摘要: 胎盘是哺乳动物妊娠期特有的临时器官，介导母体与胎儿之间的气体、营养物质及代谢废物的交换，同时分泌大量激素、生长因子、细胞因子，调节母体免疫、循环、代谢等生理过程的妊娠适应性，对保障胎儿发育至关重要。胎盘以绒毛为基本单元，绒毛主要由... 展开 胎盘是哺乳动物妊娠期特有的临时器官，介导母体与胎儿之间的气体、营养物质及代谢废物的交换，同时分泌大量激素、生长因子、细胞因子，调节母体免疫、循环、代谢等生理过程的妊娠适应性，对保障胎儿发育至关重要。胎盘以绒毛为基本单元，绒毛主要由外层的多核合体滋养层细胞(STB)和内层的单核细胞滋养层细胞(CTB)组成;STB直接浸润在母血中，是胎盘发挥母胎物质交换和内分泌功能的关键场所。STB是由CTB经细胞融合分化而来，这一细胞过程被称为滋养层合体化。合体化受激活的PKA信号诱导，且多种分子发挥动态调控作用。滋养层合体化调控紊乱与子痫前期(PE)、胎儿宫内生长受限(IUGR)等多种妊娠疾病的发生直接相关。 O-连接的N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)修饰是真核细胞中广泛存在并且动态变化的一种蛋白质修饰，调节多种细胞行为并与很多疾病的发生相关。已有研究提示O-GlcNAc修饰可能参与胎盘发育调节，但O-GlcNAc修饰如何影响滋养层细胞的分化和功能，其与妊娠疾病有何关联，仍属未知。 本研究则集中于滋养层合体化环节，探究O-GlcNAc修饰调节人滋养层细胞分化及内分泌功能的机制。利用forskolin(FSK)诱导BeWo细胞体外合体化模型，结合化学酶标记O-GlcNAc和定量蛋白质组学技术，首次建立了人胎盘滋养层细胞O-GlcNAc修饰蛋白数据库，包括829个高置信度O-GlcNAc修饰蛋白，其中44.7％为新发现的O-GlcNAc修饰蛋白。GO分析表明这些O-GlcNAc修饰蛋白主要集中于翻译起始、病毒转录、mRNA加工和rRNA加工等过程。在该数据库中，58个蛋白在FSK诱导下发生O-GlcNAc修饰水平升高≥1.5倍，富集于蛋白质折叠、药物应答和细胞内蛋白运输等过程，提示这些蛋白的O-GlcNAc修饰可能参与调节滋养细胞合体化或STB的功能。 该数据库中胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)是O-GlcNAc修饰水平随FSK处理升高最为显著的蛋白，它是哺乳动物细胞中H2S合成的主要限速酶。既往有报道显示CSE表达异常与胎盘功能障碍及PE等妊娠疾病相关联;前列腺细胞中H2S能够阻碍雄激素受体AR的信号通路;而胎盘STB是孕期雄激素的重要合成来源。这些线索促使进一步探究O-GlcNAc修饰的CSE在滋养层细胞中的功能机制。先采用化学酶法标记O-GlcNAc修饰蛋白，通过“ChickChemistry”实验确定CSE的O-GlcNAc修饰水平随FSK处理的动态特征，发现FSK可以快速诱导CSE蛋白发生O-GlcNAc修饰，并可长时间稳定保持高水平修饰状态。进而利用LC-MS/MS质谱及特异位点突变实验，证实Ser138是CSE蛋白的核心O-GlcNAc修饰位点，该位点的O-GlcNAc修饰可增强滋养层细胞中CSE的酶活性，以促进H2S的生成。NaHS（H2S的前体）处理或CSE过表达质粒(WT-CSE)转染BeWo细胞，均可提高细胞中H2S水平并显著抑制FSK诱导的滋养层合体化，而转染Ser138位点突变的CSE质粒(Ser138-CSE)则降低细胞中H2S的产生并增强FSK诱导的滋养层合体化。为了探究CSE调节滋养层合体化的机制，先分析了睾酮(T0)是否参与调节滋养层合体化，发现T0的作用在于协同FSK，进一步提高滋养层合体化水平。NaHS或转染WT-CSE质粒则可以显著抑制BeWo细胞中AR的二聚化，阻碍T0诱导的滋养层合体化;而转染Ser138-CSE质粒不能抑制AR的二聚化，反而进一步增强T0诱导的滋养层合体化。上述结果表明滋养层细胞中FSK在诱发滋养层合体化的同时，通过诱导CSE蛋白的O-GlcNAc修饰，抑制AR的二聚化而阻碍T0的促合体化作用，由此形成了滋养层细胞分化的负反馈调节。 在建立的滋养层细胞O-GlcNAc数据库中，转录因子GATA3是FSK诱导发生O-GlcNAc修饰的蛋白之一。生物信息学分析及文献报道提示GATA3可能调节类固醇激素合成关键限速酶基因HSD3B1（编码3β-HSD1）和HSD17B3（编码17β-HSD3）的表达。通过CHIP实验证明，人滋养层细胞中GATA3可直接结合到HSD3B1和HSD17B3的转录起始位点上游，并促进其转录，过表达GATA3能显著提高HSD3B1和HSD17B3表达。进一步的质谱实验及位点突变实验显示Thr322为GATA3的核心O-GlcNAc修饰位点，该位点的O-GlcNAc修饰能增强GATA3蛋白的稳定性;Thr322位点突变显著抑制GATA3对HSD3B1和HSD17B3基因表达的调节，并降低滋养层细胞中T0的合成。 子痫前期是危害孕妇及胎儿发育的重大妊娠并发症，与滋养层细胞分化和功能异常密切相关。在早发型子痫前期患者(E-PE)胎盘中，发现CSE蛋白水平低于其周龄匹配的对照胎盘(PTL)组，但O-GlcNAc修饰的CSE蛋白水平以及H2S产量却显著高于PTL组，与之密切关联的是，滋养层合体化水平显著低于PTL组。另一方面，E-PE胎盘中3β-HSD1、17β-HSD3、O-GlcNAc修饰的GATA3水平以及T0水平均显著高于PTL组，相关性分析表明E-PE胎盘中O-GlcNAc修饰的GATA3的水平与T0浓度呈现显著正相关。这些结果表明CSE和GATA3蛋白O-GlcNAc修饰的异常可能参与滋养层细胞分化和功能障碍。 综上所述，本研究首次建立了人胎盘滋养层细胞O-GlcNAc修饰蛋白数据库，并发现PKA信号在诱发滋养层合体化的同时，通过诱导包括CSE和GATA3等蛋白的O-GlcNAc修饰，实现对合体化进程以及STB内分泌功能的精细调控;而滋养层细胞中蛋白O-GlcNAc修饰的异常可能与子痫前期等妊娠疾病的发生密切关联。这些结果对理解胎盘发育的翻译后调控机制提供了重要基础，并有望为胎盘相关妊娠疾病的诊治策略提供新思路。 收起