摘要: 胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）向雄性生殖细胞的诱导分化受到许多内源性分化因子和外源诱导因素的调控。其中视黄酸(Retinoic acid，RA)、骨形成蛋白4(Bonemorphogenetic protein4，BMP4)等外源诱导培养与Stra8、DAZL等内源基因调控形成复杂... 展开 胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）向雄性生殖细胞的诱导分化受到许多内源性分化因子和外源诱导因素的调控。其中视黄酸(Retinoic acid，RA)、骨形成蛋白4(Bonemorphogenetic protein4，BMP4)等外源诱导培养与Stra8、DAZL等内源基因调控形成复杂调控网络共同发挥关键作用。随着对ESC向雄性生殖细分化机制的深入了解，发现存在新基因特异表达，探索这些新基因功能对完善胚胎干细胞诱导体系，治疗不孕不育疾病具有重要意义。本研究利用CRISPR/Cas9高效基因编辑技术实现在鸡上基因敲除，探索精原干细胞特异表达基因C1EIS功能，为阐明生殖细胞发生及分化机制提供高效方法。本文主要研究如下: 1前期通过RNA-seq技术发现C1EIS基因在ESC向SSC分化过程中，存在显著差异表达。通过RT-PCR获得如皋黄鸡C1EIS基因编码区并进行测序验证。生物信息学分析结果表明:C1EIS基因(基因登录号:XM_416004.2)编码144个氨基酸，属于不稳定的脂溶蛋白。C1EIS蛋白无信号肽，主要在细胞核中表达。存在2个O-糖基化位点和1个N-糖基化位点，可能含有磷酸化位点;二级结构中α螺旋占45.14％，β转角占4.17％，伸展片段占15.97，无规则卷曲占34.72％;系统进化树分析显示鸡C1EIS蛋白与绿头鸭进化关系密切，与牛等哺乳类动物同源性较低。 2设计3对特异sgRNA序列，构建CRISPR/Cas9敲除载体。使用含1.7％ DMSO培养基诱导培养细胞48小时后转染CRISPR/Cas9载体。利用菌液PCR，T7E1酶切和TA克隆测序检测CRISPR/Cas9敲除载体活性。结果表明C1EIS基因存在2-3bp碱基缺失，突变效率为20％。CRISPR/Cas9技术能够稳定的在鸡的细胞上实现C1EIS基因突变。利用qPCR克隆C1EIS基因，连接pcDNA3.0过表达载体。利用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切获得C1EIS条带，表明pcDNA3.0-C1EIS过表达载体构建成功。 3分别将CRISPR/Cas9载体，pcDNA3.0-C1EIS过表达载体转染ESC，转染48小时后换RA诱导培养基培养12天。采用形态学观察、免疫化学检测、流式细胞检测和QRT-PCR等方法检测C1EIS缺失与过表达对ESC向SSC分化的影响。结果表明C1EIS缺失的ESC与正常RA诱导组相比，第6天类胚体数目降低57％，且停止向SSC分化;第12天RA诱导组与过表达组形成类SSC，C1EIS敲除组无类SSC形成;细胞免疫化学检测表明C1EIS缺失导致integrinα6、integrinβ1蛋白表达量低于正常RA诱导组;流式分选结果表明C1EIS缺失integrinα6、integrinβ1双阳性细胞数为0.1％，对照组与过表达组为20.8％和19.7％。荧光定量PCR结果表明诱导4d后，C1EIS缺失组Sox2和Nanog基因表达量显著高于正常RA诱导组51％和42％;诱导12d后，integrinα6和integrinβ1基因表达量显著低于正常RA诱导组72％和38％。在RA诱导ESC分化过程中，敲除C1EIS抑制SSC分化形成，证明C1EIS基因在调控家禽ESC向SSC分化上发挥重要作用。 收起