摘要: 本文系统研究了印楝素(azadirachtin，AZA)、喜树碱(camptothecin，CPT)对Sf9细胞诱导凋亡作用。倒置相差显微镜动态观察结果表明Sf9细胞分别经AZA和CPT处理均出现细胞皱缩、核偏移、胞质空泡和大量凋亡小体的典型细胞凋亡形态特征，而20-羟基蜕皮酮(... 展开 本文系统研究了印楝素(azadirachtin，AZA)、喜树碱(camptothecin，CPT)对Sf9细胞诱导凋亡作用。倒置相差显微镜动态观察结果表明Sf9细胞分别经AZA和CPT处理均出现细胞皱缩、核偏移、胞质空泡和大量凋亡小体的典型细胞凋亡形态特征，而20-羟基蜕皮酮(20-E)、毒死蜱、灭多威和氯氰菊酯在供试浓度和时间条件下细胞均正常生长增殖。形态特征变化和DNA电泳结果表明在供试浓度和时间条件下，AZA和CPT可诱导Sf9细胞凋亡，20-E、毒死蜱、灭多威和氯氰菊酯则没有诱导细胞凋亡。倒置相差和荧光显微镜观察以及DNA电泳结果表明，AZA和CPT诱导Sf9细胞呈现凋亡典型形态特征和DNA片段化，与细胞坏死具有明显区别。 AZA和CPT诱导Sf9细胞凋亡在倒置相差和荧光显微镜下具有相似形态特征，凋亡中期和晚期细胞超微结构形态特征具有明显差异，DNA电泳结果表明一定时间范围内两者的DNA片段化条带深浅程度与诱导时间呈正相关。通过倒置相差显微镜观察形态特征变化表明1.5μg/mLAZA诱导Sf9细胞0～30h属凋亡早期，30～48h为凋亡中期，48h后为凋亡晚期，其中39h是典型形态特征最佳观察时间。0.35μg/mLCPT处理0～6h属凋亡早期，6～18h为凋亡中期，18h后为凋亡晚期，其中15h是典型形态特征最佳观察时间。通过荧光显微镜观察凋亡中期AZA处理39h和CPT处理15h吖啶橙染色凋亡细胞均呈现零散或聚集点状明亮黄绿色荧光，Hoechest33258染色呈现点状亮蓝色荧光。而在凋亡晚期AZA处理72h和CPT处理36h吖啶橙染色凋亡细胞分别呈现高亮均匀绿色荧光和零散点状黄绿色荧光，Hoechest33258染色均呈现个别点状亮蓝色荧光。利用透射电子显微镜观察AZA和CPT处理Sf9细胞超微结构可见染色质边集和微绒毛消失等相同典型细胞凋亡形态特征。同时，AZA使核膜界限模糊和线粒体嵴结构消失，而CPT使核膜结构全部成段断裂，线粒体数量明显减少，吞噬泡数量明显增加，由此表明1.5μg/mLAZA和0.35μg/mLCPT诱导Sf9细胞凋亡具有相似的倒置相差和荧光显微镜形态特征，但两者凋亡中期和晚期细胞超微结构形态特征具有明显差异。DNA电泳结果表明AZA处理24～42h和CPT处理0～9hDNA片段化条带深浅程度与诱导时间呈正相关，AZA处理42h、45h、48h和CPT处理9h、12h、15h、18hDNA片段化条带清晰且各处理之间无明显差异。 利用流式细胞仪研究分析AZA和CPT诱导Sf9细胞凋亡的结果表明，两种植物源杀虫剂对线粒体通透性转换孔(MTP)、线粒体膜电位(△ψ)、胞质Ca2+浓度、胞质中性脂滴(LDs)和凋亡率具有显著影响。AZA处理1h内MTP迅速开放，18h达到最大值且是对照的1.84倍，随后MTP开放数量显著减小，而CPT处理0～18hMTP数量不断增大且持续开放。AZA处理1h内△ψ迅速降低，24h达最小值且其荧光强度是对照的3.91倍，24～36h逐渐升高。CPT处理1h内△ψ迅速降低，12h达最小值其荧光强度是对照的2.63倍，12～18h逐渐升高。AZA处理0～18h胞质Ca2+浓度逐渐增大，18h达最大值且是对照的4.86倍，随后减小。CPT处理0～3h胞质Ca2+浓度逐渐增大，3h达最大值且是对照的2.19倍，随后立即减小，9～18h结果小于对照并呈继续减小趋势。AZA处理0～1h胞质中性LDs迅速增大，1h达最大值且是对照的1.39倍，随后减小。CPT处理0～18h胞质中性LDs缓慢增大，18h达最大值且是对照的1.22倍，18～24h立即减小且24h后小于对照结果。在对凋亡率的研究中，1.5μg/mLAZA处理0h～24h凋亡率不断增加，24h达最大值33.32％，是对照的10.51倍，24h和36h结果差异不显著，36～60h逐渐减小。6μg/mL和10.5μg/mLAZA诱导Sf9细胞凋亡率最大值出现时间比1.5μg/mLAZA处理提前12h，结果表明在供试条件下AZA浓度影响凋亡率最大值出现的时间。0.35μg/mLCPT处理0～12h凋亡率不断增加，12h达最大值39.67％，是对照的13.13倍，12～18h逐渐减小。在对0.35μg/mL、1.4μg/mL和2.45μg/mLCPT诱导Sf9细胞凋亡率的研究中，凋亡率均在处理12h达最大值，分别为40.19％、51.76％和55.46％，是对照的11.72倍、15.09倍和16.17倍，结果表明供试条件下相同处理时间CPT浓度与凋亡率呈正相关。AZA和CPT显著影响Sf9细胞中Sfcaspase-1表达，并且两者诱导Sf9细胞凋亡机制不同。Sf9细胞自身存在Sfcaspase-1低水平表达，AZA和CPT均能诱导Sfcaspase-1大量表达。1.5μg/mLAZA诱导后使Sfcaspase-1表达量在凋亡早期逐渐增大，30h表达量达最大值并是0h结果的5.99倍，凋亡中期和晚期逐渐减小。0.35μg/mLCPT诱导后使Sfcaspase-1表达量在凋亡中期迅速增大，12～15h减小，凋亡晚期再次增大，24h达最大值并是0h结果的7.68倍，随后减小。CPT抑制Sf9细胞TopoⅠ解旋负超螺旋pBR322，在供试浓度范围内抑制程度与CPT浓度呈正相关，0.35μg/mLCPT即可有效抑制TopoⅠ活性，而0.15～90μg/mLAZA均不能抑制Sf9细胞TopoⅠ解旋活性，由此表明AZA和CPT对Sf9细胞具有不同诱导凋亡机制。 收起