中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 夏丹丹上海海洋大学 2016年硕士导师: 马爱军共76页

摘要 : 大菱鲆C-型凝集素（SmLec1）和Lily型凝集素（SmLTL）都是重要的免疫因子，具有重要的生理、生化及免疫功能，本文通过基因克隆、组织表达和蛋白重组等方法分析这两种凝集素的活性特点，以及环境胁迫对其表达调控的影响，探讨这两种凝集素在大菱鲆先天... 展开大菱鲆C-型凝集素（SmLec1）和Lily型凝集素（SmLTL）都是重要的免疫因子，具有重要的生理、生化及免疫功能，本文通过基因克隆、组织表达和蛋白重组等方法分析这两种凝集素的活性特点，以及环境胁迫对其表达调控的影响，探讨这两种凝集素在大菱鲆先天免疫应答过程中的潜在功能以及养殖环境中的应用具有重要的意义。 1通过 SmLTL的基因克隆、结构分析和组织表达，对其特性进行分析，为大菱鲆Lily型凝集素的进一步研究奠定理论基础。通过RACE技术克隆得到大菱鲆Lily型凝集素的cDNA全长为569bp，包括编码112个氨基酸的336bp开放阅读框。根据组织的qPCR分析显示，SmLTL mRNA的于皮肤，鳃，肠的表达量显著，在其他组织的表达量不显著。通过生物信息软件随其进行分析，结果显示：SmLTL在第30-99个氨基酸处有两个个甘露糖结合位点（QxDxNxVxY）和一个特殊位点 TxTxGxRxV形成一个β-棱镜架构（x是任何氨基酸残基1）。对SmLTL的一级，二级和三级结构进行了预测，并通过生物工程软件进行分析，显示SmLTL蛋白质是亲水性蛋白，含有5.36％α-螺旋，39.29％延伸链，16.07％β-折叠和39.29％无规卷曲，有三个反式β-折叠，3个蛋白结合位点。 2本研究通过环境胁迫实验、蛋白重组和凝集实验，对 SmLTL的功能展开深层次的研究，为大菱鲆疾病预防和控制新途径打下基础。通过环境胁迫对SmLTL表达水平的调控实验（包括高温和盐度），结果显示皮肤、肠和鳃具有显著的变化。重组SmLTL蛋白在大肠杆菌系统中能够凝集小鼠血细胞且没有钙依赖性，在D-甘露糖存在的情况下被抑制。另外，SmLTL表现出对爱德华氏菌和鳗弧菌的凝集活性。同时SmLTL对纤毛虫具有杀伤性作用，浓度为100μgml-1在24小时后能致死60%的的纤毛虫。同时我们发现感染纤毛虫后的SmLTL的鳃、皮肤和肠的mRNA表达量显著增加。 3通过对大菱鲆C-型凝集素进行环境胁迫实验、蛋白重组和凝集实验，进一步了解其功能特性，为大菱鲆 C-型凝集素在实际生产和养殖中的应用作为理论性指导基础。实验利用原核表达系统进行重组表达，并通过纯化获得重组目的蛋白，活性分析结果显示：重组 C-型凝集素在所选6种细菌中对鳗弧菌和爱德华氏菌具有明显的凝集作用；在选取的8种糖中木糖、果糖、蔗糖、乳糖和甘露糖能够抑制SmLec1的凝集活性；理化因子PH和温度均对SmLec1的凝集活性产生影响；鳗弧菌感染实验显示，感染6h时SmLec1表达量明显上升，在12h时达到最高值，随后有所下降；温度胁迫时肝组织的SmLec1mRNA表达量受到温度的影响显著，在19℃开始升高，22℃到27℃呈降低趋势，其他组织变化不显著。盐度胁迫时SmLec1在各盐度的表达量变化不显著。研究结果表明，SmLec1能够抑制鳗弧菌的感染，其表达受到温度的影响，本研究将为进一步研究大菱鲆C-型凝集素蛋白的抗菌机理和探索对大菱鲆疾病的免疫学防治途径提供科学依据。大菱鲆C-型和Lily型凝集素是重要的免疫因子，本文通过分析其活性特点，并且首次通过大菱鲆环境胁迫对这两种基因表达调控的影响分析实验，探讨这两种凝集素在大菱鲆先天免疫应答过程中的潜在功能以及养殖环境中的应用。收起

关键词 : C-型凝集素 Lily型凝集素基因克隆组织表达大菱鲆

2. 淇河鲫凝集素CaNTC、CaCLR和CaGal-9基因克隆、组织表达及其免疫功能研究

[学位论文] 王莉河南师范大学 2018年博士导师: 孔祥会共157页

摘要 : 淇河鲫(Qihe crucian carp，Carassius auratus)为天然三倍体鱼类，是河南省特有的优质水产品种之一。近年来，伴随养殖密度增加，病害种类增多，淇河鲫免疫力明显下降，造成较大经济损失。作为低等脊椎动物，淇河鲫特异性免疫尚不完善，非特异性免疫... 展开淇河鲫(Qihe crucian carp，Carassius auratus)为天然三倍体鱼类，是河南省特有的优质水产品种之一。近年来，伴随养殖密度增加，病害种类增多，淇河鲫免疫力明显下降，造成较大经济损失。作为低等脊椎动物，淇河鲫特异性免疫尚不完善，非特异性免疫尤为重要。开展淇河鲫非特异免疫机制研究，可有效防控鱼病发生。在鱼类非特异性免疫中，凝集素扮演着重要角色。凝集素通过介导蛋白质-碳水化合物的相互作用而成为非特异性免疫的重要组成部分，在提高机体免疫方面发挥了重要作用。弄清鱼类凝集素在非特异性免疫和抗菌中的作用，对于有效控制鱼病的发生具有重要意义。本研究以淇河鲫为研究对象，克隆三种凝集素基因CaNTC、CaCLR及CaGal-9，对其分子特征、组织分布、表达响应及免疫功能进行系统研究。取得主要结果如下: (1)淇河鲫C-型凝集素CaNTC基因克隆、组织表达及免疫功能研究 CaNTC的cDNA全长776bp，包含5'非编码区152bp、开放阅读框492bp和3'非编码区132bp，编码163个氨基酸。氨基酸序列包含1个信号肽和1个CRD结构域。CRD中含有四个保守的半胱氨酸残基(Cys57-Cys150，Cys126-Cys142)和影响糖结合特异性的保守基序EPN-WND。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同组织器官中CaNTC表达，结果显示，CaNTC在肝脏中表达量最高，头肾、脾脏、鳃和血液中次之;肾脏、皮肤、脑、肠及心脏中表达水平较低;肌肉表达量最低。其在不同组织器官中呈组成型表达，且具有明显的组织特异性。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和PolyI∶C攻毒后，淇河鲫鳃、肝、脾、肾及头肾中CaNTC呈现出明显的表达上调。大肠杆菌重组表达系统获得CaNTC重组蛋白(rCaNTC)，将其免疫小鼠获得多克隆抗体。在获得rCaNTC和多克隆抗体的基础上，通过ELISA检测发现rCaNTC与LPS和PGN有较强的结合能力;Western blot结果显示，rCaNTC可结合实验中所有受试细菌(嗜水气单胞菌、大肠杆菌、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及溶壁微球菌)。而rCaNTC必须在Ca2+存在的情况下，才能凝集兔红细胞和3种细菌(嗜水气单胞菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)。同时在体实验发现，rCaNTC可促进淇河鲫对嗜水气单胞菌的清除。研究表明，CaNTC作为模式识别受体，可通过识别致病菌表面的糖类结构脂多糖和肽聚糖，进而结合和凝集致病菌，并可促进鱼体清除致病菌，在淇河鲫免疫防御过程中发挥重要功能。 (2)淇河鲫C．型凝集素受体CaCLR基因克隆、组织表达及免疫功能研究 CaCLR的cDNA全长1130bp，其中开放阅读框为792bp，编码263个氨基酸，包含1个跨膜区和1个CRD结构域。 qRT-PCR方法检测不同组织器官中CaCLR的表达，结果显示，CaCLR在淇河鲫11种组织器官中均有表达，且头肾中表达量最高。嗜水气单胞菌和PolyI∶C攻毒后，淇河鲫鳃、肝、脾、肾及头肾中CaCLR的mRNA表达水平明显上调。采用Western blot的方法，在淇河鲫各组织中均检测到CaCLR蛋白，其中头肾和肝脏中表达量较高，脾脏、肾脏及血液次之，鳃、肠、心脏及脑中表达量较低。原核表达系统获得CaCLR重组蛋白(rCaCLR)，将其免疫小鼠获得多克隆抗体。rCaCLR对兔和淇河鲫红细胞及实验中的7种微生物均无凝集活性。但ELISA实验发现，rCaCLR对脂多糖、肽聚糖、β-葡聚糖及甘露聚糖4种PAMPs均具有识别和结合活性。同时Western blot结果显示，除金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌外，rCaCLR可结合其它所有受试微生物。采用抗体封闭方法检测到CaCLR可促进淇河鲫外周血白细胞对嗜水气单胞菌的吞噬作用。研究表明，CaCLR作为一种C-型凝集素受体，在致病菌侵染淇河鲫的过程中，起到模式识别受体的作用。通过识别致病菌表面的糖类结构，发挥调理素作用促进吞噬细胞对致病菌的吞噬和清除。 (3)淇河鲫半乳糖凝集素CaGal-9基因克隆、组织表达及免疫功能研究 CaGal-9的cDNA全长1318bp，包括5'非编码区58bp、开放阅读框963bp和3'非编码区297bp，编码320个氨基酸;预测CaGal-9蛋白结构域显示，无信号肽，无跨膜区，含2个串联的CRD结构域(CRD-1和CRD-2)。 qRT-PCR方法检测不同组织器官中CaGal-9的表达，结果显示，CaGal-9在脾脏中表达量最高，鳃、皮肤、血液、心脏及脑中较低，肌肉中表达量最低。嗜水气单胞菌和PolyI∶C感染后，淇河鲫5种免疫相关组织中CaGal-9的mRNA表达水平明显上升。通过Western blot检测发现CaGal-9蛋白在肠中表达量最高，脾脏和肾脏次之，鳃、肝脏、头肾、心脏及脑中表达量较低。采用原核表达系统获得重组蛋白rCaGal-9、rCRD-1和rCRD-2，rCaGal-9免疫小鼠获得多克隆抗体。在无Ca2+的情况下，rCaGal-9、rCRD-1和rCRD-2均可凝集兔红细胞及全部受试微生物(酿酒酵母、嗜水气单胞菌、大肠杆菌、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及溶壁微球菌)。通过糖抑制兔红细胞凝集实验可知，rCaGal-9、rCRD-1和rCRD-2均可结合半乳糖、氮乙酰半乳糖胺、乳糖、脂多糖、肽聚糖和β-葡聚糖。Western blot检测结果显示，rCaGal-9和rCRD-1结合所有的受试微生物，rCRD-2结合除枯草芽孢杆菌和溶壁微球菌外的所有受试微生物。CaGal-9全长及单个结构域CRD-1或CRD-2，均具有红细胞凝集、糖识别及结合、微生物结合及凝集活性。但与单个CRD)相比，上述免疫功能，CaGal-9的活性更强，识别范围更广。 rCaGal-9对嗜水气单胞菌和大肠杆菌具备明显的抑菌活性。在体实验发现，rCaGal-9可促进淇河鲫对嗜水气单胞菌的清除作用。嗜水气单胞菌感染后rCaGal-9可提高淇河鲫存活率。研究表明淇河鲫CaGal-9作为模式识别受体，通过识别嗜水气单胞菌表面的糖类结构，结合和凝集该致病菌，抑制其生长，并可促进淇河鲫将嗜水气单胞菌清除出体外。本研究根据课题组淇河鲫转录组数据，筛选出嗜水气单胞菌感染后表达明显上调的三种凝集素基因CaNTC、CaCLR及CaGal-9。采用RT-PCR和RACE技术获得cDNA全长，在mRNA和蛋白水平对这三种凝集素基因进行系统研究。结果发现它们在分子结构方面各有特点，且在病原微生物感染淇河鲫的过程中发挥各自的免疫功能。对淇河鲫三种凝集素分子特征、组织表达及识别、凝集和清除病原微生物的分子机制研究，有助于理解鱼类非特异性免疫的分子基础，对于提高鱼类免疫水平和防控疾病发生具有重要的理论意义和应用价值。收起

关键词 : 淇河鲫 C-型凝集素 C-型凝集素受体半乳糖凝集素基因克隆组织表达免疫功能

3. 竹叶青蛇毒C-型凝集素的结构研究

[学位论文] 许强中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所 2000年博士导师: 王克夷共117页

摘要 : 首先,研究者采用酸处理Sepharose亲和柱分离纯化竹青蛇毒凝集素蛋白(TSL),并用C8-HPLC反相柱进一步纯化TSL.根据N端氨基酸序列结果,设计简并引物对逆转录产物cDNA进行"巢式"PCR扩增.通过cDNA测序,逆推得到TSL成熟蛋白序列.同时,研究者还利用锚式PCR(L... 展开

关键词 : 蛇毒 C型凝集素序列表达模建

4. 缢蛏C型凝集素基因ScCTL-1和ScCTL-2的克隆鉴定与免疫功能研究

[学位论文] 蓝天一上海海洋大学 2018年硕士导师: 李家乐;牛东红共61页

摘要 : 缢蛏（Sinonovacula constricta）是我国重要的海水养殖贝类之一。近年来，随着缢蛏高密度养殖的发展和养殖环境的不断恶化，细菌性疾病成为了缢蛏养殖中的一大问题。研究表明，C型凝集素（C-type lectin）作为一种模式识别受体（Pattern recognition... 展开缢蛏（Sinonovacula constricta）是我国重要的海水养殖贝类之一。近年来，随着缢蛏高密度养殖的发展和养殖环境的不断恶化，细菌性疾病成为了缢蛏养殖中的一大问题。研究表明，C型凝集素（C-type lectin）作为一种模式识别受体（Pattern recognition receptor，PRR），广泛参与贝类的免疫防御机制，在贝类免疫中占据着重要的地位。但目前为止，在缢蛏中尚少有关于 C 型凝集素研究的报道。本文克隆了2个缢蛏C型凝集素基因，并对它们的mRNA表达模式以及重组蛋白的免疫功能进行了研究。 1．从之前构建的缢蛏转录组文库中获得了2个C型凝集素基因ScCTL-1和ScCTL-2的序列片段，使用RACE-PCR技术克隆得到它们的cDNA全长序列。序列分析结果表明，ScCTL-1基因cDNA全长2370bp，包含一个长度为1899bp的开放阅读框（Openreading frame，ORF），编码632个氨基酸，蛋白相对分子量约为70.22kDa；ScCTL-2基因cDNA全长2194bp，包含一个长度为1893bp的ORF，编码630个氨基酸，蛋白相对分子量约为70.38kDa。结构域预测结果表明，ScCTL-1具有1个N端信号肽、4个C型凝集素结构域（C-typelectin domain，CTLD）以及1个C端跨膜区；ScCTL-2具有1个N端跨膜区以及4个CTLD。二者均含有4个CTLD，在序列结构上具有一定的相似性。2个C型凝集素的所有CTLD均含有6个完全保守的半胱氨酸，属于“长型”CTLD。在ScCTL-1靠近N端的第3个CTLD以及ScCTL-2靠近N端的第3、4个CTLD中，糖结合作用位点的氨基酸组成与脊椎动物甘露糖结合专一性CTLD完全一致，预示着这3个CTLD的糖结合专一性可能为甘露糖型。 2．通过荧光定量PCR检测了缢蛏C型凝集素基因ScCTL-1和ScCTL-2在健康缢蛏 7 种组织以及受金黄色葡萄球菌和鳗弧菌感染缢蛏血细胞中的表达情况。分析结果表明，ScCTL-1和ScCTL-2在健康缢蛏肝胰腺中的表达量均显著高于其它组织（P＜0.05）；ScCTL-2在健康缢蛏鳃中的表达量显著高于较除肝胰腺外的其余5种组织（P＜0.05）。ScCTL-1和ScCTL-2在健康缢蛏各组织中表达量的分布情况预示着二者均可能与缢蛏免疫相关。在受金黄色葡萄球菌与鳗弧菌感染的缢蛏血细胞内，ScCTL-1和ScCTL-2的表达量均出现上调的现象。ScCTL-1在缢蛏感染金黄色葡萄球菌后4h、24h的表达量显著高于攻毒前（P＜0.05）；在缢蛏感染鳗弧菌后4h、12h的表达量显著高于攻毒前（P＜0.05）；感染两种细菌后的表达量变化均出现二次上调的过程。ScCTL-2在缢蛏感染金黄色葡萄球菌后4-24h的表达量均显著高于攻毒前（P＜0.05），并且表现出逐渐上升的趋势；在缢蛏感染鳗弧菌后8h、12h的表达量显著高于攻毒前（P＜0.05），并在24h回落至初始水平。ScCTL-1和 ScCTL-2 在受细菌感染缢蛏血细胞中表达量的变化不仅体现了二者均为缢蛏的免疫相关基因，同时也反应出两个基因在缢蛏应对不同病原生物的入侵时可能存在的不同的反应机制。 3．在大肠杆菌内表达了2个基因的重组蛋白rScCTL-1和rScCTL-2，基于获得的重组蛋白对两个基因的免疫功能进行研究。研究结果表明，rScCTL-2 对实验采用的6种细菌（真菌）具有严格Ca2+依赖的广谱凝菌活性。rScCTL-1对金黄色葡萄球菌和鳗弧菌具有Ca2+依赖的结合和凝集活性。病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）结合实验结果表明，rScCTL-1对细菌的结合活性与其PAMP结合活性密切相关，ScCTL-1依靠识别病原生物表面的PAMP对它们进行结合或凝集。促吞噬实验发现rScCTL-1具有促进缢蛏血细胞吞噬细菌的能力，这种促吞噬活性具有细菌特异性并且为Ca2+相关，这一现象表明rScCTL-1的促吞噬活性是依靠 CTLD 对细菌的结合实现的。从重组蛋白的免疫特性分析，ScCTL-1 具有与脊椎动物巨噬细胞甘露糖受体相似的免疫活性，可能在缢蛏体内发挥着与其相类似的功能。收起

关键词 : 凝集素基因缢蛏 C型凝集素免疫功能原核表达

5. 草鱼（Ctenopharyngodon idella）胶原凝集素（collectin）和转铁蛋白（transferrin）功能的初步分析

[学位论文] 李琴南昌大学 2010年硕士导师: 胡成钰共42页

摘要 : 本研究从已构建的草鱼(Ctenopharyngodon idella)肝肾cDNA文库中筛选到1个克隆,经测序和特征分析确定为草鱼胶原凝集素基因(GQ141696)。草鱼胶原凝集素全长cDNA为1128 bp,其中5’非编码区229 bp,3’非翻译区104 bp,最大开放阅读框为795 bp,编码1个264... 展开

关键词 : 草鱼 C-型凝集素胶原凝集素转铁蛋白

6. 柞蚕凝集素基因ApCTL的克隆及表达分析

[学位论文] 吕明珠大连理工大学 2018年硕士导师: 李文利共78页

摘要 : 柞蚕作为无脊椎动物，不具备获得性免疫，主要依赖发达的天然免疫系统抵御病原微生物的入侵。昆虫的天然免疫系统主要包括物理防御、体液免疫和细胞免疫三个部分。天然免疫始于对病原微生物的识别，这一过程是通过昆虫体内的模式识别受体识别并结合病... 展开柞蚕作为无脊椎动物，不具备获得性免疫，主要依赖发达的天然免疫系统抵御病原微生物的入侵。昆虫的天然免疫系统主要包括物理防御、体液免疫和细胞免疫三个部分。天然免疫始于对病原微生物的识别，这一过程是通过昆虫体内的模式识别受体识别并结合病原微生物表面特有的模式分子实现的。模式识别受体与病原体相关性分子模式的相互作用会诱导一系列免疫应答反应，包括吞噬作用、黑化作用及产生抗菌肽、抗病毒因子等，从而激活宿主的防御系统。由于其结合碳水化合物的能力，凝集素在许多生物过程中都起着重要作用,包括蛋白质合成和运输，细胞信号传导，病原微生物识别等。凝集素作为一种模式识别受体，序列中含有特异性碳水化合物识别结构域CRD，不同的CRD具有特有的结构并能够识别病原微生物表面特定的模式分子，从而激活昆虫免疫防御系统。其中C型凝集素是天然免疫模式识别受体的一个主要家族，也是最大的动物凝集素家族之一，其对病原体表面上的糖蛋白和糖脂都有很好的结合能力。本研究以5种微生物对柞蚕蛹进行诱导处理，检测了柞蚕凝集素基因的诱导表达情况，探索凝集素基因在不同诱导条件下在不同组织中的表达差异，为深入研究凝集素在柞蚕免疫系统中的作用机制及激活途径提供参考。实时定量PCR结果表明，在不同病原微生物处理下，柞蚕不同组织中各类凝集素的表达水平有明显差异。生物信息学结果显示，ApCTL基因全长912bp，编码304个氨基酸，1-16位氨基酸为信号肽，序列含有两个保守的碳水化合物识别结构域，每个结构域分别含有特异性结合的三肽基序，属于C型凝集素超家族的一员。将凝集素基因ApCTL克隆到柞蚕核型多角体病毒转移表达载体pApM748BE中，然后用重组质粒pApM748BE-CTL与重组病毒ApNPV-Δph/egfp+基因组DNA共转染培养Tn-Hi5细胞，用末端稀释法筛选重组病毒，感染柞蚕蛹。采用SDS-PAGE和Western blot方法检测目的基因在柞蚕蛹中的表达。凝集活性分析结果显示：ApCTL是一种Ca2+依赖型的凝集素，对细菌和兔血红细胞都有很好的凝集活性。收起

关键词 : 柞蚕 C型凝集素基因表达凝集活性

7. C-型凝集素类似蛋白基因筛选、结构测定和初步表达研究

[学位论文] 余红秀中国科学技术大学 2002年硕士导师: 刘兢共75页

摘要 : 通过放射性标记DNA探针筛选和聚合酶链式反应克隆筛选,从皖南尖吻蝮蛇毒腺的λgtllcDNA文库中,克隆得到了11个编码c型凝集素类似蛋白亚单位的cDNA.在得到Agkisacutacin的A、8链cDNA的基础上,将这两者克隆到表达载体pEGFP-Nl中,得到两种重组质粒pEGFP-... 展开

关键词 : 蛋白基因 C型凝集素结构测定筛选

8. 赤拟谷盗CTL-S型凝集素TcCTL5与TcCTL13以及半乳糖凝集素的功能研究

[学位论文] 李嘉南京师范大学 2021年硕士导师: 李斌共93页

摘要 : 模式昆虫赤拟谷盗是一种严重影响农作物储存的储粮害虫，对它的先天免疫的研究不仅能揭示鞘翅目昆虫先天免疫调控机制，还能为害虫防治提供新的策略。凝集素是昆虫启动先天免疫的一类重要的模式识别受体，其中C型凝集素(C-type lectins,CTLs)分... 展开模式昆虫赤拟谷盗是一种严重影响农作物储存的储粮害虫，对它的先天免疫的研究不仅能揭示鞘翅目昆虫先天免疫调控机制，还能为害虫防治提供新的策略。凝集素是昆虫启动先天免疫的一类重要的模式识别受体，其中C型凝集素(C-type lectins,CTLs)分为三类：CTL-S型凝集素、IML型凝集素和CTL-X型凝集素。赤拟谷盗中CTL-S型凝集素的数量是最多的，他们大多数还未被研究，其可能在赤拟谷盗先天免疫和生长发育发挥重要作用。半乳糖凝集素(galactoside-binding lectins，GALEs)最早在哺乳动物中发现，目前有关昆虫半乳糖凝集素的功能研究较少。因此本文探究了两个CTL-S型凝集素（TcCTL5和TcCTL13）以及三个半乳糖凝集素（TcGALE1、TcGALE2和TcGALE3）在昆虫赤拟谷盗先天免疫防御的作用。研究结果如下： 1.赤拟谷盗CTL-S型凝集素和半乳糖凝集素的序列特征及进化关系赤拟谷盗基因组CTL-S型凝集素共10个，其中TcCTL5、TcCTL6和TcCTL13聚为紧密亚枝，它们具有四种motifs是这三个基因所特有的，这可能暗示它们具有其它CTL-S不具备的功能。CTL-S型凝集素的系统发育分析发现，在我们所研究的五种昆虫中均存在TcCTL5和TcCTL13的直系同源基因，而在豌豆蚜(Acyrthosiphum pisim)和体虱(Pediculus humanus)中不存在TcCTL6直系同源基因。氨基酸序列分析发现TcCTL3和TcCTL4具有相同种类的motifs，但TcCTL3所包含的motif的数量恰好是TcCTL4的两倍，这暗示TcCTL3和TcCTL4可能有共同的祖先基因。昆虫半乳糖凝集素系统发育分析表明这些半乳糖凝集素在物种分化之前形成，聚类为三簇。赤拟谷盗中存在三个半乳糖凝集素分别位于这三簇各一个，根据半乳糖凝集素结构域的数量我们将这些GALEs分为三个组；GALE-S，GALE-D，GALE-X。 2.赤拟谷盗CTL-S型凝集素（TcCTL5和TcCTL13）的生理功能研究时期表达模式显示，TcCTL5在晚期蛹时期表达量最高，TcCTL13在各个发育阶段都有表达。组织表达谱显示TcCTL5和TcCTL13在血淋巴、中枢神经系统高表达，干扰TcCTL5后35%赤拟谷盗幼虫死亡，剩下的赤拟谷盗能成功羽化为成虫，但它们丧失了运动能力、膜翅铰链发黑，腿部关节不灵活。幼虫期干扰TcCTL13后，所有的赤拟谷盗发育停滞不能成功蛹化然后死亡，晚期蛹干扰TcCTL13，所有的赤拟谷盗不能成功羽化并在羽化过程死亡，我们的实验验证了CTL-S型凝集素所具备的多样化的生理功能。细菌和细菌多糖的刺激会引起TcCTL5和TcCTL13高表达，进一步实验发现TcCTL5和TcCTL13重组蛋白能结合细菌多糖LPS和PGN并且这种结合呈现浓度依赖性。在高钙离子组，TcCTL5和TcCTL13能直接结合并凝集五种被测细菌。此外，TcCTL5干扰会抑制stat(JAK/STAT)转录因子的表达从而抑制att1和def2等五种抗菌肽的表达，TcCTL13干扰会抑制rel(IMD)转录因子的表达从而严重影响att1和att3等八种抗菌肽的合成。综上，TcCTL5和TcCTL13参与赤拟谷盗的先天免疫和生长发育，它们可以作为重要的靶标为害虫防治提供生物策略。 3.赤拟谷盗半乳糖凝集素的功能研究在赤拟谷盗中共有三个半乳糖凝集素基因（TcGALE1、TcGALE2和TcGALE3），组织表达谱显示，这三个半乳糖凝集素主要在中枢神经系统和血淋巴中高表达，细菌和细菌细胞壁组分刺激会引起TcGALE1、TcGALE2和TcGALE3上调表达。重组TcGALE1、TcGALE2和TcGALE3蛋白能与细菌细胞壁组分结合并呈现浓度依赖，此外，重组的半乳糖凝集素蛋白还能直接结合被测的五种细菌进而凝集它们，这些结果表明半乳糖凝集素TcGALE1、TcGALE2和TcGALE3在赤拟谷盗的先天免疫中发挥作用。收起

关键词 : 储粮害虫先天免疫机制 C型凝集素半乳糖凝集素

9. 缢蛏2个凝集素基因克隆、表达及在免疫和摄食中功能研究

[学位论文] 徐晓荣宁波大学 2020年硕士导师: 徐继林;廖凯共73页

摘要 : 凝集素能识别外源颗粒，如微藻和致病菌，在无脊椎动物中参与免疫识别、细胞吞噬和免疫清除等生理过程。本文以我国重要的滩涂养殖贝类缢蛏（Sinonovaculaconstricta）为研究对象，克隆了缢蛏C型凝集素（ScCL）和半乳糖凝集素（ScGL），并对它们的mRN... 展开凝集素能识别外源颗粒，如微藻和致病菌，在无脊椎动物中参与免疫识别、细胞吞噬和免疫清除等生理过程。本文以我国重要的滩涂养殖贝类缢蛏（Sinonovaculaconstricta）为研究对象，克隆了缢蛏C型凝集素（ScCL）和半乳糖凝集素（ScGL），并对它们的mRNA表达模式和功能进行了研究。 1.利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了半乳糖凝集素（ScGL），全长为1282bp，开放阅读框（ORF）为918bp。ScGL具有2个碳水化合物识别结构域（CRD）。氨基酸序列比对显示，ScGL与菲律宾蛤仔（Venerupisphilippinarum）的半乳糖凝集素相似性较高（65%），与已报道的2个缢蛏半乳糖凝集素相似性较低，分别为39.74%和44.76%。进化树构建显示，ScGL与菲律宾蛤仔半乳糖凝集素聚为一支。重组表达发现ScGL在包涵体表达，分子量约34.4kDa。组织表达规律显示，ScGL在缢蛏鳃、血细胞、肠、唇瓣、外套膜、出水管、入水管、足和消化腺中均表达，其中肠、内脏团、唇瓣和足中表达量较高，出水管和入水管中表达量最低。摄食试验显示，鳃组织ScGL表达对小球藻（Chlorellavulgaris）和假微型海链藻（Thalassiosirapseudonana）均有显著响应，说明ScGL可能参与了缢蛏对微藻的识别和选择。消化腺ScGL表达量分别在金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）感染后3和48h显著高于对照组；鳃ScGL表达量分别在鳗弧菌（Vibrioharveyi）和金黄色葡萄球菌感染后6和48h显著高于对照组，说明ScGL参与了病原菌诱导的缢蛏免疫应答。 2.利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了C型凝集素（ScCL），全长为1645bp，ORF为822bp。ScCL具有1个CRD。氨基酸序列比对显示，ScCL与大竹蛏（Solengrandis）的C型凝集素相似性较高（69.77％），与已报道的2个缢蛏C型凝集素相似性较低，分别为24.80%和23.02%。进化树构建显示，ScCL与大竹蛏C型凝集素聚为一支。重组表达发现ScCL在包涵体表达，分子量约31.7kDa。组织表达规律显示，ScCL在缢蛏鳃、血细胞、肠、唇瓣、外套膜、出水管、入水管、足和消化腺中均表达，其中在足中表达量最高。摄食试验显示，鳃组织ScCL表达对小球藻和假微型海链藻均有显著响应，说明ScCL可能参与了缢蛏对微藻的识别和选择。鳃ScCL表达对金黄色葡萄球菌有显著响应，说明ScCL参与了病原菌诱导的缢蛏免疫应答。通过对ScCL功能和特性进一步分析发现，ScCL的凝集活性不依赖Ca2+。凝集试验显示，ScCL能凝集假微型海链藻、小球藻、角毛藻（Chaetocerossp.）、亚心形扁藻（Platymonassubcordiformis）和微拟球藻（Nannochloropsissp.），不凝集湛江等鞭金藻（Isochrysiszhanjiangensis）；ScCL也能凝集金黄色葡萄球菌和哈维氏弧菌（Vibrioanguillarum），不凝集鳗弧菌、副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）和蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）。结合试验显示，ScCL能结合金黄色葡萄球菌和哈维氏弧菌，不能结合鳗弧菌、副溶血弧菌和蜡样芽孢杆菌。此外，ScCL可以与LPS、LTA和甘露糖结合，不能与PGN结合，且ScCL对LPS和甘露糖的结合能力比LTA强。本研究为深入探究缢蛏C型凝集素和半乳糖凝集素在摄食和免疫中的作用奠定了理论基础。收起

关键词 : 缢蛏 C型凝集素半乳糖凝集素摄食选择免疫应答

10. 两种新型家蚕凝集素基因的克隆及表达

[学位论文] 郭旭华中师范大学 2010年硕士导师: 刘绪生共52页

摘要 : 在昆虫的免疫中，识别蛋白参与到对病原体的识别中。C型凝集素(C-type Lectin)是先天性免疫的模式识别受体，其含有1个或者多个糖基识别域(carbohydrate-recognition domain，CRD)。由于Ca2+在此类凝集素中是很重要的，所以此类凝集素称为C型凝集素。... 展开在昆虫的免疫中，识别蛋白参与到对病原体的识别中。C型凝集素(C-type Lectin)是先天性免疫的模式识别受体，其含有1个或者多个糖基识别域(carbohydrate-recognition domain，CRD)。由于Ca2+在此类凝集素中是很重要的，所以此类凝集素称为C型凝集素。C型凝集素在识别微生物表面的糖分子后，会通过激活体内免疫系统来清除入侵的微生物。本文以鳞翅目昆虫家蚕(Bombyx mori)为实验材料，首先鉴定了2个C型凝集素，命名为BmLectin-10和BmLectin-11，然后通过注射微生物的方法研究它们在免疫中的作用。研究结果如下： 1.基因鉴定及序列分析：从家蚕基因组中预测了两个C型凝集素，并用RT-PCR获得了这两个基因cDNA的全长序列。其中BmLectin-10为990bp，含有EPD和EPN基序，分析BmLectin-10的氨基酸序列发现，该蛋白有两个糖识别结构域，一个短型的CRD结构位于N端第16到150个氨基酸，一个长型的CRD结构位于C端第162到301个氨基酸。它的氨基酸序列和含有两个CRD的C型凝集素是很相似的。BmLectin-10的氨基酸序列与烟草天蛾(Manduca sexta)immulectin-2的相似度达到96％，与棉铃虫(Helicoverpa armigera)的相似度达到95％。 BmLectin-11为810bp，含有QPD基序，分析BmLectin-11的氨基酸序列发现，该蛋白质含有一个信号肽，位于第1到21个氨基酸；还有一个CRD结构，位于第45到203个氨基酸，它和短型的CRD相似。BmLectin-11的氨基酸序列与果蝇(Drosophila melanogaster)的相似度达到96％，与冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)的相似度达到95％。 2.组织特异性分析：本文选取五龄家蚕的中肠、头、脂肪体、表皮、马氏管、血淋巴、丝腺等组织，用RT-PCR的方法分析BmLectin-10和BmLectin-11在不同组织中的表达情况，结果发现BmLectin-10在脂肪体中的表达量较高，在表皮和头部中的表达较少；BmLectin-11在脂肪体的表达量高于在表皮中的。其他组织均无表达。 3.C型凝集素对微生物的识别作用：用RT-PCR的方法研究微生物对BmLectin-10和BmLectin-11表达量的影响。结果发现，在大肠杆菌入侵后24h时BmLectin-10的相对表达量升高的极为显著；在酿酒酵母入侵后6h时BmLectin-11的相对表达量显著升高。这说明BmLectin-10可能对G-有特异的识别作用，BmLectin-11对真菌有特异的识别作用，而BmLectin-10和BmLectin-11对G+的识别作用不显著。 4.原核表达：构建重组质粒BmLectin10-pET32a和BmLectin11-pET32a转化表达菌株BL21(DE3)，得到了BmLectin-10和BmLectin-11的重组蛋白。通过分析发现重组蛋白存在于沉淀中，在尿素变性后利用带镍离子的纯化填料进行亲和层析，获得了可溶性的重组蛋白。综上所述，本文对得到的两个新型C型凝集素进行了序列分析，发现BmLectin-10序列和含有两个结构域的C型凝集素相似度很高，而BmLectin-11和含有一个结构域的C型凝集素相似度很高，这说明BmLectin-10和BmLectin-11同属于C型凝集素家族，但是在模式识别方面可能存在差异。注射不同的微生物后发现，BmLectin-10对G-有特异的识别作用，而BmLectin-11对真菌有特异的识别作用。并且本文得到了BmLectin-10和BmLectin-11的重组蛋白，这有利于进行BmLectin-10和BmLectin-11的功能研究，为揭示模式识别蛋白与昆虫免疫之间的关系打下了基础。收起

关键词 : C型凝集素体液免疫原核表达家蚕凝集素基因表达