中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 王垒山东中医药大学 2018年硕士导师: 高鹏共102页

摘要 : 目的：本研究以鸡胚蛋为原料，通过酶解制备鸡胚肽并考察其抗氧化活性；制备鸡胚肽与微量元素锌的螯合物并考察其抗疲劳及提高免疫力的功能。方法：通过单因素试验法和正交试验法优选鸡胚蛋最佳酶解工艺。使用活性炭对酶解工艺制备出的鸡胚肽进... 展开

关键词 : 鸡胚肽鸡胚肽锌螯合物制备工艺药物活性

2. SPF鸡胚与低免鸡胚在禽流感灭活疫苗生产中的应用研究

[学位论文] 王志方河南农业大学 2010年硕士导师: 贺秀媛;张弦共33页

摘要 : 之前有很多报道表明新城疫病毒在SPF鸡胚中增殖病毒的效果要远远高于在普通低免鸡胚,对于禽流感病毒在SPF鸡胚和低免鸡胚之间的对比还比较少见。而本试验以重组禽流感病毒(HsN1亚型Re-5株)为研究对象,模拟禽流感灭活疫苗生产,通过以SPF鸡胚和普通生产... 展开之前有很多报道表明新城疫病毒在SPF鸡胚中增殖病毒的效果要远远高于在普通低免鸡胚,对于禽流感病毒在SPF鸡胚和低免鸡胚之间的对比还比较少见。而本试验以重组禽流感病毒(HsN1亚型Re-5株)为研究对象,模拟禽流感灭活疫苗生产,通过以SPF鸡胚和普通生产用低免鸡胚分别为生产原料制备灭活油乳苗,从生产的各个阶段到最后成品的免疫效果进行全程进行数据对比分析。从SPF鸡胚与普通生产用低免鸡胚母源抗体及尿囊液无菌检验对比可知普通生产用低免鸡胚存在不同程度的母源抗体而SPF鸡胚均不存在,普通生产用低免鸡胚三个抽检结果中仅1/3无菌生长,而SPF鸡胚的三个批次抽检结果均为3/3无菌生长。通过不同种毒稀释倍数接种SPF鸡胚试验可知,接种SPF鸡胚所用种毒的稀释倍数选取100万为最佳,可以达到灭活疫苗生产用毒株的标准,并且可提高种蛋的利用率,降低生产成本。符合禽流感病毒低致病力特征,对禽类和哺乳动物高度安全,免疫效力高,且适合利用鸡胚大量增殖。本试验采用全手工接种、收获的鸡胚尿囊液,经过初滤去除大分子的杂质,以避免尿囊液中大颗粒分子对灭活剂的消耗。为了能尽可能减少灭活剂甲醛的添加量而又能保证抗原的灭活检验及无菌检验合格,对常规抗原和试验抗原抽样,分别选取O.15％和0.20％两个甲醛浓度进行灭活,以SPF鸡胚生产的试验抗原能够比以普通生产用低免鸡胚生产的常规抗原以更低的甲醛含量达到灭活的目的。半成品检验数据对比中试验抗原灭活前HA、灭活后HA及EID50三项数据均优于常规抗原。以普通生产用低免鸡胚和SPF鸡胚为生产原料模拟禽流感灭活疫苗操作工艺生产抗原并加以各种乳化剂,按照配方的设计,用乳化泵进行充分搅拌制成的油乳剂灭活疫苗,经过物理性状检验,所制的两种疫苗均是乳白色的油包水剂型,粘度小、均一稳定。通过无菌和安全检验,鸡只均无发生任何不良影响,证明两种疫苗对检验鸡均安全。以SPF鸡胚生产的试验灭活疫苗与以普通生产用低免鸡胚生产的常规灭活疫苗相比,各部分HI抗体水平均高于后者。经免疫持续期抗体消长规律的分析发现,试验疫苗HI抗体产生更为稳定,免疫应答符合油乳剂灭活疫苗的要求。通过原料检验、半成品检验和成品检验三个阶段进行数据对比,为目前我国禽流感灭活疫苗生产中提高抗原效价提供技术参考,为今后禽流感灭活疫苗的发展、提高质量寻求新的途径提供试验数据,促进我国兽用生物制品的研制和开发。收起

关键词 : SPF鸡胚低免鸡胚禽流感灭活疫苗

3. C1EIS基因对鸡ESC向雄性生殖细胞分化的调控作用

[学位论文] 连超扬州大学 2016年硕士导师: 李碧春共54页

摘要 : 胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）向雄性生殖细胞的诱导分化受到许多内源性分化因子和外源诱导因素的调控。其中视黄酸(Retinoic acid，RA)、骨形成蛋白4(Bonemorphogenetic protein4，BMP4)等外源诱导培养与Stra8、DAZL等内源基因调控形成复杂... 展开胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）向雄性生殖细胞的诱导分化受到许多内源性分化因子和外源诱导因素的调控。其中视黄酸(Retinoic acid，RA)、骨形成蛋白4(Bonemorphogenetic protein4，BMP4)等外源诱导培养与Stra8、DAZL等内源基因调控形成复杂调控网络共同发挥关键作用。随着对ESC向雄性生殖细分化机制的深入了解，发现存在新基因特异表达，探索这些新基因功能对完善胚胎干细胞诱导体系，治疗不孕不育疾病具有重要意义。本研究利用CRISPR/Cas9高效基因编辑技术实现在鸡上基因敲除，探索精原干细胞特异表达基因C1EIS功能，为阐明生殖细胞发生及分化机制提供高效方法。本文主要研究如下: 1前期通过RNA-seq技术发现C1EIS基因在ESC向SSC分化过程中，存在显著差异表达。通过RT-PCR获得如皋黄鸡C1EIS基因编码区并进行测序验证。生物信息学分析结果表明:C1EIS基因(基因登录号:XM_416004.2)编码144个氨基酸，属于不稳定的脂溶蛋白。C1EIS蛋白无信号肽，主要在细胞核中表达。存在2个O-糖基化位点和1个N-糖基化位点，可能含有磷酸化位点;二级结构中α螺旋占45.14％，β转角占4.17％，伸展片段占15.97，无规则卷曲占34.72％;系统进化树分析显示鸡C1EIS蛋白与绿头鸭进化关系密切，与牛等哺乳类动物同源性较低。 2设计3对特异sgRNA序列，构建CRISPR/Cas9敲除载体。使用含1.7％ DMSO培养基诱导培养细胞48小时后转染CRISPR/Cas9载体。利用菌液PCR，T7E1酶切和TA克隆测序检测CRISPR/Cas9敲除载体活性。结果表明C1EIS基因存在2-3bp碱基缺失，突变效率为20％。CRISPR/Cas9技术能够稳定的在鸡的细胞上实现C1EIS基因突变。利用qPCR克隆C1EIS基因，连接pcDNA3.0过表达载体。利用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切获得C1EIS条带，表明pcDNA3.0-C1EIS过表达载体构建成功。 3分别将CRISPR/Cas9载体，pcDNA3.0-C1EIS过表达载体转染ESC，转染48小时后换RA诱导培养基培养12天。采用形态学观察、免疫化学检测、流式细胞检测和QRT-PCR等方法检测C1EIS缺失与过表达对ESC向SSC分化的影响。结果表明C1EIS缺失的ESC与正常RA诱导组相比，第6天类胚体数目降低57％，且停止向SSC分化;第12天RA诱导组与过表达组形成类SSC，C1EIS敲除组无类SSC形成;细胞免疫化学检测表明C1EIS缺失导致integrinα6、integrinβ1蛋白表达量低于正常RA诱导组;流式分选结果表明C1EIS缺失integrinα6、integrinβ1双阳性细胞数为0.1％，对照组与过表达组为20.8％和19.7％。荧光定量PCR结果表明诱导4d后，C1EIS缺失组Sox2和Nanog基因表达量显著高于正常RA诱导组51％和42％;诱导12d后，integrinα6和integrinβ1基因表达量显著低于正常RA诱导组72％和38％。在RA诱导ESC分化过程中，敲除C1EIS抑制SSC分化形成，证明C1EIS基因在调控家禽ESC向SSC分化上发挥重要作用。收起

关键词 : 鸡胚胎干细胞鸡胚精原干细胞雄性生殖细胞分化调控作用基因编辑

4. LED光调控鸡胚孵化及蛋壳光透过特性研究

[学位论文] 俞玥浙江大学 2016年博士导师: 泮进明共169页

摘要 : 在禽类的人工孵化过程中，五个主要因素对胚胎的发育起着至关重要的作用，需要加以控制，分别是:温度、湿度、氧含量、二氧化碳含量、翻蛋频率。自然的孵化过程中，当母鸡离开觅食等时，胚胎能够接受到光刺激。与此相比，人工商业孵化经常采用完全黑暗... 展开在禽类的人工孵化过程中，五个主要因素对胚胎的发育起着至关重要的作用，需要加以控制，分别是:温度、湿度、氧含量、二氧化碳含量、翻蛋频率。自然的孵化过程中，当母鸡离开觅食等时，胚胎能够接受到光刺激。与此相比，人工商业孵化经常采用完全黑暗进行孵化。然而在现代化的产业中，禽类孵化期间近乎占了禽类生长的1/2-1/3，并且出雏雏鸡的品质是决定后期生产性能的关键因素。近年来，胚胎发育和光刺激之间的关联性引起了广泛的关注。大量的研究表明光照可以对胚胎发育产生影响。本论文采用了LED单色绿光(525±15nm)分别对肉鸡（浅色蛋壳）和蛋鸡（深色蛋壳）种蛋在孵化中进行不同光照强度、不同光照周期的调控研究。并采用了两侧给光的新型节能光照方式对种蛋进光照调控。在研究中对种蛋整体的孵化性能、胚胎的生长及后期育雏雏鸡的生长性能、抗应激性能均进行了评估。并探索性的研究了不同颜色种蛋蛋壳在孵化过程中光透过性、色度及元素的变化，加强对光照孵化研究的理论基础。主要的研究内容如下: (1)孵化期间不同强度单色绿光调控对肉鸡胚胎的影响本研究采用了从种蛋的两侧安置两个LED灯条，并从蛋托的两侧向中间给光的方式在孵化期间对胚胎进行光照刺激，最大范围利用了光能，节约了设备成本。利用以上的光源布置方式，采用三种强度的LED单色绿光(525 nm)(low:22-75lux; middle:92-208lux; high组:150-392 lux)在岭南黄肉鸡种蛋（浅色种蛋）孵化期间对其胚胎进行光照调控研究，对其孵化性能、胚胎生长等进行研究。研究结果显示在岭南黄肉鸡种蛋孵化期间提供光照对胚胎进行调控刺激，可在孵化期间显著促进胚胎及内脏器官等指标的生长，缩短孵化时间，光照组出雏高峰均比黑暗组提前约12h左右。并且可显著的降低种蛋孵化的死亡率，提高孵化率与整体的孵化质量，提高出雏雏鸡的血清生长类激素水平。三个光照组中以low组的光照强度(22-75 lux)效果最佳，过大的光照强度（middle组92-208 lux;high组:150-392 lux）会导致效果的降低或产生副作用。总体评估下，相对于传统黑暗孵化，在岭南黄肉鸡种蛋孵化过程中采用low光照强度:22-75 lux对胚胎进行光照调控，可显著地提高孵化率约6％左右，促进胚胎生长发育，提前出雏高峰期约12h左右。 (2)孵化期间不同强度单色绿光刺激对蛋鸡胚胎及育雏期间生长及抗压能力的影响本研究依旧采用了两侧给光的光照方式，采用三种强度的LED单色绿光(525nm)(low:22-75lux; middle:92-208lux; high组:150-392 lux)在海兰褐蛋鸡种蛋（深色种蛋）孵化期间对其胚胎进行光照调控研究，对其孵化性能、胚胎生长及育雏期间的生产性能及抗应激能力进行研究。研究结果表明在蛋鸡种蛋孵化期间提供high强度(150-392 lux)的光照刺激提高了种蛋的孵化率与整体孵化性能，降低了死亡率。在种蛋孵化期间提供low光强(22-75 lux)调控，显著提高了胚胎在孵化期间13天和15天胚胎体重与体长指标。在孵化期间提供单色绿光对胚胎进行光照刺激，可显著提高出雏后雏鸡的内脏器官（心、肝、消化系统）的发育。在孵化期间提供low光强(22-75 lux)进行调控可显著性提高雏鸡在育雏期间H14天的血清T3和T4水平，并且对母雏的促进效果优于公雏。在抗应激行为测试中，在孵化中提供单色绿光刺激，显著地降低了孤独测试和紧急延迟出没测试中的雏鸡鸣叫次数及紧急延迟出没时间。middle和high强度(92-208 lux，150-392 lux)的光照的孵化期间的调控使得育雏期间雏鸡产生显著地右偏侧性的选择。结果表明相对于传统黑暗孵化，在海兰褐蛋鸡种蛋孵化过程中采用high光照强度:150-392 lux对胚胎进行光照调控，可提高孵化率约3％、促进胚胎及出雏后雏鸡的内脏器官的生长发育，并可以显著地提高雏鸡在生长中的抗应激能力。 (3)孵化期间不同孵化周期绿光刺激胚胎对蛋鸡胚胎及育雏期间生长的影响本部分研究采用上一部分光强优化研究:high组光照强度(150-392 lux)，在蛋鸡种蛋（深色种蛋）孵化的不同时期对胚胎进行绿光光照刺激调控，并设全周期光照更高光照强度处理组0-21L higher组(338-992lux)进行验证，研究孵化期间孵化的整体性能、胚胎及育雏期间雏鸡的生产性能。依旧采用两侧给光的方式对种蛋进行光照调控。研究结果表明在孵化期间提供LED绿光光照可显著地促进胚胎的眼睛发育及育雏期间雏鸡的内脏器官发育，可促进出雏时雏鸡的胫骨和嘴长等骨骼发育，并且提高雏鸡在育雏期间的体内血液激素水平。总体评估下，相对于传统的黑暗孵化，在孵化期间的用150-392 lux的光照强度在孵化期间0-7天对胚胎进行绿光光照光照调控，可显著地提高孵化率约6％，提高雏鸡的骨骼发育水平。 (4)孵化期间不同颜色种蛋不同区域蛋壳光透特性的研究由前期研究得知浅色蛋壳和深色蛋壳种蛋所优化出的适合孵化期间进行光照强度并不相同，并且影响光照孵化的主要因素就是蛋壳，包括蛋壳的色度、厚度以及元素成分。因此本研究对整个孵化期间的种蛋蛋壳在可见光光谱下的透过特性进行研究，并结合对光照孵化后种蛋蛋壳颜色的对比结果，意在对进一步的光照孵化调控研究中提供科学的理论基础。采用蛋壳颜色跨度较大的梅黄鸡种蛋进行颜色分类，对不同颜色种蛋蛋壳及不同区域蛋壳位置在孵化期间的蛋壳的色度、光透过性、元素的变化进行研究。研究结果显示在种蛋孵化期进行光照可使蛋壳颜色发生显著性的变化。传统黑暗孵化期间蛋壳的光透过率会随着孵化时间的增加而显著性的降低。种蛋的小头区域的光透过率显著高于大头和中间区域的光透过率。浅色种蛋蛋壳的光透过率显著地高于中色和深色种蛋蛋壳的光透过率。收起

关键词 : 鸡胚人工孵化种蛋蛋壳光透过特性

5. 金纳米颗粒(AuNPs)对无壳培养鸡胚血管发育的影响

[学位论文] 熊春霞西南大学 2020年硕士导师: 肖雄共79页

摘要 : 新生血管的形成对于原发肿瘤或癌症的生长和持续至关重要。血管生成的诱导先于恶性肿瘤的形成，血管化的增强与肿瘤的侵袭性有关。因此，研发干扰肿瘤血管生长的抑制剂，有望为控制肿瘤生长提供新策略。金纳米颗粒(Gold nanoparticles，AuNPs)具有良好... 展开新生血管的形成对于原发肿瘤或癌症的生长和持续至关重要。血管生成的诱导先于恶性肿瘤的形成，血管化的增强与肿瘤的侵袭性有关。因此，研发干扰肿瘤血管生长的抑制剂，有望为控制肿瘤生长提供新策略。金纳米颗粒(Gold nanoparticles，AuNPs)具有良好生物相容性、易合成、毒性较小等特点，被认为是治疗癌症的理想药物载体。此外，研究表明AuNPs具有调控血管生成的功能。然而，这些研究主要以培养细胞为对象，无法模拟体内血管生成环境。利用实验动物建立的体内血管模型也无法进行实时观察和追踪。鸡胚尿囊绒毛膜(Chorioallantoic membrane，CAM)是禽类胚胎发育所需的高度血管化的组织，可以真实模拟体内血管的发育，是研究血管生成的重要体内模型。但是，由于蛋壳的存在，也限制了血管的可视化和实时追踪，无壳培养体系的建立有助于突破这一障碍。为此，本研究通过筛选无壳培养体系的预孵时间、转蛋方法、培养介质和通气时间等，优化鸡胚无壳培养条件，建立了鸡胚无壳培养体系。利用无壳鸡胚CAM血管模型，探讨了AuNPs对血管生长发育的影响，为解析血管发生机制，研发抗血管治疗癌症新策略奠定了基础。试验一鸡胚无壳培养体系的建立针对无壳培养鸡胚的早期发育难以启动和中期容易出现缺氧等问题，本研究通过探讨不同预孵时间对鸡胚转蛋成功率和存活率的影响，以及不同通氧时间对低氧诱导因子(Hypoxicinducingfactor，HIF-1α)mRNA和蛋白的表达，优化了鸡胚无壳培养的条件，并对无壳鸡胚心血管系统的发育和孵化后雏鸡的生长发育进行评估，旨在建立高效稳定的无壳培养体系。结果表明：(1)37.8℃预孵48h及48h以下，转蛋后的鸡胚完整度和转蛋成功率极显著高于37.8℃预孵72h的处理组(P<0.01)，预孵48h的鸡胚在转蛋后5d内的存活数量极显著高于其他三个处理组(P<0.01)；(2)第8d打孔通气处理组的鸡胚死亡率极显著低于其他通气处理组(P<0.01)，未通气时第8d鸡胚的HIF-1αmRNA和蛋白表达水平极显著高于第7d鸡胚(P<0.01)，通气后HIF-1α的水平极显著降低(P<0.01)；(3)无壳培养鸡胚心脏的形态与正常孵化鸡胚无明显差别，且两者的GATA4、VEGF和FGF的mRNA和蛋白水平无显著性差异(P＞0.05)；(4)采用37.8℃预孵48h和第8d通气的培养体系，在21d时可获得47.67±1.05％的孵化率；(5)无壳培养孵化鸡的形态与正常孵化鸡无明显差别，两者的增重差异不显著(P＞0.05)，且无壳孵化鸡具有正常的繁殖机能。因此，宜采用37.8℃预孵48h、第8d打孔通气的条件进行无壳培养体系的构建。试验二AuNPs对无壳培养体系鸡胚CAM血管生成的影响以无壳培养鸡胚CAM血管为模型，采用不同浓度(10ng/μL、25ng/μL或50ng/μL)的AuNPs溶液处理不同发育阶段(第7d、第8d或第9d)的鸡胚CAM血管，通过血管发育状态评价、RT-PCR和WesternBlot检测血管发育相关因子VEGF和FGF的表达情况等，探究AuNPs对鸡胚CAM血管发育的影响。结果表明：(1)无壳培养体系中，9d之前的鸡胚CAM血管不仅分支明显，血管分布密度适中，更加易于观察；(2)采用50ng/μLAuNPs处理第7d、第8d和第9d鸡胚CAM4d后的存活率极显著低于其余各组(P<0.01)；(3)10ng/μLAuNPs对7d、第8d和第9d鸡胚CAM血管无明显影响，采用25ng/μL和50ng/μLAuNPs处理第8d鸡胚CAM48h后，会引起血管分布变稀疏，血管颜色变浅。50ng/μLAuNPs处理第8d鸡胚CAM3d后，血管褪色明显，干瘪，鸡胚出现死亡；(4)25ng/μLAuNPs处理第8d和第9d鸡胚CAM48h后的VEGFmRNA表达量显著低于对照组(P＜0.05)。50ng/μLAuNPs处理第7d鸡胚CAM后，相同时间段的VEGFmRNA表达量与对照组差异不显著(P＞0.05)。25ng/μLAuNPs处理第8d鸡胚CAM48h后，FGFmRNA表达量极显著低于对照组(P＜0.01)；(5)10ng/μL、25ng/μL和50ng/μLAuNPs处理第8d鸡胚CAM24h后，VEGFR2和FGFR的蛋白表达水平与对照组无显著性差异(P>0.05)。25ng/μL和50ng/μLAuNPs处理鸡胚CAM血管48h后可以降低VEGFR2蛋白表达水平，50ng/μLAuNPs处理鸡胚CAM血管48h后可以降低FGFR蛋白表达水平。25ng/μLAuNPs处理72h后，可极显著下调鸡胚CAM中VEGFR2蛋白的表达(P＜0.01)，显著下调FGFR蛋白的表达(P＜0.05)，50ng/μLAuNPs可极显著下调这两种蛋白的表达(P＜0.01)。50ng/μLAuNPs处理CAM血管时对鸡胚发育的毒性较大，鸡胚死亡率高。第8d以后的鸡胚对AuNPs的反应更强烈。AuNPs处理鸡胚CAM需要48h后才能出现抑制血管作用。宜采用25ng/μLAuNPs处理第8d无壳鸡胚48h抑制CAM血管生长发育。结论：种蛋预孵48h后转入鸭蛋壳内进行孵化，第8d进行打孔通气，能够有效降低HIF-1α水平，缓解鸡胚缺氧，孵化率约47.67％±1.05％，获得形态发育、增重速度和繁殖性能与正常孵化鸡无差异的无壳培养鸡，从而建立了稳定高效的鸡胚无壳培养体系，并且该体系支持鸡胚心血管系统的正常发育，将无壳培养鸡胚的CAM作为血管模型，25ng/μLAuNPs能够安全有效地抑制CAM血管的生成，下调鸡胚CAM血管网VEGF和FGFmRNA的表达，降低CAM的VEGFR2和FGFR蛋白表达水平，且可以保证鸡胚的正常发育，这为解析血管发生机制，研发抗血管治疗癌症等新策略奠定了基础。收起

关键词 : 鸡胚无壳培养尿囊绒毛膜

6. 鸡胚性分化早期性别差异表达miRNA的靶基因研究

[学位论文] 王晓华中农业大学 2011年硕士导师: 龚炎长;俸艳萍共62页

摘要 : miRNA是一类长度约为20～24个核苷酸的小分子非编码RNA家族，它通过调控靶基因转录后的表达而在多种生物学途径中发挥作用。前期研究发现，鸡胚性腺早期发育过程中存在性别差异表达的miRNA，但对于其靶标的识别以及它在鸡胚性腺分化中的调控作用还未确... 展开 miRNA是一类长度约为20～24个核苷酸的小分子非编码RNA家族，它通过调控靶基因转录后的表达而在多种生物学途径中发挥作用。前期研究发现，鸡胚性腺早期发育过程中存在性别差异表达的miRNA，但对于其靶标的识别以及它在鸡胚性腺分化中的调控作用还未确定。为研究 miRNA在鸡胚早期性分化过程调控的靶基因，探讨 miRNA在性腺早期发育中的作用，本研究以前期筛选出的鸡胚早期性别差异表达miRNAs为研究对象，首先通过定量PCR和WISH方法验证miRNA的表达，然后通过生物信息学结合实验验证的方法对候选miRNA的靶基因进行了分析。本研究所取得的结果如下： 1．应用定量RT-PCR方法检测了5个miRNAs在性分化关键期（E3.5~6.5d）雌、雄鸡胚中的表达。结果表明，miR-92在所检测的各时期（除E4.5d外）中的表达均为雄性极显著高于雌性(P<0.01)，miR-2954的表达则是在E4.5d雄性中极显著高于雌性(P<0.01)；另外，miR-107、1767和31这3个miRNAs呈现前期（E3.5～4.5d）雌性高表达后期（E5.5～6.5d）雄性高表达的趋势。 2．利用WISH方法构建了雄性高表达的miR-92的空间表达谱。结果表明miR-92在E5.5、6.5 d胚胎UGSs/性腺部位的表达均为雄性高于雌性，且性腺部位表达明显高于UGSs部位。 3．通过TargetScan和miRDB对miR-92进行靶基因预测，结合功能分析、miRNA与靶基因形成二级结构及自由能的结果，初步选定ATRX为miR-92在鸡性腺发育中可能调控的靶基因。 4．通过双荧光素酶报告基因法对生物信息学预测的靶基因进行验证，结果表明miR-92能显著抑制融合ATRX3’UTR的报告基因的荧光表达量(P<0.01)，说明ATRX可能是miR-92的靶基因。 5．通过半定量方法检测ATRX在性分化关键期（E3.5~6.5d）雌、雄鸡胚性腺中的表达，结果表明它与miR-92在各时期（除4.5d）的表达趋势相反，故推测miR-92可能通过抑制靶基因ATRX的表达来调控鸡的性腺发育。收起

关键词 : 鸡胚 miRNA 性腺发育靶基因预测

7. 抗NDV中药的筛选及中药复方对人工感染NDV雏鸡外周血免疫功能的研究

[学位论文] 梁尧东北农业大学 2010年硕士导师: 葛铭共62页

摘要 : 鸡新城疫是由NDV引起的急性、高度接触性传染病。该病危害我国养鸡业发展。研究能防治新城疫的中药复方具有理论和现实意义。本实验筛选14味具有抗病毒作用的中药并应用于鸡胚培养实验，通过检测三种接种方式的单味中药提取液在鸡胚中抗NDV的血凝效价... 展开

关键词 : 中药复方 NDV 鸡胚雏鸡免疫功能

8. 鸡胚生殖细胞减数分裂起始调控的研究

[学位论文] 贺斌浙江大学 2013年博士导师: 张才乔共114页

摘要 : 鸡胚常被用作发育生物学研究的动物模型，应用于深层次揭示动物发育的机理，尤其是生殖系统的发育，在实践中提高家禽的繁殖性能，在理论上阐明生殖细胞早期发育的调控机理。本实验以海兰鸡胚为材料，研究四个科学问题:①雌激素通过改变性腺的结构而影... 展开鸡胚常被用作发育生物学研究的动物模型，应用于深层次揭示动物发育的机理，尤其是生殖系统的发育，在实践中提高家禽的繁殖性能，在理论上阐明生殖细胞早期发育的调控机理。本实验以海兰鸡胚为材料，研究四个科学问题:①雌激素通过改变性腺的结构而影响生殖细胞性别发育的方向;②垂体-卵巢轴激素如何调控生殖细胞在有丝分裂和减数分裂起始之间的选择;③孕酮(P4)通过何种机制诱发生殖细胞减数分裂的起始;④碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是否参与调节卵巢内生殖细胞的发育。 1.雌激素对生殖细胞发育方向的影响哺乳动物和鸟类生殖细胞减数分裂起始存在性别间差异，雌性生殖细胞于胚胎期起始减数分裂而雄性生殖细胞在胚胎期增殖后进入滞育阶段。早期生殖细胞减数分裂起始被认为可由性腺的结构所决定，但缺少体内的证据来证明。本研究使用雌激素(E2)和芳香化酶抑制剂(AI)处理进行性别逆转，改变性腺结构检测生殖细胞性别决定因素。结果表明:E2或AI处理均可引起性腺形态逆转;处理后两性卵巢样皮质内生殖细胞进入减数分裂状态，而精索状结构中均未见此现象发生。推测出现上述现象原因是E2和AI处理后使得性腺内中视黄酸（RA）浓度发生了改变。编码RA主要降解酶基因（Cyp26b1）的表达量出现了性别间差异。进一步使用免疫组化染色发现Cyp26b1主要在睾丸精索状结构中表达。综上所述:雌激素通过改变性腺结构影响生殖细胞减数分裂的起始时间，其中Cyp26b1的分布引起RA浓度差异是关键因素。 2.垂体-卵巢轴激素调控生殖细胞有丝分裂与减数分裂的选择胚胎期卵巢生殖细胞发育面临两个重要事件:有丝分裂和起始减数分裂。本研究利用鸡胚为模型，研究垂体-卵巢轴激素在生殖细胞有丝分裂和减数分裂起始之间选择所发挥的调控作用。对鸡胚进行卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)注射以改变体内促性腺激素的浓度，结果表明:FSH处理下调了减数分裂基因及其蛋白的表达并显著提高了增殖状态生殖细胞的比例;LH处理上调了减数分裂基因及其蛋白的表达，对生殖细胞的增殖无显著影响。结果还表明，miR181a*的转录受到促性腺激素的调控参与了垂体-卵巢轴对生殖细胞发育的调控。进一步研究发现，FSH和LH处理分别上调了类固醇激素合成酶Cyp19a1和3βHSDII的转录。使用AI与FSH共同处理，发现AI可阻止FSH所发挥的作用。LH处理可增加卵巢中3βHSDII的转录，促进P4的合成，参与了减数分裂的起始。综上所述:鸡胚垂体-卵巢轴激素通过调节卵巢内类固醇激素的分泌，分别调节了生殖细胞增殖和减数分裂的起始。 3.P4调控生殖细胞减数分裂起始最新研究表明，RA可能不是唯一的内源性引发减数分裂起始的因子。作者前期研究证实LH通过刺激P4合成诱发生殖细胞减数分裂的起始。在本研究中，雌性鸡胚注射P4可使生殖细胞提前起始减数分裂;体内P4处理对睾丸生精细胞没有显著影响，但P4刺激了体外培养的睾丸生殖细胞起始减数分裂。抑制RA受体不能阻止P4诱发的生殖细胞减数分裂起始，提示RA受体并没有介导该过程。此外，P4处理对RA主要的合成和代谢酶及RA受体mRNA的表达均无显著影响;使用高效液相色谱分析发现，P4处理并未改变卵巢内RA的浓度，这表明P4并非通过RA而发挥作用。利用鸡胚生殖细胞-体细胞共培养模型，使用siRNA敲减P4核受体PRA及PRB表达后，然后用P4处理仍可刺激生殖细胞进入减数分裂，提示P4的作用可能并非通过与核受体结合而发挥作用，确切的机制有待进一步研究。综上所述，本研究为鸡胚生殖细胞减数分裂起始机制提供了新的见解，P4可能是RA信号之外调节生殖细胞减数分裂起始的内分泌因子。 4.bFGF调节鸡胚卵巢生殖细胞的发育在动物胚胎发育过程中，bFGF具有抑制细胞分化和促进增殖的作用。前期报道中鸡胚卵巢内部分生殖细胞没有起始减数分裂。本研究中使用体内和体外方法探索了bFGF在鸡胚卵巢生殖细胞的作用。结果表明:鸡胚卵巢bFGF随着减数分裂的进行，其表达从全卵巢表达转变为卵巢髓质表达;通过RT-PCR及原位杂交的方法，证实其受体在卵巢中均有表达;使用卵巢培养模型发现bFGF显著降低了RA促进减数分裂起始的作用，且与RA信号无关。此外，bFGF促进了生殖细胞保持未分化状态（SSEA1阳性）并增殖。体内注射bFGF后出雏鸡卵巢皮质层厚度增加。综上，bFGF抑制了RA诱发的生殖细胞减数分裂起始，使胚胎卵巢生殖细胞保持未分化状态并进一步增殖。 5.成年鸡卵巢生殖细胞再生的探索传统理论认为，雌性哺乳动物和鸟类出生（出壳）时只具备卵母细胞的有限储备池，失去了产生卵母细胞的能力。然而，最近的研究结果却与这一传统观点不符，认为动物卵巢内卵母细胞的数量并非固定，在某些条件下可以再生。前期的实验表明，bFGF可使卵巢中部分卵原细胞保持未分化状态。通过石蜡切片及免疫组化和RT-PCR检测发现:在胚胎期直至成年鸡卵巢中均发现生殖细胞样的细胞簇群，并在胞质中表达Dazl蛋白;检测到不同阶段成年鸡卵巢中均有减数分裂相关基因的表达。推测成年鸡卵巢中可能存在卵原细胞起始减数分裂过程。综上所述，本研究证实了RA调控胚胎期生殖细胞减数分裂起始的作用，这一过程受到性腺环境、垂体-卵巢轴及卵巢旁分泌、自分泌的调节。此外，P4具有独立于RA信号之外诱发生殖细胞减数分裂起始的作用。在此基础上，探索了成鸡卵巢是否具有生殖细胞再生现象。这些结果为阐明早期生殖细胞发生的调控机理及提高家禽繁殖性能奠定了的理论基础。收起

关键词 : 鸡胚生殖细胞减数分裂起始调控

9. microRNA在砷致胚胎发育毒性中的作用机制研究

[学位论文] 崔熠北京协和医学院(中国医学科学院) 2011年博士导师: 马旭共103页

摘要 : 人群流行病学统计表明,长期暴露在含砷高的环境中,能导致生殖和胚胎发育异常,引起神经系统、心血管系统等出生缺陷。本研究以鸡胚为动物模型进一步探讨重金属元素砷对胚胎发育影响的分子作用机制。我们首先应用基因芯片筛选胚胎早期发育无机砷暴露组与... 展开人群流行病学统计表明,长期暴露在含砷高的环境中,能导致生殖和胚胎发育异常,引起神经系统、心血管系统等出生缺陷。本研究以鸡胚为动物模型进一步探讨重金属元素砷对胚胎发育影响的分子作用机制。我们首先应用基因芯片筛选胚胎早期发育无机砷暴露组与正常对照组胚胎的差异mRNA和miRNA的表达谱,通过生物信息学分析差异microRNA与差异基因,构建microRNA与差异基因功能间的相互作用网络,网络图结果提示Nrp1、stmn1、HDAC4、Nrcam等基因在microRNA介导的砷干扰胚胎发育中都发挥了重要作用,且其表达水平与相应的microRNA表达呈负相关。我们的研究结果提示Nrp1基因位于mRNA和miRNA网络图的中心位置,可能是mir-181b和mir-9的一个作用靶点。神经纤毛蛋白-1(Neuropilin-1,NRP-1)属跨膜糖蛋白,作为轴突导向分子的受体,参与神经导向的调节,同时作为血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)的共受体表达于血管内皮细胞,参与血管新生的调节。鉴于Nrp1基因在血管生成方面发挥着重要的作用,我们以人脐静脉内皮细胞株EAhy926为细胞模型,研究mir-181b、mir-9调控Nrp1表达在无机砷诱导的血管增生中的作用,研究结果提示EA.hy926细胞系暴露于无机砷环境下mir-181b、mir-9表达降低,Nrp1的表达增加,且呈剂量时间依赖关系。为了探讨mir-181b、mir-9与Nrp1的调控关系,我们在EA.hy926细胞内过表达和敲低mir-181b和mir-9,研究表明过表达mir-181b和mir-9可以明显降低Nrp1蛋白水平,敲低mir-181b和mir-9表达可以增加Nrp1蛋白的表达,结果提示mir-181b和mir-9可能作用于Nrp1的3’-UTR序列,调节其表达。为了进一步证明Nrp1的3’UTR.序列包含mir-181b和mir-9作用的位点,我们将Nrp1的3’-UTR序列克隆至萤光报告载体中,并与mir-181b和mir-9的模拟物与抑制物共转染至EA.hy926细胞中,然后检测萤光素酶的活性,结果表明mir-181b和mir-9的过表达可以明显抑制萤光素酶的活性；与之相反,当我们将包含Nrp1的3’-UTR序列的萤光素酶报告载体中mir-181b和mir-9可能的结合位点剪切或突变以后,再和mir-181b和mir-9的模拟物与抑制物共转染至EA.hy926细胞中,萤光素酶的活性仅发生微弱的变化,这说明mir-181b和mir-9可以直接作用于Nrp1的3’UTR区调控其表达。细胞迁移实验和血管生成实验能够有效评估测定离体血管生成,我们通过细胞迁移实验和血管生成实验证明无机砷通过miRNA介导的Nrp1表达上升促进血管生成。结果提示细胞暴露在砷环境中内皮细胞的迁移数和小管生成数增加,与对照组比较,有显著性差异。而转染mir-181b和mir-9模拟物后过表达mir-181b和mir-9的细胞在暴露于砷环境中内皮细胞的迁移数和小管生成数与对照组相比无显著性差异,提示过表达mir-181b和mir-9能够逆转砷暴露所致的内皮细胞的迁移数和小管生成数增加效应,证明了无机砷暴露所致mir-181b和mir-9的降低可以通过上调Nrp1的蛋白水平,参与砷诱导的血管生成的发生,从而介导了砷的毒性作用。综上所述,本研究从miRNA的角度研究环境污染物砷暴露所致胚胎发育毒性和畸形的分子机制,首次证明环境物质无机砷通过miRNA介导的血管发生异常干扰胚胎发育。收起

关键词 : 砷鸡胚 microRNA表达 NRP1基因血管生成

10. 模式动物鸡与果蝇的心脏发育研究

[学位论文] 张月娟湖南师范大学 2004年硕士导师: 吴秀山;袁婺洲共95页

摘要 : 心脏发育是一个包含着细胞迁移、融合和特化的复杂过程.在过去几年内,心脏发育的分子信号通路的研究取得了极大的进展.人们从DNA水平上对心脏发育的分子机理进行了深入的探索,并鉴定出了许多与之相关的信号通路和转录因子.鸡经常被作为研究哺乳动物胚... 展开

关键词 : 鸡胚心脏早期发育蛋白质组