摘要: 生殖干细胞（Germlinestemcell,以下简称GSC）具有自我更新能力和向生殖细胞分化的能力，在维持自身数量的同时，不断产生分化的生殖细胞，对于维持种群繁衍与稳定具有决定性意义，是“生命之母”。本文以黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）作为工具，... 展开 生殖干细胞（Germlinestemcell,以下简称GSC）具有自我更新能力和向生殖细胞分化的能力，在维持自身数量的同时，不断产生分化的生殖细胞，对于维持种群繁衍与稳定具有决定性意义，是“生命之母”。本文以黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）作为工具，研究比较了印楝素、喜树碱等10种植物源杀虫活性化合物对果蝇雌性生殖干细胞（femaleGSC）分化的影响，通过单细胞测序、免疫荧光、原位杂交、RNAi、过表达等技术方法，基本阐明了印楝素和喜树碱对昆虫GSC维持和分化的调控机制。主要结果如下： 1、研究比较了10种代表性植物源化合物对果蝇GSC维持、分化与生殖力的影响。在供试10种化合物中，明确印楝素和喜树碱能够以不同方式显著影响果蝇GSC的维持与分化，印楝素能够减少GSC数目，喜树碱能减少GSC数目、增加CB数目。活性测定表明，印楝素处理可抑制果蝇生殖能力。利用毛细管法和亮蓝法测定表明，饥饿果蝇对印楝素50mg/L和100mg/L无明显拒食作用。印楝素处理对卵巢保幼激素和胰岛素滴度无显著影响，但显著上调卵巢中蜕皮激素滴度。印楝素处理导致卵巢中护卫细胞数目减少，不影响其他微环境（niche）相关通路。印楝素100mg/L处理能显著诱导果蝇卵巢中GSC和其他生殖细胞发生细胞凋亡。 2、深入研究了印楝素诱导果蝇GSC细胞凋亡的调控机制。印楝素50mg/L处理后，果蝇通过miR-bantam下调生殖细胞hid的表达，但不抑制GSC凋亡产生，却导致GSC严重丢失；相反hid高表达能够援救（rescue）印楝素50~100mg/L处理引起的GSC丢失。细胞凋亡基因rpr过表达同样也能援救印楝素处理导致的GSC丢失。利用p35过表达不能援救印楝素引起的GSC数目减少。通过DIAP1过表达抑制护卫细胞凋亡，能够暂缓卵原区GSC丢失。护卫细胞通过p35过表达抑制凋亡，对GSC丢失无显著影响。 3、运用单细胞测序技术研究印楝素影响果蝇GSC自我更新的调控机制。制作果蝇成虫卵巢单细胞悬液，运用10XGenomics技术进行单细胞分离测序，通过已知的细胞标记基因分选出生殖细胞群Cluster14，并对生殖细胞群上调基因进行GO分析和KEGG分析，明确不同细胞类型的功能。对生殖细胞群进行拟时分析，结果表明Cluster0位于分化发育的起点，为未分化细胞群，随后分化能够形成2个分支，其中一个分支为Cluster2，可能为生殖干细胞分化成后期生殖细胞的过渡细胞，另一个分支为滋养细胞和卵母细胞。利用vasa、myc、bam和nanos在未分化细胞群Cluster0中分选出29个GSC，其中野生型GSC有23个，印楝素处理的GSC有6个。将29个GSC与其余Cluster0中未分化细胞进行差异分析，其中40个基因上调，1个基因下调；将29个GSC与其余Cluster14中的生殖细胞进行差异分析，其中936个基因上调，76个基因下调；合并分析后发现33个GSC中高表达基因，可作为新的GSC标记基因。对印楝素处理的6个GSC与对照23个GSC进行差异性分析，结果表明印楝素处理后会导致GSC中128个基因上调，32个基因下调。对其中候选9个基因进行基因功能的验证，结果表明其中6个基因对GSC维持和分化具有相关性，这6个基因处于4个不同调控网络，表明印楝素可在不同层次对GSC产生影响。 4、系统研究了喜树碱对果蝇GSC维持与分化的调控机制。活性测定表明，喜树碱处理果蝇能显著抑制生殖能力，急性致死作用、拒食作用不明显。喜树碱处理后，导致卵巢护卫细胞异位以及滤泡细胞减少，不影响微环境中其他信号的表达。喜树碱处理后包囊母细胞和2-cells细胞周期停滞在G1/S和S期，bam下调导致2-cells的数目显著增加，bam回补能够援救停滞的细胞周期，使其向后分化。喜树碱能够通过topI导致GSC数目降低，在topI被干扰后，卵巢出现异常形态，且出现异常形态的卵巢在干扰组中比喜树碱处理的更多。综合比较喜树碱与印楝素对GSC分化的调控机制可知，植物源化合物对GSC分化的影响既有共性也有个性特征，这可能与其结构类型和作用靶点的差异有关。 本论文将天然源农药作用机制、昆虫毒理学与果蝇遗传实验技术相结合，通过系统研究印楝素、喜树碱等对昆虫GSC分化的调控机制，深入探讨了代表性植物源农药对果蝇GSC命运影响，发现了印楝素和喜树碱调控昆虫生殖的新机理。本论文结果在理论上有助于丰富植物保护、尤其是生物农药毒理学研究内容，推动农业昆虫干细胞的研究，为害虫防治提供新思路，为创制新农药等提供理论基础。 收起