摘要: 本文结合细胞生物学、分子生物学、生物化学等理论和技术手段，系统研究了印楝素(azadirachtin，AZA)和喜树碱(camptothecin，CPT)对草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf-9细胞系的凋亡诱导作用，并通过流式细胞术、形态学观察、蛋白免疫印迹(Wester... 展开 本文结合细胞生物学、分子生物学、生物化学等理论和技术手段，系统研究了印楝素(azadirachtin，AZA)和喜树碱(camptothecin，CPT)对草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf-9细胞系的凋亡诱导作用，并通过流式细胞术、形态学观察、蛋白免疫印迹(Western blot)等方法探讨了AZA、CPT对Sf-9细胞生理环境、信号转导通路等方面的影响，阐明了AZA和CPT诱导Sf-9细胞凋亡的信号转导作用。 1.通过对8种供试植物源杀虫成分诱导Sf-9细胞凋亡形态学观察结果表明，AZA和CPT各供试浓度诱导Sf-9细胞后均呈现细胞皱缩、细胞核偏移、产生大量凋亡小体等典型细胞凋亡形态学特征，而博落回、丹皮酚等6种植物源杀虫成分随处理浓度提高，表现出细胞飘浮，细胞膜破损等坏死现象；生物化学凝胶电泳检测结果表明，AZA和CPT处理组呈现出明显的DNA片段化条带，说明AZA和CPT对Sf-9细胞具有凋亡诱导作用。 2.在确定AZA、CPT具有诱导Sf-9细胞凋亡作用的基础上，从线粒体反应、细胞内外Ca2+平衡、胞内重要酶活力变化三个方面对AZA、CPT诱导Sf-9细胞凋亡的作用靶标进行了探讨，结果表明： ①AZA、CPT诱导Sf-9细胞凋亡后引起线粒体总功能降低和胞内活性氧(ROS)水平升高。0.75μg/mL AZA和1μM CPT处理诱导Sf-9细胞后分别在6 h、4h开始出现线粒体总功能显著降低。对胞内ROS水平检测表明，AZA诱导Sf-9细胞后12 hROS水平达到最高峰；CPT处理组在1～4 h ROS水平逐渐升高，并在4 h达到最大值，随后降低。Westorn blot结果显示，AZA和CPT诱导Sf-9细胞凋亡后，存在于线粒体膜上的细胞色素C(Cyt-c)从线粒体向细胞质转位，同时胞内Caspase．3、-9表达被激活，在细胞中表达量显著增加。这些结果说明，线粒体是AZA、CPT诱导Sf-9细胞凋亡的作用标靶之一。 ②对胞内Ca2+水平分析结果表明，AZA和CPT诱导Sf-9细胞凋亡过程中细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)显著升高，而抑制胞外Ca2+内流可在一定程度上显著降低AZA和CPT诱导的Sf-9细胞[Ca2+]i水平，表明此凋亡诱导过程中[Ca2+]i升高是由胞外Ca2+内流和胞内Ca2+库释放共同作用引起。此结果提示Ca2+是AZA、CPT诱导Sf-9细胞凋亡的另一作用靶标。倒置相差显微镜和荧光显微镜观察显示，抑制胞外Ca2+内流和[Ca2+]i升高，可减少凋亡小体数量及细胞核的浓集程度；流式细胞术结果表明，Ca2+浓度变化参与AZA和CPT诱导的Sf-9细胞凋亡，抑制胞外Ca2+内流及鳌合胞内Ca2+均能引起AZA、CPT诱导的Sf-9细胞凋亡率降低和凋亡高峰期的延迟。 ③对胞内酶活力水平测定结果表明，AZA、CPT诱导Sf-9细胞凋亡后，调节胞内外Ca2+浓度平衡的Ca2+-Mg2+-ATPase、Na+-K+-ATPase活性降低，而由Ca2+激活的NOS活性显著升高，同时总ATPase活性受到抑制。 3.对AZA和CPT诱导Sf-9细胞凋亡中线粒体信号转导通路研究表明，抑制线粒体通透性转换孔道(MPTP)开放后，由凋亡导致的线粒体总功能破坏得到明显恢复、胞内ROS水平降低、线粒体膜电位(△Ψm)紊乱受到显著抑制；Westam blot检测结果表明，MPTP开放受到抑制后Cyt-c从线粒体向胞质中的释放量减少，Caspase-3、-9的活性降低，同时凋亡率显著下降。说明AZA和CPT诱导Sf-9细胞凋亡中存在线粒体信号转导通路，且MPTP开放在线粒体通路中起重要作用。 4.通过对AZA和CPT诱导Sf-9细胞凋亡中，Ca2+稳态失衡对线粒体信号转导通路影响的研究结果表明，胞外Ca2+内流与[Ca2+]i升高均参与MPTP开放、△Ψm紊乱，同时抑制[Ca2+]i升高可明显降低AZA、CPT诱导的Sf-9细胞ROS水平，胞外Ca2+内流仅对AZA诱导组ROS水平影响显著，而对CPT诱导组ROS水平无显著影响；Western blot检测结果显示，[Ca2+]i升高参与凋亡信号分子Cyt-c释放和Caspase激活，表现为抑制[Ca2+]i升高可显著降低线粒体Cyt-c的释放、同时抑制Caspase-3、-9表达。这些结果说明在AZA和CPT诱导的Sf-9细胞凋亡中，Ca2+作为细胞内重要的第二信使，与线粒体信号转导通路之间存在相互作用。 本论文通过对AZA和CPT诱导的Sf-9细胞凋亡信号转导通路研究，从全新的角度揭示了AZA和CPT对农业昆虫的作用机制，对研究植物源杀虫剂的作用靶标具有重要的指导意义，同时为新型杀虫剂的开发、先导化合物的寻找等提供了新思路，对于创制具有自主知识产权的昆虫细胞凋亡诱导剂，丰富细胞信号转导、昆虫毒理学等研究领域具有重要的理论和实践意义。 收起