物相关的工具”“与动物相关的零碎活动”“起形容词功效的动物”等四种以往被忽略的类型，形式上则新总结出“角色高谈”“作者默叙”“动物人格化”以及“《庄子》中的庄子”四种叙述模式。在叙述模式的框架内，动物在文中所起的作用能被较清晰地辨识出来——有“作为工具”“比附人物”以及“作为例证”三种，而只有“作为例证”的动物才是别有深意的动物意象、寓言，前两类动物并不属此范畴。第三部分通过引入罗兰·巴特经典叙事学的描写层次理论，将学界既有的“人-物”关系讨论从行为层拓展至功能层和叙述层，由此丰富了“人-物”关系中“人”的维度（行为层对应书中角色，叙述层对应作者和读者），进而使“人-物”之间的复杂关系得以呈现，在学界既有的“和谐”结论之外，还发现了敌对、主客、分级等多种关系类型。在“研究维度”的问题上，本文第二部分四种叙述模式的总结已是形式维度的开发尝试，而在第四部分中，则首先通过辨析动物寓言与重言、卮言的交叉关系，归纳出“重言式动物寓言”和“卮言式动物寓言”两种言说方式，继而在罗兰·巴特后经典叙述学的启发之下，引入政治、文化等外部因素对其进行解读，最终从第一种动物寓言中读出庄子的政治批判，从第二种动物寓言中读出庄子对于文学创作的游戏态度，故而这一部分既是对形式维度的进一步开发，亦是对内容维度的进一步补充。收起

关键词 : 《庄子》罗兰· 巴特动物书写文学游戏动物意象

6. 基于视觉感知的个性化图像检索的初步研究

[学位论文] 张菁北京工业大学 2008年博士导师: 沈兰荪共144页

摘要 : 随着数字图像数量的急剧增长，如何高效、快速地从海量图像数据中检索出用户所需的信息是当前图像应用领域的一个重要问题。基于内容图像检索是目前国内外的一个研究热点，其面临的最大难题就是图像低层视觉特征与高层语义之间存在的巨大语义鸿沟。图... 展开随着数字图像数量的急剧增长，如何高效、快速地从海量图像数据中检索出用户所需的信息是当前图像应用领域的一个重要问题。基于内容图像检索是目前国内外的一个研究热点，其面临的最大难题就是图像低层视觉特征与高层语义之间存在的巨大语义鸿沟。图像检索的根本目的是要为用户提供所需要的服务，满足用户的个性化需求，这也是新一代图像检索技术的发展趋势。人们在浏览图像时，人眼视觉系统将图像传递到大脑，此时人眼的视觉注意和视点运动表达了人们对图像的喜好或兴趣，这个过程称为视觉感知。为了克服图像检索中的语义鸿沟问题，论文提出一种融合视觉注意模型和视点跟踪的视觉感知技术，希望通过直接感知用户视觉信息，得到客观反映用户语义的个性化兴趣信息，实现基于视觉感知的个性化图像检索。主要工作有： (1)论文首先对基于视觉感知的个性化图像检索的研究意义和课题背景进行了阐述。对现有的视觉感知技术以及个性化图像检索技术的研究现状进行了综述。 (2)依据视觉注意机制，提出了一种基于视觉注意模型和进化规划的感兴趣区检测方法。采用进化规划方法分割图像候选区域，视觉显著度由视觉注意模型产生的局部显著和全局显著共同度量。在返回抑制以及显著度增强因子的作用下，注意焦点选取候选区域得到感兴趣区。这一方法符合人眼视觉注意机制，取得了较为满意的感兴趣区检测结果。 (3)根据图像检索系统人机交互的需求，设计并实现了闪烁红外LED和常亮红外LED两套视点跟踪设备的改造方案。通过对比各类摄像头的性能，选择适合的镜头及LED参数，常亮红外LED方案表现出更好的视点跟踪效果。 (4)结合常亮红外LED视点跟踪设备，提出了一种基于双阈值的低复杂度实时视点跟踪方法。该方法用双阈值法联合定位瞳孔-反射点、几何映射法预测视点位置。与用人脸检测定位人眼的传统方法相比，此方法显著提高了视点跟踪的速度。 (5)基于Web Camera的应用，利用拍摄到人眼图像相邻两帧的相似性，提出了一种自适应模板视点跟踪方法。首先用类Harr特征的快速人脸检测算法和自适应人眼模板匹配方法检测人眼区域，再从人眼区域中心到周边全搜索找到反射点，最后将人眼位置、瞳孔中心和反射点作为BP神经网络的输入矢量预测视点位置。相比传统模板法，提出的自适应模板法人眼定位更准确。 (6)针对图像检索的实际应用——无观察任务和有观察任务两种情况，提出了一种基于视觉感知的感兴趣区检测方法。前一种情况，采用视觉注意模型检测图像的候选感兴趣区；后一种情况，通过收集用户浏览图像的视点信息，计算用户的注视兴趣度，由此产生了客观化的感兴趣区检测结果。经过对比用户的主观评价，所提方法与用户实际兴趣有较高的符合率。 (7)通过分析视觉感知的感兴趣区，用视点跟踪进行相关反馈，构建了一种基于用户兴趣模型的个性化图像检索系统。相比传统MARS方法，经过用户兴趣模型过滤的图像检索结果在查准率和查全率都有明显提高，在一定程度上满足了用户的个性化要求，有效的克服了低层视觉特征和高层语义之间的语义鸿沟。收起

关键词 : 个性化图像检索系统视觉感知语义鸿沟感兴趣区用户兴趣模型

7. SDC4通过促进CYLD对RIg-I K63位去泛素作用负调控抗病毒天然免疫信号通路

[学位论文] 张菁中国科学院大学 2014年博士导师: 孙钦秒共138页

摘要 : 天然免疫是机体抵抗病原微生物的第一道防线。该系统通过不同的模式受体识别外源微生物，这些受体主要包括Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）、RIG-Ⅰ样受体(RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs)及NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)。RLRs作为胞质... 展开天然免疫是机体抵抗病原微生物的第一道防线。该系统通过不同的模式受体识别外源微生物，这些受体主要包括Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）、RIG-Ⅰ样受体(RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs)及NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)。RLRs作为胞质内模式识别受体，在抗病毒天然免疫信号通路调节中发挥了重要作用。 RIG-Ⅰ(retinoic acid-inducible gene-Ⅰ)作为RLRs家族的重要成员，识别胞质病毒RNA。与病毒RNA结合后，RIG-Ⅰ构象发生变化，其激活后募集下游接头蛋白MAVS（mitochondrial antiviral signal）进而激活转录因子IRF3(interferonregulate factor3)和NF-κB(nuclear factor-κB)，诱导Ⅰ型干扰素及多种细胞因子的产生，引发抗病毒免疫反应。而过度的炎症反应又会对机体造成伤害，引发诸如全身性红斑狼疮等自身免疫疾病，因此对炎症反应的适当调控对维持机体的稳态至关重要。为了进一步探讨RIG-Ⅰ在抗病毒天然免疫中的调控机制，本研究以RIG-Ⅰ(N)为诱饵蛋白进行酵母双杂交实验，筛选到其相互作用蛋白SDC4。 SDC4属于蛋白聚糖家族，定位于细胞膜，参与调节细胞骨架形成、细胞增殖、分化、粘附及迁移等过程，在抗病毒天然免疫中的功能鲜有报道。本文的研究结果显示:第一，SDC4转录及蛋白表达水平及与RIG-Ⅰ的相互作用在仙台病毒(Sendai virus，SeV)诱导下增强;第二，过表达SDC4能够显著抑制由SeV及RIG-Ⅰ(N)激活的抗病毒天然免疫反应，沉默SDC4能够明显增强免疫反应，因此认为SDC4作为负调控因子参与RIG-Ⅰ介导的天然免疫信号传导;第三，SDC4参与调控病毒复制，过表达SDC4促进水泡性口炎病毒(VSV)的复制，而沉默SDC4显著抑制该病毒复制;第四，SDC4蛋白与去泛素酶CYLD存在较强的相互作用，SDC4胞质的可变区及CYLD酶活区参与了相互作用，二者的结合显著增强CYLD与RIG-Ⅰ的相互作用，促进对RIG-Ⅰ(N) K63位多聚泛素化链的去除，进而抑制了RIG-Ⅰ的活性;第五，SDC4与MAVS间也存在相互作用，竞争性地抑制了RIG-Ⅰ与MAVS间的信号传递。综上所述，SDC4与CYLD的相互作用增强了CYLD与RIG-Ⅰ的结合能力，促进了CYLD对RIG-Ⅰ K63位多聚泛素链的去除，抑制了RIG-Ⅰ的活性;另外SDC4与RIG-Ⅰ、MAVS的结合均竞争性抑制了RIG-Ⅰ向MAVS的信号传递。通过以上两个途径SDC4负向调控了RIG-Ⅰ介导的抗病毒天然免疫信号传导，促进机体稳态的维持。收起

关键词 : SDC4蛋白抗病毒天然免疫去泛素化酶信号通路

8. Rab10 Thr73位点磷酸化在脑内的生理作用研究

[学位论文] 张菁山东大学 2023年博士导师: 王兴龙共131页

摘要 : 研究背景: Ras相关蛋白(Rab,Ras-relatedprotein)是小GTP酶Ras超家族中目前已知最大成员分支，主要参与细胞内膜类结构的转运、加工过程，如囊泡的出芽、形成、输运、融合以及膜结构形态的维持等。Rab家族的蛋白结构具有较高的相似性，均包含4个... 展开研究背景: Ras相关蛋白(Rab,Ras-relatedprotein)是小GTP酶Ras超家族中目前已知最大成员分支，主要参与细胞内膜类结构的转运、加工过程，如囊泡的出芽、形成、输运、融合以及膜结构形态的维持等。Rab家族的蛋白结构具有较高的相似性，均包含4个与GDP/GTP结合，并发挥GTP酶活性的结构域(switchⅠ到switchⅣ)以及位于C端的P结构域。在switchⅡ结构域中存在一段较为保守的序列，其中的丝氨酸、苏氨酸可以被帕金森病(Parkinson''sdisease,PD)相关蛋白激酶——富亮氨酸重复激酶2(Leucine-richrepeatkinase2,LRRK2)磷酸化修饰，从而引发神经元内囊泡转运、自噬、溶酶体功能和纤毛形成等细胞过程的障碍，参与到疾病发病机制当中。在众多的Rab家族分子中，Rab10显得格外与众不同。首先，Rab蛋白一般具有较为固定的细胞内定位和相对单一的功能，但是Rab10几乎在细胞内所有的膜类细胞器上均有分布，功能十分复杂，可以参与调节内质网动力学、神经元轴突发育、纤毛形成及纤毛内转运、溶酶体管状化和胞外分泌及细胞自噬等多个过程;其次，Rab10在不同细胞、组织和发育阶段中发挥的作用不尽相同;此外，Rab10的磷酸化与多种神经退行性疾病密切相关。有研究报道，无论是在散发性PD还是家族性PD患者脑内，均可检测到LRRK2激酶活性及Rab10磷酸化水平的异常升高。而在阿尔茨海默病(Alzheimer''sdisease,AD)患者脑内同样可以检测到Rab10磷酸化水平显著增高，并且这些异常磷酸化的Rab10与AD特征性神经病理改变——tau蛋白过度磷酸化导致的神经纤维缠结,具有高度的共定位。此外，Rab10还是Rab家族中与LRRK2亲和力最高的激酶底物。目前有已多项研究关注PD相关突变的LRRK2对Rab10异常磷酸化产生的效应。首先，LRRK2对Rab10的过度磷酸化会抑制细胞纤毛的发生，而促进纤毛的解聚。此外，LRRK2可以将Rab10、Rab8a和Rab35募集到发生应激的溶酶体上，并在此对它们进行磷酸化，从而促进溶酶体管状化和胞外分泌。当线粒体发生损伤时，Rab10可以在PINK1和PRKN的作用下，聚集到去极化的线粒体上，并招募自噬受体OPTN,促进线粒体自噬;而当LRRK2发生突变，激酶活性异常升高时，被磷酸化的Rab10无法再被募集到这些线粒体上，从而引发线粒体自噬障碍。但是，以上研究大多在LRRK2致病突变的体外细胞模型中展开，而Rab10磷酸化在体内，尤其是在脑内发挥的生理作用，仍亟待研究。研究目的: 1.探讨Rab10Thr73位点磷酸化对小鼠行为学表型的影响; 2.探讨Rab10Thr73位点磷酸化影响的主要脑区和细胞类型; 3.探讨Rab10Thr73位点磷酸化对脑内神经元形态、功能的影响及其分子机制。研究方法: 1.构建模拟Rab10持续非磷酸化和持续磷酸化状态的小鼠模型利用CRISPR/Cas9技术，分别构建模拟Rab10持续非磷酸化状态和持续磷酸化状态的Rab10T73V和T73D突变小鼠模型,并利用DNA测序、免疫蛋白印迹(WesternBlot,WB)对Rab10的突变和表达水平进行了验证。 2.检测Rab10突变小鼠的行为学表型对3月龄Rab10T73V/T73V小鼠和3月龄、5月龄、7月龄和9月龄Rab10T73D/+小鼠及同窝Rab10+/+小鼠进行一系列的行为学检测，包括:旷场试验、高架十字迷宫试验、明暗箱试验、Y迷宫试验、○迷宫试验、T迷宫试验、藏宝试验、筑巢试验、巴恩斯迷宫、加速旋转杆试验、悬尾试验、强迫游泳试验、条件性恐惧试验、代谢笼和新物体识别试验，用以检测小鼠自发活动度、焦虑样行为、重复性强迫样行为、学习记忆、抑郁样行为、运动协调能力和能量代谢等方面的表型。 3.检测Rab10突变小鼠突触结构和功能的改变提取Rab10+/+及Rab10T3V/T73V小鼠纹状体、杏仁核、背侧海马、腹侧海马和前额叶皮层这5个与焦虑行为相关的脑区蛋白，WB检测VAMP1、VAMP2、Syntaxin1、SHANK2、Synaptophysin、PSD95等突触蛋白的表达水平，确定Rab10T73V突变影响的主要脑区。再对实验中确定的责任脑区——纹状体进行针对性检测:利用脑片膜片钳,记录中型棘突神经元(mediumspinyneuron,MSN)微小抑制性突触后电流(miniatureinhibitorypostsynapticcurrent,mIPSC)和微小兴奋性突触后电流(miniatureexcitatorypostsynapticcurrent,mEPSC),以检测突触功能;利用透射电镜观察突触密度、突触小泡的密度和直径、突触后致密斑的长度和宽度;对纹状体脑区进行抑制性突触前、后标志物GAD67和Gephyrin,兴奋性突触前、后标志物VGLUT1和PSD95的免疫荧光染色，分析抑制性突触和兴奋性突触的密度。 4.检测Rab10突变小鼠神经元和胶质细胞的密度对3月龄实验小鼠进行尼氏染色，全景扫描小鼠皮层、背侧海马及纹状体脑区切片,计数这些脑区中神经元的密度。再对小鼠进行小胶质细胞标志物Iba1和星形胶质细胞标志物GFAP的免疫组化染色,统计纹状体脑区中小胶质细胞的密度和GFAP的表达情况。 5.检测Rab10突变小鼠的神经元分支及树突棘发育情况对3月龄实验小鼠进行冠状位切片及高尔基染色，使用20倍镜沿z轴多层扫描小鼠纹状体、背侧海马、腹侧海马及杏仁核脑区的全景图像，计数、测量神经元树突分支数目及长度。再对小鼠进行树突标志物MAP2的实时荧光定量PCR和免疫荧光染色，分别检测MAP2mRNA和蛋白表达水平。此外，体外培养胚胎16.5天小鼠原代神经元,培养3天后，进行神经元轴突标志物neurofilament和树突标志物MAP2的免疫荧光染色,测量、统计神经元轴突和小神经突的数目及长度。随后使用63倍油镜，沿z轴拍摄高尔基染色切片，统计树突棘密度及各类树突棘的占比情况。 6.检测Rab10突变体的差异相互作用蛋白使用天然细胞裂解液提取3月龄Rab10+/+及Rab10T73V/T73V小鼠纹状体脑区总蛋白，利用Rab10抗体将组织中的Rab10蛋白免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)下来，应用串联质谱标签(tandemmasstag,TMT)定量蛋白质组学，分析野生型Rab10和Rab10T73V突变体之间的差异相互作用蛋白，并对这些蛋白进行生物信息学分析，找到其中涉及的关键分子信号通路。研究结果: 第一部分Rab10T73V突变对小鼠的影响 1.Rab10T73V突变小鼠表现出特征性的焦虑样行为改变 Rab10T73V/T73V小鼠较Rab10+/+小鼠，在旷场中央区活动的时间明显缩短。在高架十字迷宫和○迷宫中，Rab10T73V/T73V小鼠在开放臂或开放区域中活动的时间也呈现显著降低。在明暗箱试验中，Rab10T73V/T73V小鼠在明箱中活动的时间明显缩短，进入明箱的次数减少。此外，Rab10T73V/T73V小鼠在筑巢试验中撕碎的棉花相对较少，在藏宝试验中埋藏的玻璃珠数目也明显减少。而针对小鼠自发活动度、学习记忆、抑郁样行为、运动协调能力和能量代谢等方面的试验中，两组小鼠间未检测出显著差异。上述结果表明Rab10T73V突变导致小鼠出现了焦虑样行为改变及重复性强迫样行为的损害。 2.Rab10T73V突变小鼠纹状体脑区突触蛋白表达谱发生改变，抑制性突触信号传递障碍在检测的5个与焦虑相关的脑区中，仅在纹状体脑区中检测到Rab10T73V/T73V小鼠突触蛋白表达的改变。其中，3个构成突触前SNARE复合物的蛋白VAMP1、VAMP2和Syntaxin1及突触后膜蛋白SHANK2在Rab10T73V/T73V小鼠纹状体脑区中表达升高。进一步检测Rab10T73V/T73V小鼠纹状体脑区MSN突触电生理功能，发现mIPSC的频率显著降低，但波幅未出现明显改变;而mEPSC的频率和波幅均未表现出明显差异。此外，免疫荧光染色和透射电镜结果显示，抑制性突触和兴奋性突触的密度、突触后致密斑长度和宽度、突触前囊泡的密度及直径在两组小鼠间未见显著差别。这些结果提示Rab10T73V突变损害了纹状体抑制性突触信号传导，但未对突触的结构产生显著影响。 3.Rab10T73V突变小鼠神经元密度、星形胶质细胞和小胶质细胞未出现明显改变尼氏染色并未检测到Rab10T73V/T73V小鼠与Rab10+/+小鼠在皮层、海马和纹状体脑区中神经元密度的差异。同时，Iba1标记的小胶质细胞和GFAP标记的星形胶质细胞在两组小鼠同样未见明显差别。因此，Rab10T73V突变并不会对小鼠脑内神经元和胶质细胞的密度产生明显影响。 4.Rab10T73V突变小鼠纹状体脑区MSN树突分支增多高尔基染色显示，Rab10T73V/T73V小鼠纹状体MSN树突分支增多，总树突长度增长,但平均树突长度并不受影响。而背侧海马、腹侧海马及杏仁核中神经元形态均未见明显改变。进一步研究发现，与Rab10+/+小鼠相比，Rab10T73V/T73V小鼠纹状体脑区树突标志物MAP2的mRNA和蛋白表达水平均出现显著升高。因此，Rab10T73V突变可以特异性地促进纹状体MSN树突的过度分支，引发神经元功能障碍。 5.Rab10T73V突变小鼠纹状体脑区MSN树突棘成熟度升高针对Rab10+/+和Rab10T73V/T73V小鼠不同脑区神经元树突棘进行比较、分析发现，T73V突变并不会影响脑内神经元树突棘的密度。进一步对这些树突棘进行分类比较发现，Rab10T3V/T73V小鼠纹状体MSN中成熟树突棘（短粗型、蘑菇型和分叉型）增多，占比更高;而未成熟的树突棘（丝状伪足型、细长型和细型），尤其是细型树突棘的比例显著降低。而背侧海马、腹侧海马和杏仁核神经元的树突棘成熟度未受明显影响。因而,Rab10T73V突变可以特异性地促进纹状体MSN中树突棘过度成熟。 6.T73V突变改变了Rab10与细胞骨架组装相关的互作蛋白网与野生型Rab10相比，共有89个蛋白与Rab10T73V突变体的结合发生改变，其中62个蛋白与Rab10T73V突变体亲和力升高，另有27个蛋白与之亲和力降低。GO富集分析发现，这些差异结合蛋白大多定位于细胞骨架、突触、树突棘等细胞组分，与神经丝束的组装、肌动蛋白丝加帽和组装、突触囊泡的内吞、轴突发育和神经元投射的形成等生物过程密切相关。以上信息提示Rab10T73V突变对神经元树突分支、树突棘和突触功能的影响，可能与神经元细胞骨架有关。第二部分Rab10T73D突变对小鼠的影响 1.Rab10T73D纯合突变小鼠脑、肺和肾脏发育异常，出生时或出生后不久死亡大部分Rab10T73D/T73D小鼠在出生时或出生后1天内死亡，至断乳时，在获得的77只小鼠中仅发现1只Rab10T73D/T73D小鼠。此外，Rab10T73D/T73D新生鼠与Rab10T73D/+和Rab10+/+新生鼠相比，脑和肾脏重量明显降低，肺脏重量明显增加。HE染色发现，Rab10T73D/T73D新生鼠肺组织局部存在肺泡塌陷和肺不张，可能因此导致了新生鼠的死亡。 2.Rab10T73D杂合突变小鼠至9月龄未出现明显行为学改变 3月龄、5月龄、7月龄和9月龄Rab10TD/+小鼠在旷场试验、高架十字迷宫、Y迷宫、新物体识别试验和T迷宫中与Rab10+/+小鼠表现基本无异。因收起

关键词 : 神经退行性疾病 Rab10 Thr73位点异常磷酸化神经元树突生理作用

9. 羧酸介导的胺化以及芳基化反应研究

[学位论文] 张菁中南民族大学 2023年硕士导师: 胡小强共130页

摘要 : 羧酸是最常见的有机分子之一，广泛存在于天然产物、药物分子以及功能材料中。因其具有廉价易得、性质稳定和结构多样性等优点，常被用作化学合成的一种重要原料。近年来，羧酸参与的催化转化被广泛用于多种化学键的高效构建以及一些具有生物活性分子... 展开

关键词 : 羧酸脱羧官能化碳氢活化偶联反应四取代烯烃聚集诱导发光胺类化合物

10. 新型蛋白修饰试剂的设计及其在蛋白质组学研究中的应用

[学位论文] 张菁中国科学院上海有机化学研究所 2007年博士导师: 郭寅龙共129页

摘要 : 近年来，由于灵敏度、准确性和分析通量等都有了很大提高，质谱技术在生命科学研究领域占有日趋重要的地位，也已成为蛋白质组学研究的支撑技术之一。然而现有的方法和技术平台尚未成熟，随着研究的不断深入，人们必将面临更多的挑战。在本论文工作中... 展开近年来，由于灵敏度、准确性和分析通量等都有了很大提高，质谱技术在生命科学研究领域占有日趋重要的地位，也已成为蛋白质组学研究的支撑技术之一。然而现有的方法和技术平台尚未成熟，随着研究的不断深入，人们必将面临更多的挑战。在本论文工作中，笔者提出了一些新型的蛋白质组学质谱研究方法，在蛋白质鉴定和相对定量研究方面以及生物小分子分析方面都有所突破。首先，本文设计应用了一种新型蛋白修饰试剂，4,6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶(4,6-dimethoxy-2-(methylsulfonyl)pyrimidine，DMMSP)，同时，结合MALDI-TOF质谱检测技术能够对其化学修饰程度以及不同修饰程度蛋白的相对比例进行动态的跟踪和监测。此试剂应用于以溶菌酶的为代表的蛋白质化学修饰，由于嘧啶环的引入，增强了生物大分子在质谱中的响应，这对于蛋白质的鉴定以及进一步的分析和表征是十分有利的，也体现出高效、快速、灵敏的优势。另外，这种新型试剂性质温和，化学修饰过程不会导致溶菌酶活性的丧失，同时还可以提高其对胰蛋白酶水解作用的抵抗能力，稳定性增强。此修饰方法无论在提高蛋白质鉴定的可靠性还是延长其在体外的保存时间等方面都很有价值。然后，笔者进一步将此试剂发展成为一种全新类型的稳定同位素标记试剂([(d0]-或[d6]-DMMSP)，用于蛋白质的比较分析，对该试剂的性质、合成方法及其同位素标记策略等进行了比较全面的考察和方法学研究，使其能够满足差异蛋白质组学质谱研究时多方面的要求。通过对上述蛋白质化学修饰方法的改进，在这部分工作中实现了半胱氨酸的特异性标记，使研究目标更加明确，更具针对性，降低了质谱分析的复杂程度，同时标记后目标肽段信号的增强使蛋白质定性和相对定量研究具有更高的可信性。另外，分析过程都是通过MALDI-TOF质谱仪来完成的，省去预先的分离和纯化步骤，减少了样品的损失，也有利于获得更准确的相对定量结果。我们将DMMSP标记结合质谱分析初步应用于半胱氨酸、含半胱氨酸的多肽以及溶菌酶水解产物等体系中，相对定量的误差都在5％以内，充分显示了其简便、高效、灵敏及重复性好等特点，为实现快速、可靠的蛋白质定性与相对定量分析提供了新的选择。这种新型同位素标记方法有望用于复杂生物样本以及低丰度蛋白的研究。另外，在生物小分子分析方面，本文应用碳纳米管作为新型MALDI基质，对极性大、分子量小的20种常见氨基酸及其混合物进行了直接、快速的MALDI-FTMS研究。由于这种纳米材料在低质量区没有干扰测定的背景信号，也不会导致裂解碎片的产生，很适合用于传统基质难以检测的小分子物质的质谱分析。碳纳米管作为一种有效的基质，是与其独特的性质密切相关的：1)这种纳米材料具有很高的比表面积，能够有效的分散待测分子，可以防止分子簇集和减弱分子间的相互作用：2)具有较强的紫外吸收能力，同时能量还可以暂时留存在管中，大大提高了能量的传递效率。应用碳纳米管作为MALDI基质，不仅开辟了碳纳米管新的应用领域，相信在其它小分子物质的分析方面同样有很大的应用前景。最后，针对一些难子分析的低丰度和疏水性蛋白质，我们尝试发展一种新型季铵盐类蛋白修饰试剂，做了一些探索性的工作，目的是提高疏水蛋白的溶解度和低丰度蛋白的质谱信号，同时还可以用雷氏盐特异性沉淀法对季铵化修饰的产物进行分离富集。该试剂与半胱氨酸的反应获得成功，但在蛋白的修饰过程中遇到了困难，我们考虑将修饰剂的空间位阻减小，更换反应系统，以期获得较好的反应结果。收起

关键词 : 蛋白质组学蛋白质鉴定蛋白修饰试剂 4 6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶稳定同位素标记试剂碳纳米管质谱分析