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[学位论文] 马立阳中国科学院大学 2017年博士导师: 王雁玲共230页

摘要 : 妊娠过程中，母胎界面微环境中存在大量的免疫细胞，与子宫蜕膜、滋养层细胞、子宫血管等发生复杂的互作，建立免疫豁免并维持妊娠。妊娠早期，蜕膜自然杀伤细胞(dNK)占母胎界面淋巴细胞总数的70％左右;与外周血NK细胞不同，dNK细胞标记为CD56brightC... 展开妊娠过程中，母胎界面微环境中存在大量的免疫细胞，与子宫蜕膜、滋养层细胞、子宫血管等发生复杂的互作，建立免疫豁免并维持妊娠。妊娠早期，蜕膜自然杀伤细胞(dNK)占母胎界面淋巴细胞总数的70％左右;与外周血NK细胞不同，dNK细胞标记为CD56brightCD16-CD3-，其细胞杀伤性减弱，而细胞分泌功能却很强大。已有研究显示dNK细胞能够通过产生细胞因子和趋化因子诱导滋养层细胞的迁移和分化，还可通过其表面KIR受体与滋养层细胞的HLA配体相互识别，抑制免疫排斥反应。dNK细胞功能异常与复发性流产、子痫前期等多种妊娠疾病的发生发展密切相关。有关人dNK细胞功能的认识大都来源于临床样本分析和体外模型的研究，难以模拟母胎界面上多细胞互作的复杂微环境;而小鼠和人子宫蜕膜NK细胞的分子标记、分布特性等差异较大，小鼠研究得到的结果仍然难以帮助我们精确地认识人类dNK细胞的功能。基于此，本研究借助比较正常妊娠和复发性流产情况下蜕膜NK细胞(dNK)功能差异，并构建人源化dNK小鼠模型，深入探讨dNK在胎盘发育和早期妊娠维持中的作用机制。分别从妊娠6-10周非病理因素人工流产(NOR)和复发性流产(RSA)患者的子宫蜕膜组织中分离纯化CD56+CD16-CD3-CD9+标记的dNK细胞，发现RSA-dNK细胞中杀伤性分子TNF-α、IFN-γ、CD107a阳性细胞的比例增加，特异性杀伤靶细胞K562能力增强;RNA-seq筛选到RSA-dNK细胞差异表达的376个基因、139个已知LncRNA和5个未知LncRNA;炎症细胞因子抗体芯片筛查结果表明RSA-dNK细胞中多种炎性因子的合成与NOR-dNK细胞有显著差异。在CBA/J X DBA/2J自发流产小鼠模型中，未吸收胚胎表现为明显的胎儿生长受限，蜕膜NK细胞数量减少，分布异常;胎盘滋养层细胞侵润相对浅表，迷路层胎儿血管发育不完善，母体血流灌注减少。人类复发性流产和小鼠自发流产模型的结果表明子宫NK细胞功能异常与胎儿朋台盘发育受损有密切关联。我们将人dNK细胞于妊娠早期(E6.5)过继回输到免疫缺陷NOG孕鼠中，流式细胞术检测证明dNK细胞能够归巢富集到小鼠子宫和蜕膜中;与不回输细胞的对照组（PBS组）相比，正常妊娠dNK细胞回输(NOR组)可使NOG小鼠的流产率从14.89％降至0％，而复发性流产dNK细胞回输（RSA组）NOG小鼠，流产率增高至26.89％。由此建立了功能性dNK的人源化NOG小鼠模型。对该模型中未吸收胚的胎盘结构分析显示，与PBS组相比，NOR组胎盘中滋养层细胞向蜕膜侵润迁移能力增强，侵润相关基因(prl3b1，prl3d1，prl2c2等)表达水平上升;胎盘迷路层胎儿血管分支完善，胎儿血管面积和母体血窦面积均显著增大，合体化相关分子（Syna，mct1, mct4等）表达增强;而复发性流产dNK细胞的过继回输则阻碍了NOG小鼠胎盘发育，表现为滋养层细胞侵润能力下降，迷路层胎儿血管分支不完善，胎儿血管和母体血窦面积减小，侵润和合体化相关基因表达异常等。进而利用小鼠滋养层干细胞(mTS)体外诱导分化模型，证明正常妊娠dNK细胞条件培养基能够有效地促进mTS细胞向侵润方向和合体化方向分化，而复发性流产dNK细胞对mTS分化的作用则显著削弱。进一步地，我们鉴定到一个新的dNK细胞亚群，即CD3-CD56+CD16-CD9+CXCR4+（简称CD56+CXCR4+）dNK细胞，功能分析证明CD56+CXCR4+细胞较CD56+CXCR4-细胞有更强的细胞因子分泌能力和更低的细胞杀伤活性。在复发性流产蜕膜组织中CD56+CXCR4+dNK细胞的比例明显的降低。当我们将正常蜕膜来源的CD56+CXCR4+dNK细胞添加到复发性流产蜕膜dNK细胞中，使之比例从10％增加到正常情况下的30％，然后将其回输到NOG孕鼠中，发现复发性流产dNK细胞导致的NOG小鼠的高流产率得到显著降低，胎盘滋养层细胞分化和胎儿发育状况得到明显改善。由此证明CD56+CXCR4+dNK细胞是一群有利于妊娠维持的dNK细胞。综上所述，本研究结合人类复发性流产蜕膜组织、dNK细胞体外培养模型、NOG免疫缺陷小鼠模型、mTS体外分化模型等，证明母胎界面微环境可影响dNK细胞的基因表达和功能，而dNK细胞可参与调节滋养层细胞向不同途径的分化，影响胎盘发育和胎儿生长。鉴定到新的CD56+CXCR4+dNK细胞，证明这群细胞是促进滋养层细胞分化、维持妊娠的重要dNK亚群。本研究的结果为深入阐释dNK细胞在早期妊娠维持中的作用提供了新的思路，并为发展复发性流产的新型干预策略提供了科学证据。收起

关键词 : 复发性流产蜕膜自然杀伤性细胞功能差异胎盘发育早期妊娠维持

2. 炎性因素和类固醇激素失衡危害妊娠结局及子代健康的机制

[学位论文] 刘艳蕾中国科学院大学 2018年博士导师: 王雁玲共201页

摘要 : 正常妊娠过程中，胎盘对于保障胎儿生长发育和母亲健康发挥重要作用。胎盘滋养层细胞通过改建子宫螺旋动脉，确保母胎界面血流灌注;胎盘可分泌多种激素和因子，保证母胎界面免疫豁免环境的建立，并调节母体多个脏器和系统发生生理性变化，即妊娠适应性... 展开正常妊娠过程中，胎盘对于保障胎儿生长发育和母亲健康发挥重要作用。胎盘滋养层细胞通过改建子宫螺旋动脉，确保母胎界面血流灌注;胎盘可分泌多种激素和因子，保证母胎界面免疫豁免环境的建立，并调节母体多个脏器和系统发生生理性变化，即妊娠适应性;此外，越来越多的证据显示，以胎盘为主体的宫内环境对子代远期健康具有重要影响。胎盘发育或功能异常与子痫前期等妊娠疾病直接关联。子痫前期是妊娠期间发生的多系统综合征，临床表现为妊娠20周以后突发高血压并伴随蛋白尿或母体多脏器损伤，严重威胁母儿健康。已有证据显示子痫前期母胎界面上的病理改变主要表现为滋养层细胞功能异常、免疫耐受环境受损、胎盘血流灌注不足等，而患者呈现异常的超凝血状态。深入研究这些病理改变之间的分子关联是阐明疾病发病机制的重要策略。本实验室前期的研究发现，子痫前期患者外周血促凝因子SerpinF2水平较正常妊娠显著升高，体外转录分析揭示雄激素和炎性因子TNFα可分别正向调节肾脏和肝脏中SerpinF2表达。基于此，我们假设胎盘源性的炎性因子和类固醇激素可能通过影响母体肝、肾凝血因子的表达而调节母体凝血-纤溶系统的妊娠适应性变化，进而影响妊娠结局和子代健康。为验证这一假说，本工作构建了孕期慢性炎症和高雄激素的小鼠模型，探讨母体凝血状况、母胎界面血流灌注、妊娠结局及子代的远期健康。 CD1孕鼠随机分为LPS组和对照组，从E7.5至E17.5每日腹腔注射LPS或者等体积生理盐水;孕期每日上午以尾套法检测小鼠血压，并于不同时间点采集血样和尿样，E13.5或E18.5处死小鼠并收集肝脏、肾脏、胎盘等标本。研究结果显示，孕期10μg/kg LPS处理可使小鼠外周血中TNFα水平显著升高;相比于对照组，LPS组孕鼠于E8.5开始表现为血压升高并持续至分娩，孕晚期出现蛋白尿，脐带血流显著降低，胎儿表现为生长受限(FGR)，这些都是典型的子痫前期表征。实时定量PCR和Western blotting结果显示，LPS组母鼠肝脏和胎盘组织中SerpinF2的表达显著高于对照组;ELISA结果显示，外周循环中PAP（Plasmin-α2-antiplasmin复合物）水平从孕中期开始显著高于对照组，并持续至孕晚期;母鼠肝脏、肾脏和胎盘组织中呈现明显的纤维蛋白沉积;子宫动脉搏动指数显著减小，胎盘迷路层胎儿血管面积显著减小，表明胎盘血流灌注受阻、胎儿血管发育不完善。这些结果表明，妊娠期间促炎因子可通过增强促凝因子表达破坏凝血-纤溶平衡，导致母体出现超高凝状态，干扰胎盘/胎儿发育。这从母体凝血系统的妊娠适应性角度为阐释子痫前期的病理提供了新见解。为探讨宫内不良环境对于子代远期健康的编程效应，我们对孕期LPS处理和对照组小鼠的雌性子一代（F1-LPS和F1-CTRL）进行了血压、生育能力、胰岛素敏感性和脂代谢等方面的长期监测。结果显示，正常饲喂条件下，F1-LPS可以健康存活，生育能力未见异常。进而对F1-LPS和F1-CTRL进行高脂饲喂刺激，即从出生后6周起对F1仔鼠随机分组，分别以45％高脂饲料和正常饲料饲喂8-10周（LPS-HFD、CTRL-HFD、LPS-CD和CTRL-CD组）。结果显示，与正常饲喂相比，高脂饲喂刺激可导致小鼠血糖升高、胰岛素敏感性降低，但LPS-HFD组和CTRL-HFD组之间并未见明显差异。有趣的是，与CTRL-HFD组小鼠相比，LPS-HFD组小鼠发生肥胖的现象更加明显，其肝脏中脂滴沉积显著增多。为探讨肝脏脂肪代谢异常的宫内编程机制，我们对E18.5胎鼠肝脏中脂肪酸转运载体进行检测，并未发现异常表达，而LPS组胎鼠肝脏中Dnmt3a表达的显著下降，促使我们进一步对胎肝DNA甲基化谱进行了测序分析。这部分研究结果提示，孕期遭遇炎性环境的雌性胎儿可能发生脂肪代谢的表观遗传编程，出生后受到高脂饮食刺激时会发生更加显著的脂肪代谢异常。我们同时构建了孕期高雄激素的小鼠模型，从E6.5至E17.5每日皮下注射1-4mg/kg丙酸睾酮(Testosterone Propionate，TP)或等体积医用蓖麻油，对出生雌性子一代（F1-TP和F1-Oil）进行了血压、生育能力、胰岛素敏感性等方面的长期监测。结果显示，孕期TP处理使子代小鼠的生育能力受到严重影响，当TP剂量≥2mg/kg时，所有F1-TP鼠的阴腔均闭合，导致完全不育;当TP剂量降至1mg/kg时，约33％F1-TP鼠的阴腔闭合，而43％F1-TP鼠的阴腔张开时间较F1-Oil组明显推迟。TP剂量与F1仔鼠的肛门-生殖器距离(Anogenital Distance，AGD)呈现明显的正相关性。可见孕期过度高雄可导致雌性子代发生生殖道畸形。后续拟深入研究1mg/kg TP剂量下雌性子代的远期健康情况。最后，我们对子痫前期胎盘中雌、雄激素合成失衡的机制进行了探索。与正常妊娠对照相比，子痫前期胎盘组织中雄激素合成酶17β-HSD3异常高表达，而雌激素合成酶芳香化酶却显著低表达，同时miR-22呈现明显上调。以人胎盘滋养层细胞系JEG-3为模型，发现ERα，而非芳香化酶，是miR-22的直接靶基因;睾酮可通过上调miR-22表达来抑制ERα，削弱了E2/ERα信号对芳香化酶的促进作用，从而抑制雌二醇的合成。这一结果揭示了人类胎盘滋养层细胞中雌、雄激素合成的平衡机制，而miR-22可能介导了子痫前期胎盘中激素合成的失衡。综上所述，本研究针对子痫前期患者中观察到的炎症反应、高雄激素、超凝血等异常，构建了孕期LPS小鼠模型和TP小鼠模型，明确了孕期炎症和高凝表型之间的关联;并就宫内不良环境对雌性子代的远期健康进行了初步探究。为深入探索子痫前期的干预策略奠定了基础。收起

关键词 : 子痫前期炎症反应类固醇激素病理改变妊娠结局子代健康分子机制

3. 小鼠妊娠期子宫内膜基质细胞亚群的空间分布与功能研究

[学位论文] 鲍海丽中国科学院大学 2021年博士导师: 王雁玲共165页

摘要 : 人类每个月经周期，子宫内膜在雌、孕激素的精确调控下发生蜕膜化、脱落、修复与再生。小鼠虽然没有月经周期，但在妊娠期间，子宫内膜也会经历类似的动态变化。小鼠胚胎植入之后，围绕胚胎的子宫内膜基质细胞大量增殖、分化，转化为多倍体的蜕膜细胞... 展开人类每个月经周期，子宫内膜在雌、孕激素的精确调控下发生蜕膜化、脱落、修复与再生。小鼠虽然没有月经周期，但在妊娠期间，子宫内膜也会经历类似的动态变化。小鼠胚胎植入之后，围绕胚胎的子宫内膜基质细胞大量增殖、分化，转化为多倍体的蜕膜细胞，在胎盘形成之前为胚胎的发育提供支持和保护;妊娠中期，终末分化的蜕膜细胞逐渐退化，为快速生长的胚胎腾出空间;分娩之后，剩余的基质细胞再生出新的子宫内膜。由此可见，妊娠期的小鼠是研究人类子宫内膜周期性动态变化的良好的动物模型。基质细胞在子宫内膜动态性中扮演了核心的角色。由于小鼠子宫内膜基质细胞的蜕膜分化、退化是不同步的，因此蜕膜组织中存在处于不同分化阶段的基质细胞亚群。近年来，随着单细胞转录组测序和空间转录组测序技术的飞速发展，我们对包括子宫在内的许多器官、组织的细胞异质性有了新的认识。然而，目前仍缺少对小鼠妊娠期子宫内膜基质细胞亚群的空间分布、分化轨迹、功能及命运的系统性研究。我们首先通过组织形态学检测和细胞染色体倍数分析，发现小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化在妊娠第八天达到顶峰，此时蜕膜组织包含处于各个分化阶段的基质细胞，随后蜕膜在妊娠第十天明显退化，这时蜕膜组织中存在大量退化中的蜕膜细胞。于是我们分离了妊娠第八天和第十天的蜕膜组织，去除免疫细胞之后，进行了高通量单细胞转录组测序。细胞分群结果显示，蜕膜中存在基质细胞、血管内皮细胞、滋养层细胞、上皮细胞和周细胞，其中基质细胞又可分为四个亚群。我们选取了每个基质细胞亚群特异性高表达的标志分子，利用原位杂交方法对其空间分布进行了检测，发现四个基质细胞亚群沿胚胎一子宫肌层轴呈三层分布，包括两层围绕胚胎的内层、外层蜕膜细胞和一层紧贴肌层的基底层成纤维细胞。这种分层现象在人工诱导蜕膜化小鼠模型中依然存在，提示基质细胞亚群的空间分布并不受胚源信号的调控。空间转录组测序进一步证实了单细胞转录组测序和原位杂交的结果。接下来，我们利用拟时分析预测了基质细胞亚群的衍化轨迹，发现越靠近胚胎，基质细胞的分化程度越高。围绕胚胎的内层蜕膜细胞是一类终末分化的细胞，表达催乳素分子PRL8A2，能够促进体外培养的黄体细胞分泌孕酮。实验室之前的研究发现，子宫特异性敲除Notch2的小鼠虽然生育力没有受到影响，但蜕膜PRL8A2表达明显下调。考虑到垂体催乳素在黄体维持中的主导作用，我们在Notch2子宫条件敲除小鼠模型中，利用LPS刺激造成垂体催乳素抵抗、催乳素受体PRLR-Fc融合蛋白封闭垂体催乳素信号、多巴胺受体激动剂溴隐亭抑制垂体催乳素释放等多种方法阻断垂体催乳素的促黄体效应，从而在体内研究蜕膜催乳素分子PRL8A2对黄体功能、妊娠维持的作用。结果表明，抑制垂体催乳素效应后，子宫中Notch2的缺失会导致小鼠黄体功能异常，无法合成足够的孕酮维持妊娠。过表达PRL8A2能够挽救LPS引起的Notch2敲除小鼠的妊娠失败。进一步的研究表明，PRL8A2的表达受到经典Notch信号的直接调控。值得注意的是，内层蜕膜细胞在妊娠第十天显著增多，提示这是一群走向退化的蜕膜细胞。退化的内层蜕膜细胞存在细胞凋亡和铁死亡现象，最终被滋养层巨细胞吞噬清除。蜕膜退化不依赖于胚源信号，并伴随孕酮受体表达的丢失。外层蜕膜细胞是蜕膜分化的起始阶段，高表达BMP2和WNT4，处于旺盛增殖状态。基底层成纤维细胞具有类似干细胞/前体细胞的基因表达谱，高表达Wnt信号通路分子和间充质干细胞的标志分子，KEGG分析也显示这群细胞存在Wnt信号通路和干细胞多能性维持相关通路的激活。另外，大量细胞外基质相关分子也富集在这群细胞中。在进一步的研究中，我们发现基底层细胞在胚胎植入后发生了去分化，丧失孕酮受体表达和对孕酮的响应能力，因此不会像其他基质细胞一样发生蜕膜化，能够一直保留至分娩后。总体来说，内层蜕膜细胞的主要功能是通过分泌催乳素分子维持妊娠，随后逐步退化;外层蜕膜细胞保持高度增殖，最终转变为终末分化的内层蜕膜细胞;而基底层细胞在胚胎植入后去分化形成类前体细胞，从而避免蜕膜分化和退化的命运，保留至分娩后。综上所述，我们的研究揭示了小鼠妊娠期子宫内膜的异质性，并重点探讨了基质细胞亚群的空间分布、分化轨迹以及各自的功能和命运，为进一步研究人类子宫内膜周期性动态变化奠定了良好的基础。收起

关键词 : 子宫内膜基质细胞亚群空间分布细胞分化

4. O-GlcNAc修饰蛋白调节人胎盘滋养层细胞合体化和功能的机制

[学位论文] 刘娟中国科学院大学 2021年博士导师: 王雁玲共159页

摘要 : 胎盘是哺乳动物妊娠期特有的临时器官，介导母体与胎儿之间的气体、营养物质及代谢废物的交换，同时分泌大量激素、生长因子、细胞因子，调节母体免疫、循环、代谢等生理过程的妊娠适应性，对保障胎儿发育至关重要。胎盘以绒毛为基本单元，绒毛主要由... 展开胎盘是哺乳动物妊娠期特有的临时器官，介导母体与胎儿之间的气体、营养物质及代谢废物的交换，同时分泌大量激素、生长因子、细胞因子，调节母体免疫、循环、代谢等生理过程的妊娠适应性，对保障胎儿发育至关重要。胎盘以绒毛为基本单元，绒毛主要由外层的多核合体滋养层细胞(STB)和内层的单核细胞滋养层细胞(CTB)组成;STB直接浸润在母血中，是胎盘发挥母胎物质交换和内分泌功能的关键场所。STB是由CTB经细胞融合分化而来，这一细胞过程被称为滋养层合体化。合体化受激活的PKA信号诱导，且多种分子发挥动态调控作用。滋养层合体化调控紊乱与子痫前期(PE)、胎儿宫内生长受限(IUGR)等多种妊娠疾病的发生直接相关。 O-连接的N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)修饰是真核细胞中广泛存在并且动态变化的一种蛋白质修饰，调节多种细胞行为并与很多疾病的发生相关。已有研究提示O-GlcNAc修饰可能参与胎盘发育调节，但O-GlcNAc修饰如何影响滋养层细胞的分化和功能，其与妊娠疾病有何关联，仍属未知。本研究则集中于滋养层合体化环节，探究O-GlcNAc修饰调节人滋养层细胞分化及内分泌功能的机制。利用forskolin(FSK)诱导BeWo细胞体外合体化模型，结合化学酶标记O-GlcNAc和定量蛋白质组学技术，首次建立了人胎盘滋养层细胞O-GlcNAc修饰蛋白数据库，包括829个高置信度O-GlcNAc修饰蛋白，其中44.7％为新发现的O-GlcNAc修饰蛋白。GO分析表明这些O-GlcNAc修饰蛋白主要集中于翻译起始、病毒转录、mRNA加工和rRNA加工等过程。在该数据库中，58个蛋白在FSK诱导下发生O-GlcNAc修饰水平升高≥1.5倍，富集于蛋白质折叠、药物应答和细胞内蛋白运输等过程，提示这些蛋白的O-GlcNAc修饰可能参与调节滋养细胞合体化或STB的功能。该数据库中胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)是O-GlcNAc修饰水平随FSK处理升高最为显著的蛋白，它是哺乳动物细胞中H2S合成的主要限速酶。既往有报道显示CSE表达异常与胎盘功能障碍及PE等妊娠疾病相关联;前列腺细胞中H2S能够阻碍雄激素受体AR的信号通路;而胎盘STB是孕期雄激素的重要合成来源。这些线索促使进一步探究O-GlcNAc修饰的CSE在滋养层细胞中的功能机制。先采用化学酶法标记O-GlcNAc修饰蛋白，通过“ChickChemistry”实验确定CSE的O-GlcNAc修饰水平随FSK处理的动态特征，发现FSK可以快速诱导CSE蛋白发生O-GlcNAc修饰，并可长时间稳定保持高水平修饰状态。进而利用LC-MS/MS质谱及特异位点突变实验，证实Ser138是CSE蛋白的核心O-GlcNAc修饰位点，该位点的O-GlcNAc修饰可增强滋养层细胞中CSE的酶活性，以促进H2S的生成。NaHS（H2S的前体）处理或CSE过表达质粒(WT-CSE)转染BeWo细胞，均可提高细胞中H2S水平并显著抑制FSK诱导的滋养层合体化，而转染Ser138位点突变的CSE质粒(Ser138-CSE)则降低细胞中H2S的产生并增强FSK诱导的滋养层合体化。为了探究CSE调节滋养层合体化的机制，先分析了睾酮(T0)是否参与调节滋养层合体化，发现T0的作用在于协同FSK，进一步提高滋养层合体化水平。NaHS或转染WT-CSE质粒则可以显著抑制BeWo细胞中AR的二聚化，阻碍T0诱导的滋养层合体化;而转染Ser138-CSE质粒不能抑制AR的二聚化，反而进一步增强T0诱导的滋养层合体化。上述结果表明滋养层细胞中FSK在诱发滋养层合体化的同时，通过诱导CSE蛋白的O-GlcNAc修饰，抑制AR的二聚化而阻碍T0的促合体化作用，由此形成了滋养层细胞分化的负反馈调节。在建立的滋养层细胞O-GlcNAc数据库中，转录因子GATA3是FSK诱导发生O-GlcNAc修饰的蛋白之一。生物信息学分析及文献报道提示GATA3可能调节类固醇激素合成关键限速酶基因HSD3B1（编码3β-HSD1）和HSD17B3（编码17β-HSD3）的表达。通过CHIP实验证明，人滋养层细胞中GATA3可直接结合到HSD3B1和HSD17B3的转录起始位点上游，并促进其转录，过表达GATA3能显著提高HSD3B1和HSD17B3表达。进一步的质谱实验及位点突变实验显示Thr322为GATA3的核心O-GlcNAc修饰位点，该位点的O-GlcNAc修饰能增强GATA3蛋白的稳定性;Thr322位点突变显著抑制GATA3对HSD3B1和HSD17B3基因表达的调节，并降低滋养层细胞中T0的合成。子痫前期是危害孕妇及胎儿发育的重大妊娠并发症，与滋养层细胞分化和功能异常密切相关。在早发型子痫前期患者(E-PE)胎盘中，发现CSE蛋白水平低于其周龄匹配的对照胎盘(PTL)组，但O-GlcNAc修饰的CSE蛋白水平以及H2S产量却显著高于PTL组，与之密切关联的是，滋养层合体化水平显著低于PTL组。另一方面，E-PE胎盘中3β-HSD1、17β-HSD3、O-GlcNAc修饰的GATA3水平以及T0水平均显著高于PTL组，相关性分析表明E-PE胎盘中O-GlcNAc修饰的GATA3的水平与T0浓度呈现显著正相关。这些结果表明CSE和GATA3蛋白O-GlcNAc修饰的异常可能参与滋养层细胞分化和功能障碍。综上所述，本研究首次建立了人胎盘滋养层细胞O-GlcNAc修饰蛋白数据库，并发现PKA信号在诱发滋养层合体化的同时，通过诱导包括CSE和GATA3等蛋白的O-GlcNAc修饰，实现对合体化进程以及STB内分泌功能的精细调控;而滋养层细胞中蛋白O-GlcNAc修饰的异常可能与子痫前期等妊娠疾病的发生密切关联。这些结果对理解胎盘发育的翻译后调控机制提供了重要基础，并有望为胎盘相关妊娠疾病的诊治策略提供新思路。收起

关键词 : 妊娠疾病 O-连接的N-乙酰葡糖胺修饰滋养层合体化病理机制

5. miR-195与miR-210在胎盘滋养层细胞中的功能研究

[学位论文] 王好中国科学院大学 2017年博士导师: 王雁玲共154页

摘要 : 滋养层细胞分化是妊娠建立与维持的重要生物学基础之一。胎盘发育期间，细胞滋养层细胞增殖并分化为不同亚型，绒毛外滋养层细胞侵润子宫蜕膜并改建母体螺旋动脉，而合体滋养层细胞是母体与胎儿间实现物质交换的主要场所，并可产生多种激素和因子调控... 展开滋养层细胞分化是妊娠建立与维持的重要生物学基础之一。胎盘发育期间，细胞滋养层细胞增殖并分化为不同亚型，绒毛外滋养层细胞侵润子宫蜕膜并改建母体螺旋动脉，而合体滋养层细胞是母体与胎儿间实现物质交换的主要场所，并可产生多种激素和因子调控母胎对话。滋养层细胞的分化受到众多信号通路的严格时空调控，其失调或障碍将对正常妊娠进程产生重要影响。子痫前期是一种妊娠相关综合症，表现为妊娠20周后出现的原发性高血压与蛋白尿，发病率约5-8％。目前学界普遍认为，滋养层细胞侵润及血管改建能力不足是子痫前期的主要诱因。滋养层侵润浅表与螺旋动脉改建不足导致胎盘灌注不足、缺血缺氧，进一步造成滋养层细胞分化失调、氧化应激增强、细胞凋亡、内皮细胞损伤、炎症因子释放增加，从而引发母体子痫前期的病理表现。子痫前期影响母亲与胎儿的近期与远期健康，至今尚无有效的预测与治疗手段。因此，对子痫前期病理机制的研究对于母胎健康的保障具有积极意义。 miRNA是一种约19-22个碱基的内源性单链非编码小分子RNA，参与对增殖、分化、凋亡等多种细胞行为的调控。前期通过微阵列芯片检测发现，子痫前期胎盘中miR-195表达异常降低，而miR-210表达升高。本研究分别对这两个miRNA的功能进行深入研究，探讨它们与子痫前期发生发展之间的关联。原位杂交实验显示多种胎盘滋养层细胞可表达miR-195;前瞻性分析表明子痫前期患者妊娠早中期的血浆中，miR-195的水平已显著降低，提示miR-195可能参与子痫前期病理的早期事件。生物信息学预测显示激活素A的Ⅱ型受体ActRⅡB为miR-195的潜在靶基因;而ActRⅡB在子痫前期患者胎盘中表达上调，与miR-195呈现相反的变化趋势。利用人类滋养层细胞系HTR8/SVneo，证明ActRⅡB受到miR-195直接靶向调控，ActRⅡB能够挽救miR-195对滋养层细胞侵润能力的促进作用。这一研究表明miR-195可通过靶向ActRⅡB促进滋养层细胞侵润。为了全面认识miR-195在滋养层细胞中的功能，联用高通量质谱技术与生物信息学预测，在HTR8/SVneo细胞中筛查miR-195的靶基因谱，发现线粒体相关蛋白FOXRED1与PDPR可能受到miR-195直接靶向调控。通过蛋白免疫印迹实验与双荧光素酶报告基因检测，证明子痫前期胎盘中FOXRED1或PDPR表达水平均升高;滋养层细胞中这两种分子均是miR-195的直接靶基因;miR-195能够促进氧化应激诱导的滋养层细胞凋亡与线粒体功能损伤，而这种损伤可被FOXRED1或PDPR部分挽救;慢性氧化应激刺激下，miR-195的表达水平降低。因此，子痫前期胎盘中miR-195的表达下调可能是作为过量氧化应激的应答的反馈补偿机制。 RNA结合蛋白CPEB2是miR-210的诸多预测靶基因之一。多项报道显示低氧诱导因子HIF-1α可转录激活miR-210，而其mRNA序列中存在CPE元件，可能受到CPEB2调控。发现胎盘中miR-210广泛表达于多种滋养层细胞，而CPEB2与miR-210具有相似的空间表达模式;在子痫前期患者胎盘中CPEB2表达水平降低，与miR-210的变化趋势相反。利用人绒毛膜癌细胞系BeWo，证明CPEB2受miR-210直接靶向抑制，低氧处理可诱导miR-210表达并抑制CPEB2。RNA免疫共沉淀证实CPEB2与HIF-1α编码基因的相互结合，且低氧条件下过表达CPEB2能够抑制HIF-1α的蛋白水平;敲降miR-210使低氧条件下HIF-1α蛋白水平降低，表明HIF-1α可通过miR-210/CPEB2途径实现自身的正反馈增强。此外，过表达miR-210与敲降CPEB2均能够抑制毛喉素诱导的BeWo细胞合体化，且过表达CPEB2能够挽救miR-210对细胞融合的抑制作用。这些结果提示低氧下HIF-1α、miR-210与CPEB2构成正反馈环路，可能放大子痫前期胎盘中的低氧应答信号及miR-210的表达增高;同时，低氧诱导的miR-210可能通过CPEB2抑制滋养层细胞合体化，参与子痫前期发生。综上所述，本研究阐明了滋养层细胞中miR-195可通过ActRⅡB影响细胞侵润功能，并通过靶向线粒体相关蛋白FOXRED1与PDPR调节氧化应激诱导的细胞凋亡与线粒体功能损伤。低氧环境中miR-210通过CPEB2反馈调节HIF-1α蛋白水平，并影响滋养层细胞合体化。胎盘中microRNA的表达失调可能影响滋养层细胞的分化与存活，从而参与子痫前期的发生与发展。收起

关键词 : 子痫前期病理机制非编码单链核糖核酸-195 非编码单链核糖核酸-210 胎盘滋养层细胞细胞侵润

6. 人胎盘滋养层细胞糖代谢模式与合体化命运交互调节的机制研究

[学位论文] 蔚欣中国科学院大学 2023年博士导师: 王雁玲共153页

摘要 : 哺乳动物妊娠期间，胎盘是保障母儿健康重要的临时性器官，其重要功能包括:合成和分泌多种激素和因子以调节妊娠适应性、在母胎间传递营养物质和代谢产物、维持母体对半异体胎儿的免疫耐受以及抵御外界病原体的侵入等。胎盘滋养层起源于囊胚期的单层滋... 展开哺乳动物妊娠期间，胎盘是保障母儿健康重要的临时性器官，其重要功能包括:合成和分泌多种激素和因子以调节妊娠适应性、在母胎间传递营养物质和代谢产物、维持母体对半异体胎儿的免疫耐受以及抵御外界病原体的侵入等。胎盘滋养层起源于囊胚期的单层滋养外胚层，至妊娠中期发育为结构和功能基本成熟的器官，其细胞成分复杂，并发生多细胞间的精细互作。胎盘在保障胎儿发育的同时，自身也需快速生长和复杂分化，故而是高耗能器官，已有研究显示妊娠期胎盘可消耗母血中约30％的葡萄糖。因此，适宜的胎盘-胎儿营养分配对确保胎儿和母体的健康是至关重要的。胎盘代谢异常往往会导致胎盘局部氧化应激损伤和营养传输紊乱，与子痫前期、复发流产和胎儿生长受限等妊娠并发症密切相关。胎盘滋养层细胞的分化路径之一为单核的细胞滋养层细胞(CTB)历经合体化过程分化为多核的合体滋养层(STB),形成绒毛结构，主要执行母胎间营养物质运输及内分泌功能。以往研究发现STB中线粒体呈现较小的囊泡状结构。作为细胞能量生成和调节中心，线粒体形态的改变往往与细胞代谢模式的变化直接相关。但迄今胎盘中CTB分化为STB的进程中，营养代谢模式如何改变、胎盘和胎儿间营养分配如何协调、其深入的调节机制是什么，均是悬而未决的科学问题。基于此，本研究综合利用原代胎盘滋养层细胞、人类滋养层干细胞(hTSCs)及其诱导分化、hTSCs异种移植小鼠等模型，结合转录组、代谢组、表观遗传组学分析等手段，系统研究了人类滋养层细胞合体化进程中细胞内葡萄糖代谢模式的变化及其与细胞分化的交互调节机制。我们首先在分离纯化的人妊娠早期胎盘CTB和STB中，发现未分化的CTB中葡萄糖代谢关键酶(包括HK1、HK2、PFKL、PFKP、LDHA、LDHB等)以及糖酵解关键代谢产物(包括葡萄糖、6-磷酸果糖、丙酮酸、乳酸等)水平都显著高于分化终末STB中的水平。在hTSCs诱导合体化模型中，发现糖代谢在未分化的hTSCs中高度活跃，而合体化进程中伴随了糖酵解水平的迅速下降。适宜浓度的糖酵解关键代谢物(葡萄糖、丙酮酸和醋酸)可促进hTSCs合体化，而糖酵解关键酶HK的抑制剂(2-DG)或LDHA的抑制剂(oxamate)导致hTSCs合体化程度显著下降;添加醋酸(acetate)以补充细胞内乙酰辅酶A(acetyl-CoA)，可以挽救oxamate所引起的合体化命运异常。可见，虽然合体滋养层细胞中糖酵解水平迅速降低，但基础水平的糖酵解对于合体化的发生是必需的。既往有研究表明,糖酵解来源的acetyl-CoA不仅能够作为TCA循环的底物，还可作为赖氨酸乙酰化底物参与组蛋白的乙酰化修饰及染色质开放调节，从而推动胚胎干细胞分化。我们进而在hTSCs中发现，acetate明显改善了由oxamate造成的胞内乙酰化赖氨酸水平的下降，更重要的是，它显著挽救了组蛋白H3和H4K16的乙酰化水平。进一步地，高通量RNA-seq结果显示，hTSCs合体化过程中，acetate的补充促进了合体化启动（cAMP通路等）以及合体化功能维持（激素合成等）相关基因的表达，并挽救oxamate所造成的细胞代谢损伤和炎症压力。表观基因组学分析发现，hTSCs合体化进程中，组蛋白H4K16乙酰化位点主要存在于多个合体化调节基因、STB功能维持必须基因、抗氧化相关基因等的转录起始位点上。这些结果表明glucose-acetate代谢通路可通过acetyl-CoA维持的组蛋白H4K16乙酰化，调节滋养层细胞合体化激活基因及抗氧化基因的表达，并抑制细胞的促炎反应。最后，我们在hTSCs异种移植小鼠模型中，发现oxamate处理后的hTSCs在小鼠皮下难以自发形成STB，而oxamate和acetate合并处理后的hTSCs在小鼠皮下的自发合体化能力得到明显恢复，可达到对照组hTSCs的合体化水平。可见，短暂的糖酵解阻断可能在hTSCs中造成合体化潜能降低的印记，从而永久性损伤合体化进程，并可能诱导滋养层细胞的促炎命运。acetate补充可以永久性挽救这些表观遗传紊乱，使滋养层细胞的自发合体化能力得以恢复。综上，本研究阐释了人胎盘滋养层细胞合体化进程中糖代谢模式的变化规律，揭示了 glucose-acetate代谢在胎盘滋养层干细胞分化命运调节中重要的表观遗传作用。表明胎盘STB将自身的葡萄糖代谢降低至分化命运表观遗传调节所需的基础水平，以便将更多的葡萄糖输送给快速生长的胎儿。相关结果为进一步揭示母体-胎盘-胎儿营养分配的协调机制、挖掘妊娠相关疾病的表观遗传调节机理奠定了坚实的基础。收起

关键词 : 胎盘滋养层细胞合体化过程糖代谢模式组蛋白乙酰化调控机制

7. 人类子宫蜕膜自然杀伤细胞亚群在妊娠维持中的功能研究

[学位论文] 贾文通中国科学院大学 2019年博士导师: 王雁玲共153页

摘要 : 哺乳动物的妊娠建立和维持有赖于结构和功能完善的母胎界面。母胎界面承载着母体和胎儿之间的营养物质和气体交换，并保护同种半异体胎儿免受母体免疫排斥。母胎界面上胎儿起源的胎盘滋养层细胞和母体来源的子宫蜕膜细胞、血管内皮细胞以及大量免疫细... 展开哺乳动物的妊娠建立和维持有赖于结构和功能完善的母胎界面。母胎界面承载着母体和胎儿之间的营养物质和气体交换，并保护同种半异体胎儿免受母体免疫排斥。母胎界面上胎儿起源的胎盘滋养层细胞和母体来源的子宫蜕膜细胞、血管内皮细胞以及大量免疫细胞之间发生动态、复杂而精密协调的互作，其间细胞分化和功能的异常与复发性流产、子痫前期等多种不良妊娠结局直接相关。人类妊娠早期母胎界面上约70％的淋巴细胞为CD3-CD16-CD56bright分子标记的蜕膜自然杀伤(dNK)细胞。已有研究显示，dNK细胞与外周NK(pNK)细胞不同，呈现低杀伤性和高分泌活性等特征，可通过KIR等功能性受体介导识别滋养层细胞并与之发生直接互作，也可通过分泌多种细胞因子或生长因子等影响滋养层细胞功能，在调节母胎免疫耐受和胚胎/胎盘发育中发挥重要作用。然而由于伦理限制，目前有关人类dNK的研究主要基于体外细胞模型;而小鼠子宫蜕膜自然杀伤(uNK)细胞的亚型、分子特征等与人类dNK细胞存在较大差异，难以利用经典小鼠模型在体探究人类dNK细胞的功能。另外，迄今对人类dNK细胞亚群及功能的研究也非常有限。因此，如何构建人源化小鼠模型在体研究人类dNK细胞维持妊娠的机制、发掘和鉴定人类dNK细胞的亚群分型和分子特征等，仍是本领域亟待解决的重要科学问题。本论文针对上述科学问题开展研究。我们首先利用高度免疫缺陷NOG小鼠构建了“归巢”人类dNK细胞的人源化小鼠模型，在体探究母胎界面上人类dNK细胞对胎盘滋养层细胞分化的影响。原代分离人类妊娠早期正常妊娠或复发性流产患者来源的dNK细胞，于E6.5过继回输至妊娠NOG小鼠，流式细胞术分析显示人dNK细胞可以特异性“归巢”至NOG小鼠的子宫。E10.5的表型分析显示，过继回输正常妊娠dNK细胞可有效降低NOG小鼠中胚胎吸收率，并促进胚胎发育;但过继回输复发性流产dNK细胞并不能改善NOG小鼠的妊娠结局，部分胚胎发育滞后，至E13.5胚胎吸收率显著增加。对存活胚胎的胎盘结构分析显示，回输正常妊娠dNK细胞使NOG小鼠胎盘迷路层中胎儿血管分支更丰富，胎儿血管面积增加，相应地滋养层细胞合体化水平提高;同时胎盘滋养层巨细胞的侵润能力增强，子宫螺旋动脉改建程度增加，母体血窦面积增大。相反，回输复发性流产dNK细胞则导致胎盘滋养层细胞浸润不足，迷路层胎儿血管分支减少，母体血窦面积和胎儿血管面积均减少。为了进一步探明dNK细胞通过产生何种细胞因子调节滋养层细胞分化，我们先比较分析了正常妊娠和复发性流产dNK细胞分泌特性的差异，发现复发性流产dNK细胞产生MCSF的能力有显著下调;免疫荧光和免疫组化染色表明dNK细胞是母胎界面上MCSF的主要来源，而人和小鼠的各类滋养层细胞均表达MCSF的受体。进而利用小鼠滋养层干细胞(mTSCs)体外分化模型，证明人正常dNK细胞可通过分泌MCSF有效促进滋养层细胞向侵润途径和合体化分化，而复发性流产dNK细胞则不能影响滋养层细胞分化，补充MCSF后可“挽救”复发性流产dNK细胞的功能。由此我们构建了能够再现人dNK细胞供体妊娠结局的人源化NOG小鼠模型，并证明dNK细胞可通过产生MCSF等细胞因子调节胎盘滋养层细胞的侵润分化和合体化分化。进一步地，本研究利用单细胞转录组技术对妊娠早期人类dNK细胞的亚群特性进行挖掘。根据10×genomics测序及数据分析结果，人类dNK细胞可分为5个亚群，分别命名为dNK_a，b，c，d，e。对其分子特性的注释显示，dNK_a是一群增殖活跃的细胞，dNK_b亚群可分泌趋化因子且具有一定免疫活性，dNK_c为低杀伤性强分泌、并高表达与滋养层细胞互作受体的亚群，dNK_d的免疫活性较强并表达较高水平的黏附因子，dNK_e则与外周CD56dimCD16+NK细胞的特性类似。随后，利用主要亚群dNK_c和dNK_d的标记基因CD39和CD103对dNK细胞进行流式分选，获得CD39+CD103-、CD39+CD103+、CD39-CD103+、CD39-CD103-标记特性的四群细胞，进行Smart-seq2转录组测序分析。结果显示CD39+CD103-和CD39+CD103+的基因表达模式和特性十分相似，而CD39-CD103+和CD39-CD103是特性相似的细胞群，提示CD39分子标记对于区分dNK细胞功能亚群的重要性。基于此，我们进一步分选了CD39+dNK和CD39-dNK细胞进行特性和功能分析，发现CD39+dNK细胞处于免疫失活状态，但高表达KIR等功能性受体，主要定位于胚胎植入位点的蜕膜组织，可以促进滋养层细胞侵润并且调节滋养层细胞合体化;这群细胞在复发流产蜕膜中比例显著降低。相反，CD39-dNK细胞则处于免疫激活状态，具有较强的杀伤性，主要定位于非胚胎植入位点的蜕膜组织，对滋养层细胞侵润分化的影响较弱，但可促进滋养层细胞合体化。综上所述，本研究构建了“归巢”人类dNK细胞的人源化NOG小鼠模型，证明dNK细胞的特性对胎盘发育和妊娠结局有重要影响，发现dNK细胞可通过分泌MCSF调节滋养层细胞向侵润和合体化方向分化。进一步通过单细胞测序鉴定到dNK细胞的5个亚群，结合功能实验证明CD39+dNK是调节滋养层细胞分化的关键亚群，而CD39-dNK细胞可能发挥免疫调节作用。这一研究从在体模型及分子分型方面加深了对人类dNK细胞的认识，并为复发性流产等妊娠相关疾病的干预提供了新思路。收起

关键词 : 人类蜕膜自然杀伤细胞亚群分型分子特征妊娠维持

8. 利用基因敲除小鼠模型研究Raptor/mTORC1和microRNA-210在妊娠调控中的功能

[学位论文] 边晓涛中国科学院大学 2020年博士导师: 王雁玲共146页

摘要 : 妊娠的建立和维持是一个高需能的过程，胎盘和胎儿的快速生长需要母体高效地提供营养物质。妊娠还是一个复杂的生物学过程，受母体自身素质、宫内环境以及母体外部环境等多重因素的影响，并涉及众多基因的调控。胎盘承载着母体和胎儿之间进行物质交换... 展开妊娠的建立和维持是一个高需能的过程，胎盘和胎儿的快速生长需要母体高效地提供营养物质。妊娠还是一个复杂的生物学过程，受母体自身素质、宫内环境以及母体外部环境等多重因素的影响，并涉及众多基因的调控。胎盘承载着母体和胎儿之间进行物质交换以及维持正常妊娠的重要功能。胎盘发育障碍往往与某些妊娠疾病，如子痫前期和胎儿生长受限密切相关，而且常常伴随某些基因的异常表达，如Raptor/mTORC1和microRNA(miR)-210。从胚胎植入后到成熟胎盘形成前的妊娠早期阶段，胚胎发育所需的营养物质主要以组织营养的方式从蜕膜细胞和子宫内膜腺体中获取。胎盘和胎儿发育处于生理性缺氧环境，而且这也是胎盘滋养层细胞谱系分化的关键时期。尽管越来越多的研究表明不良妊娠结局往往在妊娠早期就决定了，但这段时期的生理和病理材料获取难度高，而且不能精确掌控取材时间点，因此Raptor/mTORC1和miR-210如何参与妊娠早期胎盘发育并影响妊娠结局尚属未知。为解决以上科学问题，本研究拟利用基因敲除小鼠模型，对Raptor/mTORC1和miR-210在胎盘发育早期以及妊娠维持中的作用进行系统性研究。首先我们利用Cre/LoxP重组酶系统（Elf5-Cre）对囊胚滋养外胚层细胞中的Raptor基因进行条件性敲除，在妊娠中期(E10.5)发现条件性纯合敲除(cKO)可以导致胚胎吸收，而条件性杂合敲除的胎盘和胚胎未受影响。接下来，我们利用常规组织包埋、切片、激光捕获显微切割以及切片染色方法对早期胚胎(E5.5-8.5)进行了基因型鉴定和表型分析。P-S6(S240/S244)免疫荧光结果表明，启动敲除一天后(E5.5)，cKO胚胎的外胎盘锥(EPC)和胚外外胚层(ExE)区域的mTORC1下游信号通路即被有效阻断了。H&E染色、细胞增殖标志物PH3、滋养层细胞干性维持以及分化标志物（Cdx2、Eomes和P11）的免疫荧光染色结果显示，cKO胚胎的EPC和ExE在E5.5之后发育受阻，细胞增殖能力受到一定程度抑制，壁滋养层巨细胞(P-TGC)分化不足。发育至E7.5后胚胎出现致命发育缺陷，具体表现为EPC消失、绒毛膜(Cho)发育不良、尿囊膨生失败等，而且所有胚层细胞增殖被抑制。以上表型分析的结果表明Raptor/mTORC1信号通路在胎盘早期发育中所发挥的关键作用，对胚胎发育也至关重要。接下来，我们对胚胎致死的相关机制进行了探讨。考虑到快速发育的胎盘和胚胎对能量的高需求，我们对早期母胎界面分别进行了糖原染色(PAS)和葡萄糖转运载体GLUT1/GLUT3的表达分布分析。染色结果显示，母胎界面的糖原分布和GLUT1/GLUT3的表达分布均具有时空特异性。特别是在E5.5母体初级蜕膜区(PDZ)中不仅分布有大量糖原颗粒，而且高表达GLUT3，而GLUT1则主要表达于P-TGC、EPC和ExE等胚胎细胞。尽管cKO母胎界面营养分布和转运载体未受影响，但P-TGC的分化不足导致PDZ中的糖原和葡萄糖难以被有效转运至胚胎，可能导致胎盘和胎儿发育失败。我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了miR-210敲除小鼠品系，实时荧光定量PCR结果显示miR-210在各种组织中的表达均显著降低。常氧饲喂条件下miR-210缺失对小鼠的生育率和胎仔数的影响很小。将孕鼠持续暴露于缺氧舱(E6.5-10.5或E6.5-18.5，10.5％O2)中会导致胎儿体重显著降低，对于miR-210敲除孕鼠，其胎儿体重减轻更加显著。对胎盘结构的分析结果表明，母体缺氧导致的海绵滋养层过度延伸的现象在miR-210敲除胎盘中有所减弱，而且迷路层中胎儿血管发育受阻。研究结果表明，miR-210参与调节胎盘对妊娠期缺氧应激的适应，保护缺氧应激下胎儿生长，而且对胎儿的保护作用似乎在妊娠早期更为关键。综上所述，本研究利用基因敲除小鼠模型证明了Raptor和miR-210对早期妊娠的调控作用，发现Raptor/mTORC1信号通路不仅能够调控EPC和ExE的发育，而且能够通过影响P-TGC的分化干预其对营养的摄取，从而加深了对该信号通路在妊娠早期胎盘发育和营养感知中的认识。作为一个“微调”分子，发现miR-210有助于胎盘对妊娠缺氧应激的适应性调节，为了解该缺氧诱导的基因在妊娠维持中的生理功能提供了理论基础。收起

关键词 : 早期妊娠 Raptor基因非编码RNA-210 缺氧应激适应性调节

9. 子痫前期胎盘中Met信号通路异常削弱的机制研究

[学位论文] 李冠琳中国科学院大学 2016年博士导师: 王雁玲共145页

摘要 : 胎盘是妊娠过程中保障母体和胎儿健康的关键临时器官，胎盘的主要组成细胞是滋养层细胞，它们的一个主要分化形式是具有侵润能力的绒毛外滋养层细胞，通过侵润子宫蜕膜基质和改建子宫螺旋动脉，建立有效的子宫-胎盘-胎儿血液循环，实现胎儿与母体的物... 展开胎盘是妊娠过程中保障母体和胎儿健康的关键临时器官，胎盘的主要组成细胞是滋养层细胞，它们的一个主要分化形式是具有侵润能力的绒毛外滋养层细胞，通过侵润子宫蜕膜基质和改建子宫螺旋动脉，建立有效的子宫-胎盘-胎儿血液循环，实现胎儿与母体的物质交换。滋养层细胞这一分化途径异常与多种妊娠疾病的发生密切相关。子痫前期是一种严重危害孕产妇和胎儿健康的妊娠疾病，主要临床指征是妊娠在20周以后，患者突发高血压并伴有蛋白尿或全身多脏器的病变。多项研究证据显示胎盘发育障碍与子痫前期的发生发展直接关联，主要表现为滋养层细胞对子宫蜕膜基质和螺旋动脉的侵润及改建严重不足，导致母体向胎盘的血流灌注受阻，母胎界面处于严重的缺氧状态，进一步加重滋养层细胞分化障碍，并释放多种分子和细胞碎片进入母体血液循环，干扰母体多脏器功能。肝细胞生长因子(HGF)通过受体Met介导的信号通路在哺乳动物胎盘发育中发挥重要作用，是促进滋养层细胞迁移、侵润和改建血管的重要调节信号。基因敲除HGF或Met均可导致小鼠胚胎出生前死亡，胎盘滋养层分化和母胎界面血管生成发生严重缺陷。我们前期研究发现重度子痫前期患者胎盘中HGF和Met表达量并未发生改变，但可过量产生可溶性Met(sMet)，且sMet可抑制HGF促滋养层细胞侵润的能力，表明这一病理胎盘发育缺陷可能与HGF/Met通路的功能不足有关。进一步分析发现，与对照组相比，重度子痫前期（尤其是发生于妊娠34周龄之前的早发型重度子痫前期）胎盘中Met及其下游信号分子Erk的磷酸化水平显著下降，并且滋养层细胞胞质中呈现大量簇状聚集的Met信号，提示早发重度子痫前期胎盘中Met受体的激活与失活可能发生了严重的异常。生理状态下，Met受体激活并传递信号的同时，会被迅速内吞到细胞质中，并进一步通过泛素化途径发生降解，从而避免受体持续处于激活状态而造成细胞损伤，确保了生理条件下信号的适度传递;另一方面，除了配体HGF之外，人血管内皮细胞和肿瘤细胞中发现sema4D/Plexin-B1信号也可交叉激活Met的酪氨酸激酶活性。基于这些事实，我们推测早发重度子痫前期胎盘滋养层细胞中，可能因过度缺氧导致Met受体的内吞过度、降解异常和交叉激活不足，致使HGF/Met通路对滋养层细胞侵润分化的调节障碍。为证实这一假设，我们对早发型和迟发型重度子痫前期胎盘中Met受体和内吞小泡分布情况、受体内吞相关蛋白Clathrin和CAV-1、Met特异E3泛素连接酶Cbl以及sema4D/Plexin-B1等分子的表达变化情况进行细致分析，并利用人滋养层细胞（HTR8/SVneo细胞系）和血管内皮细胞为体外模型，从Met内吞、泛素化降解和sema4D交叉激活等三个方面，研究影响滋养层细胞中Met信号异常削弱和功能障碍的机理。免疫荧光定位结果显示，妊娠早期和晚期胎盘中，Met与CAV-1共定位于多种滋养层细胞中，包括绒毛滋养层细胞、侵润到子宫蜕膜基质的间质型滋养层细胞(iEVTs)、侵入子宫螺旋动脉的血管内滋养层细胞（enEVTs）;透射电镜观察发现早发重度子痫前期胎盘滋养层细胞膜上内吞小泡数量远远多于对照胎盘组;HTR8/SVneo细胞模型中证实缺氧刺激可以显著增加CAV-1表达及其与Met蛋白的结合，同时生物素标记的膜蛋白内吞实验也证实缺氧能够大大增加Met蛋白的内吞，而CAV-1特异敲降则可逆转缺氧所诱导的Met蛋白内吞。这些结果提示，子痫前期胎盘所遭遇的缺氧环境可能通过上调滋养层细胞中CAV-1表达造成Met蛋白的异常内吞。实时定量PCR和Western blotting结果显示，早发重度子痫前期胎盘中Met特异E3泛素连接酶Cbl的表达发生下调。HTR8/SVneo细胞模型中证实缺氧刺激可以显著增加细胞中Met簇状聚集的信号，并降低Cbl的表达;同时细胞中Met与蛋白酶体共定位的百分比也显著下降。细胞敲降Cbl的表达可导致Met簇状聚集样信号增加及Met与蛋白酶体共定位百分比下降，提示Met的蛋白酶体途径降解减弱。当细胞中敲降Cbl表达时，HGF对Met和Erk的激活及对滋养层细胞侵润的促进作用几乎被完全阻断。这些结果提示，Cbl介导的Met泛素化降解对HGF/Met信号功能的发挥至关重要，而缺氧刺激可导致Cbl表达下调，因而Met的泛素化降解受阻，大量Met蛋白积累在细胞质中，HGF调控滋养层细胞行为的功能无法实现。另一方面，我们的结果还证实滋养层细胞中，Met受体的激活不仅依赖于HGF配体，sema4D也能够有效地激活Met信号通路，并发挥与HGF类似的促进滋养层细胞侵润和改建血管的功能。但是在重度子痫前期胎盘中，sema4D和受体Plexin-B1的表达量都呈现了显著的下降，因而对Met信号通路的激活作用被大大减弱。除此之外，我们还发现重度子痫前期胎盘中Met的多种可变剪切体（包括Met934、Met877、Met823、Met755和Met413等）RNA表达水平发生改变，而缺氧刺激可不同程度地影响这些剪切体的表达。综上所述，本研究从多个角度探讨了重度子痫前期胎盘中Met信号通路异常削弱的机制，证明缺氧的病理条件下滋养层细胞中发生CAV-1介导的Met内吞异常增加，以及Cbl介导的Met泛素化降解途径受阻;同时下调的sema4D/Plexin-B1使Met信号的交叉激活途径减弱。这为阐释重度子痫前期胎盘中滋养层细胞分化和功能障碍的机制提供了新的证据。收起

关键词 : 子痫前期胎盘滋养层细胞信号通路

10. 子痫前期胎盘差异表达miRNAs的鉴定及mir-17-92基因簇在子痫前期发病机制中的作用研究

[学位论文] 许鹏中国科学院大学 2014年博士导师: 王雁玲共134页

摘要 : 子痫前期(preeclampsia，PE)是人类妊娠期所特有的多系统疾病，其主要的临床表现为妊娠20周以后的高血压，并伴随蛋白尿、水肿、抽搐等症状。子痫前期的平均发病率为2-7％，是世界范围内导致孕产妇和围产儿死亡的主要产科并发症。胎盘早期发育的不完善... 展开子痫前期(preeclampsia，PE)是人类妊娠期所特有的多系统疾病，其主要的临床表现为妊娠20周以后的高血压，并伴随蛋白尿、水肿、抽搐等症状。子痫前期的平均发病率为2-7％，是世界范围内导致孕产妇和围产儿死亡的主要产科并发症。胎盘早期发育的不完善，尤其是滋养层细胞分化和功能障碍被认为是子痫前期的直接病理因素。因此，寻找在子痫前期胎盘中异常表达的基因是探究子痫前期发病机制的重要策略。 MicroRNAs(miRNAs)是一类含有18-22个核苷酸的非编码小RNA分子，可以在转录后水平对其靶基因的表达进行抑制。miRNA可以广泛参与体内多种细胞行为的调节。已有研究发现一些miRNA分子在子痫前期胎盘中存在差异表达，但相关结果存在一定的争议，而且这些差异表达的miRNA分子在胎盘中的时空变化及其在患者血浆中的变化均报道较少。更重要的是，这些差异表达的miRNA分子如何通过影响人类胎盘发育从而参与子痫前期的发生，仍是尚未解决的问题。针对上述问题，本研究通过基因芯片和实时定量PCR方法，筛选和鉴定了子痫前期胎盘中差异表达的miRNAs，分析了相关miRNAs在患者外周血中的变化，并进一步在人胎盘滋养层细胞中研究了几个差异miRNAs的功能的调节。考虑到人类胎盘是不均一的组织，其绒毛膜面和基底膜面的细胞组成有较大差异，我们分别采集33例正常妊娠和14例重度子痫前期胎盘的绒毛膜面和基底膜面组织，系统分析了miRNAs在胎盘中的表达变化。由此鉴定到重度子痫前期胎盘中9个显著降调的miRNAs（包括miR-195，miR-223，miR-218，miR-379，miR-411，以及miR-17-92基因簇中的四个成员miR-17，miR-18a，miR-19b1，miR-92a1)和7个显著上调的miRNAs（包括miR-210，miR-30a-3p，miR-518b，miR-524，miR-17-3p，miR-151和miR-193b）。这些miRNAs在子痫前期胎盘的绒毛膜面和基底膜面有各自独特的差异表达模式。这一结果表明胎盘的取材部位对差异miRNAs分析结果可产生重要的影响，由此也部分地解释了相关研究报道存在争议的原因。子痫前期研究中的一个困境在于:患者临床症状出现于妊娠20周之后，但相关病理损伤在20周之前即已发生，如何确定分娩胎盘中鉴定到的差异表达基因是疾病的原因还是结果呢？对于miRNAs而言，已有研究显示妊娠妇女外周循环中的miRNAs分子大都来源于胎盘，因此，前瞻性分析获得的妊娠早中期血浆中miRNAs的检测结果将有助于分析差异miRNAs与疾病发生发展的因果关系。Taqman-PCR结果显示，与正常妊娠对照相比，重度子痫前期患者妊娠15-18周血浆中miR-17-92基因簇中的三个成员（miR-18a，miR-19b1和miR-92a1）水平显著降低，而miR-210水平则显著增高。原位杂交的结果显示，这些小RNA分子主要在胎盘的各种滋养层细胞以及血管内皮细胞中表达。这些结果提示上述miRNAs分子可能参与妊娠早中期滋养层细胞功能的障碍所致的子痫前期疾病的发生。我们进一步利用人滋养层细胞系HTR8/SVneo研究miR-17-92基因簇在滋养层细胞中的功能。从miR-18a入手开展细胞功能研究，结果显示，miR-18a对滋养层细胞的增殖和粘附能力有较小的影响，但可显著增强细胞的侵润能力。生物信息学分析和双荧光素酶报告实验结果显示Smad2是miR-18a在滋养层细胞的靶分子之一，但与肿瘤细胞中的报道不同，miR-18a在人滋养层细胞中不能靶向Smad3。miR-18a对滋养层细胞侵润功能的调节作用可以被过表达Smad2所“挽救”;而转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）对Smad2蛋白磷酸化的促进和对细胞侵润功能的抑制均可被miR-18a所逆转。在重度子痫前期胎盘中miR-18a和Smad2蛋白的差异表达模式相反。这些结果提示miR-18a在人滋养层细胞中可通过抑制Smad2的表达对TGF-β信号通路产生干扰，使细胞侵润能力增强;而子痫前期胎盘中miR-18a的异常降调可能放大TGF-β/Smad2对滋养层细胞侵润的抑制作用，造成滋养层细胞浅表侵润的病理表型。另一方面，我们探讨了子痫前期胎盘中miR-17-92基因簇异常低表达的调控机制。人滋养层细胞系HTR8/SVneo中的研究结果显示，与10％O2（母胎界面生理氧浓度）条件相比，缺氧(2％O2)环境可导致细胞中pri-miR-17-92以及miR-17-92基因簇多个成员的表达水平显著降低;有趣的是，我们发现缺氧作用的重要介导分子HIF-1是miR-18a的靶分子之一。提示缺氧对miR-17-92基因簇表达的调节可能存在负反馈调节环路。此外，子痫前期胎盘和正常妊娠胎盘中miR-17-92基因启动子c-myc转录因子结合区域DNA甲基化状态无明显差异，提示DNA甲基化可能不参与子痫前期胎盘中miR-17-92基因簇差异表达的调节。综上所述，我们系统分析了重度子痫前期胎盘和血浆中差异表达的miRNA分子;阐释了miR-18a通过抑制Smad2影响TGF-β对人滋养层细胞侵润行为的调节机制;发现缺氧是抑制滋养层细胞中miR-17-92基因簇表达的调控因素之一。这些研究结果对深入阐明胎盘中miRNAs分子的作用及其在子痫前期发生发展中的作用机制奠定了重要的基础。收起

关键词 : 子痫前期 miR-17-92基因簇细胞侵润发病机制差异表达