摘要: 目的： 脑损伤后，活性氧自由基增加，自由基蓄积过多，超过体内清除能力，直接攻击、损伤正常的神经元，或介导线粒体、炎性反应等途径间接导致细胞凋亡。近年研究发现，APOE基因多态性与脑损伤密切相关，不同的APOE基因型可以导致脑损伤后出现截... 展开 目的： 脑损伤后，活性氧自由基增加，自由基蓄积过多，超过体内清除能力，直接攻击、损伤正常的神经元，或介导线粒体、炎性反应等途径间接导致细胞凋亡。近年研究发现，APOE基因多态性与脑损伤密切相关，不同的APOE基因型可以导致脑损伤后出现截然相反的结局。APOE基因是如何影响脑损伤后氧化应激过程，从而影响病情转归的机制尚未阐明。本课题拟分析不同ApoE蛋白条件下，神经元氧化应激损伤后Ca2+超载的具体变化，寻找APOE各基因型影响Ca2+超载的途径，对比ApoE3、ApoE4蛋白对细胞内钙超载、CaMK II异常磷酸化、细胞骨架、细胞凋亡、线粒体损伤及凋亡相关蛋白表达等变化，细化Ca2+超载的调节机制。从而阐明不同 APOE基因亚型影响氧化应激脑损伤后的病情变化及其预后的分子机制。进而对遗传因素与脑损伤耐受性的关系作出更全面的评价，为脑损伤的治疗提供新思路。 方法： 1.离体培养APOE基因敲出鼠大脑皮层神经元，NSE和尼氏染色了解大脑皮层神经元培养情况。 2．建立氧化应激模型，LDH和SOD检测氧化应激建模情况。 3.给与不同ApoE蛋白，分析不同的ApoE条件下， (1)激光共聚焦检测、分析不同ApoE影响大脑皮层神经元Ca2+超载的情况。 (2)通过Western blot分析CaMK II磷酸化水平。 (3)通过Western blot分析各组Tau蛋白的磷酸化情况，了解不同ApoE对细胞骨架的影响机制。 (4)应用TUNEL检测各组神经元的凋亡情况，了解ApoE对神经元的凋亡的影响。 (5)通过检测线粒体膜电位，免疫组化、RT-PCR和Western blot检测各组神经元的p38MAPK、caspase-3表达变化，探讨ApoE影响神经元凋亡的机制。 (6)用RT-PCR和Western blot分析GluR1表达变化情况。 4.给与不同ApoE蛋白，并分别阻断相关Ca2+通道上游NMDAR和下游CaMK II信号，通过观测、计算机图像分析等方法，比较各组神经元的损失、凋亡情况，了解不同ApoE和阻断相关Ca2+通道上游NMDAR和下游CaMK II信号对神经元的作用。 5．给与不同ApoE蛋白，并阻断GluR1后观察CaMK II磷酸化水平和细胞凋亡情况。 6.给与不同ApoE蛋白后，阻断CaMK II磷酸化，观察Tau蛋白的磷酸化情况；p38MAPK表达；线粒体膜电位，caspase-3含量以及神经元凋亡的变化。 结果： 1.通过显微镜组织结构观察，NSE染色和尼氏染色证明神经元培养成功。 2．LDH和SOD检测证明神经元氧化应激模型构建成功。 3．与ApoE3相比，在ApoE4存在的条件下， （1）损伤后神经元存在Ca2+内流；但Ca2+内流不是瞬间达到高峰，24h左右才达到高峰。 （2）Ca2+内流继发CaMK II磷酸化异常突出。 （3）神经元Tau蛋白的磷酸化水平升高。 （4）神经元的凋亡明显增加。 （5）神经元线粒体膜电位明显升高；p38MAPK、caspase-3表达增加；caspase-3活性片段增加，并向细胞核转移。 （6）GluR1的mRNA和蛋白表达均明显增高。 4.给与ApoE4后，阻断Ca2+通路上游NMDAR，细胞内Ca2+浓度后期依然会升高，损伤后神经元凋亡仍明显；相比而言，阻断Ca2+下游通路CaMK II，缓解神经元凋亡的效果更好。 5.给与ApoE4后，阻断GluR1后，CaMK II磷酸化明显降低，细胞凋亡减少。 6.给与ApoE4后，抑制CaMK II磷酸化后，神经元的凋亡明显减少；其线粒体膜电位降低；p38MAPK、caspase-3表达减少；caspase-3活性片段减少；Tau蛋白的磷酸化水平也降低。 结论： 在氧化应激下，不同APOE亚型对大脑皮层神经元损伤耐受性不同，ApoE4有明显促神经元凋亡和损伤的作用。实验证明ApoE4分别通过NMDAR和GluR1等多途径引发神经细胞Ca2+超载，并继发CaMK II磷酸化异常，最终导致神经元凋亡和损伤。通过调控上述Ca2+信号途径的各个环节，可提高氧化应激脑损伤后大脑皮层神经元的再生修复水平，缓解脑损伤引起的神经元凋亡，这有可能影响脑损伤疾病的预后。 收起