摘要: 在昆虫的免疫中，识别蛋白参与到对病原体的识别中。C型凝集素(C-type Lectin)是先天性免疫的模式识别受体，其含有1个或者多个糖基识别域(carbohydrate-recognition domain，CRD)。由于Ca2+在此类凝集素中是很重要的，所以此类凝集素称为C型凝集素。... 展开 在昆虫的免疫中，识别蛋白参与到对病原体的识别中。C型凝集素(C-type Lectin)是先天性免疫的模式识别受体，其含有1个或者多个糖基识别域(carbohydrate-recognition domain，CRD)。由于Ca2+在此类凝集素中是很重要的，所以此类凝集素称为C型凝集素。C型凝集素在识别微生物表面的糖分子后，会通过激活体内免疫系统来清除入侵的微生物。 本文以鳞翅目昆虫家蚕(Bombyx mori)为实验材料，首先鉴定了2个C型凝集素，命名为BmLectin-10和BmLectin-11，然后通过注射微生物的方法研究它们在免疫中的作用。研究结果如下： 1.基因鉴定及序列分析：从家蚕基因组中预测了两个C型凝集素，并用RT-PCR获得了这两个基因cDNA的全长序列。其中BmLectin-10为990bp，含有EPD和EPN基序，分析BmLectin-10的氨基酸序列发现，该蛋白有两个糖识别结构域，一个短型的CRD结构位于N端第16到150个氨基酸，一个长型的CRD结构位于C端第162到301个氨基酸。它的氨基酸序列和含有两个CRD的C型凝集素是很相似的。BmLectin-10的氨基酸序列与烟草天蛾(Manduca sexta)immulectin-2的相似度达到96％，与棉铃虫(Helicoverpa armigera)的相似度达到95％。 BmLectin-11为810bp，含有QPD基序，分析BmLectin-11的氨基酸序列发现，该蛋白质含有一个信号肽，位于第1到21个氨基酸；还有一个CRD结构，位于第45到203个氨基酸，它和短型的CRD相似。BmLectin-11的氨基酸序列与果蝇(Drosophila melanogaster)的相似度达到96％，与冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)的相似度达到95％。 2.组织特异性分析：本文选取五龄家蚕的中肠、头、脂肪体、表皮、马氏管、血淋巴、丝腺等组织，用RT-PCR的方法分析BmLectin-10和BmLectin-11在不同组织中的表达情况，结果发现BmLectin-10在脂肪体中的表达量较高，在表皮和头部中的表达较少；BmLectin-11在脂肪体的表达量高于在表皮中的。其他组织均无表达。 3.C型凝集素对微生物的识别作用：用RT-PCR的方法研究微生物对BmLectin-10和BmLectin-11表达量的影响。结果发现，在大肠杆菌入侵后24h时BmLectin-10的相对表达量升高的极为显著；在酿酒酵母入侵后6h时BmLectin-11的相对表达量显著升高。这说明BmLectin-10可能对G-有特异的识别作用，BmLectin-11对真菌有特异的识别作用，而BmLectin-10和BmLectin-11对G+的识别作用不显著。 4.原核表达：构建重组质粒BmLectin10-pET32a和BmLectin11-pET32a转化表达菌株BL21(DE3)，得到了BmLectin-10和BmLectin-11的重组蛋白。通过分析发现重组蛋白存在于沉淀中，在尿素变性后利用带镍离子的纯化填料进行亲和层析，获得了可溶性的重组蛋白。 综上所述，本文对得到的两个新型C型凝集素进行了序列分析，发现BmLectin-10序列和含有两个结构域的C型凝集素相似度很高，而BmLectin-11和含有一个结构域的C型凝集素相似度很高，这说明BmLectin-10和BmLectin-11同属于C型凝集素家族，但是在模式识别方面可能存在差异。注射不同的微生物后发现，BmLectin-10对G-有特异的识别作用，而BmLectin-11对真菌有特异的识别作用。并且本文得到了BmLectin-10和BmLectin-11的重组蛋白，这有利于进行BmLectin-10和BmLectin-11的功能研究，为揭示模式识别蛋白与昆虫免疫之间的关系打下了基础。 收起