摘要: 妊娠的建立和维持是一个高需能的过程，胎盘和胎儿的快速生长需要母体高效地提供营养物质。妊娠还是一个复杂的生物学过程，受母体自身素质、宫内环境以及母体外部环境等多重因素的影响，并涉及众多基因的调控。胎盘承载着母体和胎儿之间进行物质交换... 展开 妊娠的建立和维持是一个高需能的过程，胎盘和胎儿的快速生长需要母体高效地提供营养物质。妊娠还是一个复杂的生物学过程，受母体自身素质、宫内环境以及母体外部环境等多重因素的影响，并涉及众多基因的调控。胎盘承载着母体和胎儿之间进行物质交换以及维持正常妊娠的重要功能。胎盘发育障碍往往与某些妊娠疾病，如子痫前期和胎儿生长受限密切相关，而且常常伴随某些基因的异常表达，如Raptor/mTORC1和microRNA(miR)-210。 从胚胎植入后到成熟胎盘形成前的妊娠早期阶段，胚胎发育所需的营养物质主要以组织营养的方式从蜕膜细胞和子宫内膜腺体中获取。胎盘和胎儿发育处于生理性缺氧环境，而且这也是胎盘滋养层细胞谱系分化的关键时期。尽管越来越多的研究表明不良妊娠结局往往在妊娠早期就决定了，但这段时期的生理和病理材料获取难度高，而且不能精确掌控取材时间点，因此Raptor/mTORC1和miR-210如何参与妊娠早期胎盘发育并影响妊娠结局尚属未知。为解决以上科学问题，本研究拟利用基因敲除小鼠模型，对Raptor/mTORC1和miR-210在胎盘发育早期以及妊娠维持中的作用进行系统性研究。 首先我们利用Cre/LoxP重组酶系统（Elf5-Cre）对囊胚滋养外胚层细胞中的Raptor基因进行条件性敲除，在妊娠中期(E10.5)发现条件性纯合敲除(cKO)可以导致胚胎吸收，而条件性杂合敲除的胎盘和胚胎未受影响。接下来，我们利用常规组织包埋、切片、激光捕获显微切割以及切片染色方法对早期胚胎(E5.5-8.5)进行了基因型鉴定和表型分析。P-S6(S240/S244)免疫荧光结果表明，启动敲除一天后(E5.5)，cKO胚胎的外胎盘锥(EPC)和胚外外胚层(ExE)区域的mTORC1下游信号通路即被有效阻断了。H&E染色、细胞增殖标志物PH3、滋养层细胞干性维持以及分化标志物（Cdx2、Eomes和P11）的免疫荧光染色结果显示，cKO胚胎的EPC和ExE在E5.5之后发育受阻，细胞增殖能力受到一定程度抑制，壁滋养层巨细胞(P-TGC)分化不足。发育至E7.5后胚胎出现致命发育缺陷，具体表现为EPC消失、绒毛膜(Cho)发育不良、尿囊膨生失败等，而且所有胚层细胞增殖被抑制。以上表型分析的结果表明Raptor/mTORC1信号通路在胎盘早期发育中所发挥的关键作用，对胚胎发育也至关重要。 接下来，我们对胚胎致死的相关机制进行了探讨。考虑到快速发育的胎盘和胚胎对能量的高需求，我们对早期母胎界面分别进行了糖原染色(PAS)和葡萄糖转运载体GLUT1/GLUT3的表达分布分析。染色结果显示，母胎界面的糖原分布和GLUT1/GLUT3的表达分布均具有时空特异性。特别是在E5.5母体初级蜕膜区(PDZ)中不仅分布有大量糖原颗粒，而且高表达GLUT3，而GLUT1则主要表达于P-TGC、EPC和ExE等胚胎细胞。尽管cKO母胎界面营养分布和转运载体未受影响，但P-TGC的分化不足导致PDZ中的糖原和葡萄糖难以被有效转运至胚胎，可能导致胎盘和胎儿发育失败。 我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了miR-210敲除小鼠品系，实时荧光定量PCR结果显示miR-210在各种组织中的表达均显著降低。常氧饲喂条件下miR-210缺失对小鼠的生育率和胎仔数的影响很小。将孕鼠持续暴露于缺氧舱(E6.5-10.5或E6.5-18.5，10.5％O2)中会导致胎儿体重显著降低，对于miR-210敲除孕鼠，其胎儿体重减轻更加显著。对胎盘结构的分析结果表明，母体缺氧导致的海绵滋养层过度延伸的现象在miR-210敲除胎盘中有所减弱，而且迷路层中胎儿血管发育受阻。研究结果表明，miR-210参与调节胎盘对妊娠期缺氧应激的适应，保护缺氧应激下胎儿生长，而且对胎儿的保护作用似乎在妊娠早期更为关键。 综上所述，本研究利用基因敲除小鼠模型证明了Raptor和miR-210对早期妊娠的调控作用，发现Raptor/mTORC1信号通路不仅能够调控EPC和ExE的发育，而且能够通过影响P-TGC的分化干预其对营养的摄取，从而加深了对该信号通路在妊娠早期胎盘发育和营养感知中的认识。作为一个“微调”分子，发现miR-210有助于胎盘对妊娠缺氧应激的适应性调节，为了解该缺氧诱导的基因在妊娠维持中的生理功能提供了理论基础。 收起