摘要: 新生血管的形成对于原发肿瘤或癌症的生长和持续至关重要。血管生成的诱导先于恶性肿瘤的形成，血管化的增强与肿瘤的侵袭性有关。因此，研发干扰肿瘤血管生长的抑制剂，有望为控制肿瘤生长提供新策略。金纳米颗粒(Gold nanoparticles，AuNPs)具有良好... 展开 新生血管的形成对于原发肿瘤或癌症的生长和持续至关重要。血管生成的诱导先于恶性肿瘤的形成，血管化的增强与肿瘤的侵袭性有关。因此，研发干扰肿瘤血管生长的抑制剂，有望为控制肿瘤生长提供新策略。金纳米颗粒(Gold nanoparticles，AuNPs)具有良好生物相容性、易合成、毒性较小等特点，被认为是治疗癌症的理想药物载体。此外，研究表明AuNPs具有调控血管生成的功能。然而，这些研究主要以培养细胞为对象，无法模拟体内血管生成环境。利用实验动物建立的体内血管模型也无法进行实时观察和追踪。鸡胚尿囊绒毛膜(Chorioallantoic membrane，CAM)是禽类胚胎发育所需的高度血管化的组织，可以真实模拟体内血管的发育，是研究血管生成的重要体内模型。但是，由于蛋壳的存在，也限制了血管的可视化和实时追踪，无壳培养体系的建立有助于突破这一障碍。为此，本研究通过筛选无壳培养体系的预孵时间、转蛋方法、培养介质和通气时间等，优化鸡胚无壳培养条件，建立了鸡胚无壳培养体系。利用无壳鸡胚CAM血管模型，探讨了AuNPs对血管生长发育的影响，为解析血管发生机制，研发抗血管治疗癌症新策略奠定了基础。 试验一鸡胚无壳培养体系的建立 针对无壳培养鸡胚的早期发育难以启动和中期容易出现缺氧等问题，本研究通过探讨不同预孵时间对鸡胚转蛋成功率和存活率的影响，以及不同通氧时间对低氧诱导因子(Hypoxicinducingfactor，HIF-1α)mRNA和蛋白的表达，优化了鸡胚无壳培养的条件，并对无壳鸡胚心血管系统的发育和孵化后雏鸡的生长发育进行评估，旨在建立高效稳定的无壳培养体系。结果表明：(1)37.8℃预孵48h及48h以下，转蛋后的鸡胚完整度和转蛋成功率极显著高于37.8℃预孵72h的处理组(P<0.01)，预孵48h的鸡胚在转蛋后5d内的存活数量极显著高于其他三个处理组(P<0.01)；(2)第8d打孔通气处理组的鸡胚死亡率极显著低于其他通气处理组(P<0.01)，未通气时第8d鸡胚的HIF-1αmRNA和蛋白表达水平极显著高于第7d鸡胚(P<0.01)，通气后HIF-1α的水平极显著降低(P<0.01)；(3)无壳培养鸡胚心脏的形态与正常孵化鸡胚无明显差别，且两者的GATA4、VEGF和FGF的mRNA和蛋白水平无显著性差异(P＞0.05)；(4)采用37.8℃预孵48h和第8d通气的培养体系，在21d时可获得47.67±1.05％的孵化率；(5)无壳培养孵化鸡的形态与正常孵化鸡无明显差别，两者的增重差异不显著(P＞0.05)，且无壳孵化鸡具有正常的繁殖机能。因此，宜采用37.8℃预孵48h、第8d打孔通气的条件进行无壳培养体系的构建。 试验二AuNPs对无壳培养体系鸡胚CAM血管生成的影响 以无壳培养鸡胚CAM血管为模型，采用不同浓度(10ng/μL、25ng/μL或50ng/μL)的AuNPs溶液处理不同发育阶段(第7d、第8d或第9d)的鸡胚CAM血管，通过血管发育状态评价、RT-PCR和WesternBlot检测血管发育相关因子VEGF和FGF的表达情况等，探究AuNPs对鸡胚CAM血管发育的影响。结果表明：(1)无壳培养体系中，9d之前的鸡胚CAM血管不仅分支明显，血管分布密度适中，更加易于观察；(2)采用50ng/μLAuNPs处理第7d、第8d和第9d鸡胚CAM4d后的存活率极显著低于其余各组(P<0.01)；(3)10ng/μLAuNPs对7d、第8d和第9d鸡胚CAM血管无明显影响，采用25ng/μL和50ng/μLAuNPs处理第8d鸡胚CAM48h后，会引起血管分布变稀疏，血管颜色变浅。50ng/μLAuNPs处理第8d鸡胚CAM3d后，血管褪色明显，干瘪，鸡胚出现死亡；(4)25ng/μLAuNPs处理第8d和第9d鸡胚CAM48h后的VEGFmRNA表达量显著低于对照组(P＜0.05)。50ng/μLAuNPs处理第7d鸡胚CAM后，相同时间段的VEGFmRNA表达量与对照组差异不显著(P＞0.05)。25ng/μLAuNPs处理第8d鸡胚CAM48h后，FGFmRNA表达量极显著低于对照组(P＜0.01)；(5)10ng/μL、25ng/μL和50ng/μLAuNPs处理第8d鸡胚CAM24h后，VEGFR2和FGFR的蛋白表达水平与对照组无显著性差异(P>0.05)。25ng/μL和50ng/μLAuNPs处理鸡胚CAM血管48h后可以降低VEGFR2蛋白表达水平，50ng/μLAuNPs处理鸡胚CAM血管48h后可以降低FGFR蛋白表达水平。25ng/μLAuNPs处理72h后，可极显著下调鸡胚CAM中VEGFR2蛋白的表达(P＜0.01)，显著下调FGFR蛋白的表达(P＜0.05)，50ng/μLAuNPs可极显著下调这两种蛋白的表达(P＜0.01)。50ng/μLAuNPs处理CAM血管时对鸡胚发育的毒性较大，鸡胚死亡率高。第8d以后的鸡胚对AuNPs的反应更强烈。AuNPs处理鸡胚CAM需要48h后才能出现抑制血管作用。宜采用25ng/μLAuNPs处理第8d无壳鸡胚48h抑制CAM血管生长发育。 结论：种蛋预孵48h后转入鸭蛋壳内进行孵化，第8d进行打孔通气，能够有效降低HIF-1α水平，缓解鸡胚缺氧，孵化率约47.67％±1.05％，获得形态发育、增重速度和繁殖性能与正常孵化鸡无差异的无壳培养鸡，从而建立了稳定高效的鸡胚无壳培养体系，并且该体系支持鸡胚心血管系统的正常发育，将无壳培养鸡胚的CAM作为血管模型，25ng/μLAuNPs能够安全有效地抑制CAM血管的生成，下调鸡胚CAM血管网VEGF和FGFmRNA的表达，降低CAM的VEGFR2和FGFR蛋白表达水平，且可以保证鸡胚的正常发育，这为解析血管发生机制，研发抗血管治疗癌症等新策略奠定了基础。 收起