摘要: 研究背景: Ras相关蛋白(Rab,Ras-relatedprotein)是小GTP酶Ras超家族中目前已知最大成员分支，主要参与细胞内膜类结构的转运、加工过程，如囊泡的出芽、形成、输运、融合以及膜结构形态的维持等。Rab家族的蛋白结构具有较高的相似性，均包含4个与... 展开 研究背景: Ras相关蛋白(Rab,Ras-relatedprotein)是小GTP酶Ras超家族中目前已知最大成员分支，主要参与细胞内膜类结构的转运、加工过程，如囊泡的出芽、形成、输运、融合以及膜结构形态的维持等。Rab家族的蛋白结构具有较高的相似性，均包含4个与GDP/GTP结合，并发挥GTP酶活性的结构域(switchⅠ到switchⅣ)以及位于C端的P结构域。在switchⅡ结构域中存在一段较为保守的序列，其中的丝氨酸、苏氨酸可以被帕金森病(Parkinson''sdisease,PD)相关蛋白激酶——富亮氨酸重复激酶2(Leucine-richrepeatkinase2,LRRK2)磷酸化修饰，从而引发神经元内囊泡转运、自噬、溶酶体功能和纤毛形成等细胞过程的障碍，参与到疾病发病机制当中。 在众多的Rab家族分子中，Rab10显得格外与众不同。首先，Rab蛋白一般具有较为固定的细胞内定位和相对单一的功能，但是Rab10几乎在细胞内所有的膜类细胞器上均有分布，功能十分复杂，可以参与调节内质网动力学、神经元轴突发育、纤毛形成及纤毛内转运、溶酶体管状化和胞外分泌及细胞自噬等多个过程;其次，Rab10在不同细胞、组织和发育阶段中发挥的作用不尽相同;此外，Rab10的磷酸化与多种神经退行性疾病密切相关。有研究报道，无论是在散发性PD还是家族性PD患者脑内，均可检测到LRRK2激酶活性及Rab10磷酸化水平的异常升高。而在阿尔茨海默病(Alzheimer''sdisease,AD)患者脑内同样可以检测到Rab10磷酸化水平显著增高，并且这些异常磷酸化的Rab10与AD特征性神经病理改变——tau蛋白过度磷酸化导致的神经纤维缠结,具有高度的共定位。此外，Rab10还是Rab家族中与LRRK2亲和力最高的激酶底物。 目前有已多项研究关注PD相关突变的LRRK2对Rab10异常磷酸化产生的效应。首先，LRRK2对Rab10的过度磷酸化会抑制细胞纤毛的发生，而促进纤毛的解聚。此外，LRRK2可以将Rab10、Rab8a和Rab35募集到发生应激的溶酶体上，并在此对它们进行磷酸化，从而促进溶酶体管状化和胞外分泌。当线粒体发生损伤时，Rab10可以在PINK1和PRKN的作用下，聚集到去极化的线粒体上，并招募自噬受体OPTN,促进线粒体自噬;而当LRRK2发生突变，激酶活性异常升高时，被磷酸化的Rab10无法再被募集到这些线粒体上，从而引发线粒体自噬障碍。但是，以上研究大多在LRRK2致病突变的体外细胞模型中展开，而Rab10磷酸化在体内，尤其是在脑内发挥的生理作用，仍亟待研究。 研究目的: 1.探讨Rab10Thr73位点磷酸化对小鼠行为学表型的影响; 2.探讨Rab10Thr73位点磷酸化影响的主要脑区和细胞类型; 3.探讨Rab10Thr73位点磷酸化对脑内神经元形态、功能的影响及其分子机制。 研究方法: 1.构建模拟Rab10持续非磷酸化和持续磷酸化状态的小鼠模型 利用CRISPR/Cas9技术，分别构建模拟Rab10持续非磷酸化状态和持续磷酸化状态的Rab10T73V和T73D突变小鼠模型,并利用DNA测序、免疫蛋白印迹(WesternBlot,WB)对Rab10的突变和表达水平进行了验证。 2.检测Rab10突变小鼠的行为学表型 对3月龄Rab10T73V/T73V小鼠和3月龄、5月龄、7月龄和9月龄Rab10T73D/+小鼠及同窝Rab10+/+小鼠进行一系列的行为学检测，包括:旷场试验、高架十字迷宫试验、明暗箱试验、Y迷宫试验、○迷宫试验、T迷宫试验、藏宝试验、筑巢试验、巴恩斯迷宫、加速旋转杆试验、悬尾试验、强迫游泳试验、条件性恐惧试验、代谢笼和新物体识别试验，用以检测小鼠自发活动度、焦虑样行为、重复性强迫样行为、学习记忆、抑郁样行为、运动协调能力和能量代谢等方面的表型。 3.检测Rab10突变小鼠突触结构和功能的改变 提取Rab10+/+及Rab10T3V/T73V小鼠纹状体、杏仁核、背侧海马、腹侧海马和前额叶皮层这5个与焦虑行为相关的脑区蛋白，WB检测VAMP1、VAMP2、Syntaxin1、SHANK2、Synaptophysin、PSD95等突触蛋白的表达水平，确定Rab10T73V突变影响的主要脑区。再对实验中确定的责任脑区——纹状体进行针对性检测:利用脑片膜片钳,记录中型棘突神经元(mediumspinyneuron,MSN)微小抑制性突触后电流(miniatureinhibitorypostsynapticcurrent,mIPSC)和微小兴奋性突触后电流(miniatureexcitatorypostsynapticcurrent,mEPSC),以检测突触功能;利用透射电镜观察突触密度、突触小泡的密度和直径、突触后致密斑的长度和宽度;对纹状体脑区进行抑制性突触前、后标志物GAD67和Gephyrin,兴奋性突触前、后标志物VGLUT1和PSD95的免疫荧光染色，分析抑制性突触和兴奋性突触的密度。 4.检测Rab10突变小鼠神经元和胶质细胞的密度 对3月龄实验小鼠进行尼氏染色，全景扫描小鼠皮层、背侧海马及纹状体脑区切片,计数这些脑区中神经元的密度。再对小鼠进行小胶质细胞标志物Iba1和星形胶质细胞标志物GFAP的免疫组化染色,统计纹状体脑区中小胶质细胞的密度和GFAP的表达情况。 5.检测Rab10突变小鼠的神经元分支及树突棘发育情况 对3月龄实验小鼠进行冠状位切片及高尔基染色，使用20倍镜沿z轴多层扫描小鼠纹状体、背侧海马、腹侧海马及杏仁核脑区的全景图像，计数、测量神经元树突分支数目及长度。再对小鼠进行树突标志物MAP2的实时荧光定量PCR和免疫荧光染色，分别检测MAP2mRNA和蛋白表达水平。此外，体外培养胚胎16.5天小鼠原代神经元,培养3天后，进行神经元轴突标志物neurofilament和树突标志物MAP2的免疫荧光染色,测量、统计神经元轴突和小神经突的数目及长度。随后使用63倍油镜，沿z轴拍摄高尔基染色切片，统计树突棘密度及各类树突棘的占比情况。 6.检测Rab10突变体的差异相互作用蛋白 使用天然细胞裂解液提取3月龄Rab10+/+及Rab10T73V/T73V小鼠纹状体脑区总蛋白，利用Rab10抗体将组织中的Rab10蛋白免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)下来，应用串联质谱标签(tandemmasstag,TMT)定量蛋白质组学，分析野生型Rab10和Rab10T73V突变体之间的差异相互作用蛋白，并对这些蛋白进行生物信息学分析，找到其中涉及的关键分子信号通路。 研究结果: 第一部分Rab10T73V突变对小鼠的影响 1.Rab10T73V突变小鼠表现出特征性的焦虑样行为改变 Rab10T73V/T73V小鼠较Rab10+/+小鼠，在旷场中央区活动的时间明显缩短。在高架十字迷宫和○迷宫中，Rab10T73V/T73V小鼠在开放臂或开放区域中活动的时间也呈现显著降低。在明暗箱试验中，Rab10T73V/T73V小鼠在明箱中活动的时间明显缩短，进入明箱的次数减少。此外，Rab10T73V/T73V小鼠在筑巢试验中撕碎的棉花相对较少，在藏宝试验中埋藏的玻璃珠数目也明显减少。而针对小鼠自发活动度、学习记忆、抑郁样行为、运动协调能力和能量代谢等方面的试验中，两组小鼠间未检测出显著差异。上述结果表明Rab10T73V突变导致小鼠出现了焦虑样行为改变及重复性强迫样行为的损害。 2.Rab10T73V突变小鼠纹状体脑区突触蛋白表达谱发生改变，抑制性突触信号传递障碍 在检测的5个与焦虑相关的脑区中，仅在纹状体脑区中检测到Rab10T73V/T73V小鼠突触蛋白表达的改变。其中，3个构成突触前SNARE复合物的蛋白VAMP1、VAMP2和Syntaxin1及突触后膜蛋白SHANK2在Rab10T73V/T73V小鼠纹状体脑区中表达升高。进一步检测Rab10T73V/T73V小鼠纹状体脑区MSN突触电生理功能，发现mIPSC的频率显著降低，但波幅未出现明显改变;而mEPSC的频率和波幅均未表现出明显差异。此外，免疫荧光染色和透射电镜结果显示，抑制性突触和兴奋性突触的密度、突触后致密斑长度和宽度、突触前囊泡的密度及直径在两组小鼠间未见显著差别。这些结果提示Rab10T73V突变损害了纹状体抑制性突触信号传导，但未对突触的结构产生显著影响。 3.Rab10T73V突变小鼠神经元密度、星形胶质细胞和小胶质细胞未出现明显改变 尼氏染色并未检测到Rab10T73V/T73V小鼠与Rab10+/+小鼠在皮层、海马和纹状体脑区中神经元密度的差异。同时，Iba1标记的小胶质细胞和GFAP标记的星形胶质细胞在两组小鼠同样未见明显差别。因此，Rab10T73V突变并不会对小鼠脑内神经元和胶质细胞的密度产生明显影响。 4.Rab10T73V突变小鼠纹状体脑区MSN树突分支增多 高尔基染色显示，Rab10T73V/T73V小鼠纹状体MSN树突分支增多，总树突长度增长,但平均树突长度并不受影响。而背侧海马、腹侧海马及杏仁核中神经元形态均未见明显改变。进一步研究发现，与Rab10+/+小鼠相比，Rab10T73V/T73V小鼠纹状体脑区树突标志物MAP2的mRNA和蛋白表达水平均出现显著升高。因此，Rab10T73V突变可以特异性地促进纹状体MSN树突的过度分支，引发神经元功能障碍。 5.Rab10T73V突变小鼠纹状体脑区MSN树突棘成熟度升高 针对Rab10+/+和Rab10T73V/T73V小鼠不同脑区神经元树突棘进行比较、分析发现，T73V突变并不会影响脑内神经元树突棘的密度。进一步对这些树突棘进行分类比较发现，Rab10T3V/T73V小鼠纹状体MSN中成熟树突棘（短粗型、蘑菇型和分叉型）增多，占比更高;而未成熟的树突棘（丝状伪足型、细长型和细型），尤其是细型树突棘的比例显著降低。而背侧海马、腹侧海马和杏仁核神经元的树突棘成熟度未受明显影响。因而,Rab10T73V突变可以特异性地促进纹状体MSN中树突棘过度成熟。 6.T73V突变改变了Rab10与细胞骨架组装相关的互作蛋白网 与野生型Rab10相比，共有89个蛋白与Rab10T73V突变体的结合发生改变，其中62个蛋白与Rab10T73V突变体亲和力升高，另有27个蛋白与之亲和力降低。GO富集分析发现，这些差异结合蛋白大多定位于细胞骨架、突触、树突棘等细胞组分，与神经丝束的组装、肌动蛋白丝加帽和组装、突触囊泡的内吞、轴突发育和神经元投射的形成等生物过程密切相关。以上信息提示Rab10T73V突变对神经元树突分支、树突棘和突触功能的影响，可能与神经元细胞骨架有关。 第二部分Rab10T73D突变对小鼠的影响 1.Rab10T73D纯合突变小鼠脑、肺和肾脏发育异常，出生时或出生后不久死亡大部分Rab10T73D/T73D小鼠在出生时或出生后1天内死亡，至断乳时，在获得的77只小鼠中仅发现1只Rab10T73D/T73D小鼠。此外，Rab10T73D/T73D新生鼠与Rab10T73D/+和Rab10+/+新生鼠相比，脑和肾脏重量明显降低，肺脏重量明显增加。HE染色发现，Rab10T73D/T73D新生鼠肺组织局部存在肺泡塌陷和肺不张，可能因此导致了新生鼠的死亡。 2.Rab10T73D杂合突变小鼠至9月龄未出现明显行为学改变 3月龄、5月龄、7月龄和9月龄Rab10TD/+小鼠在旷场试验、高架十字迷宫、Y迷宫、新物体识别试验和T迷宫中与Rab10+/+小鼠表现基本无异。因 收起