摘要: 目的 微囊藻毒素-LR(microcystin-LR，MC-LR)是由蓝藻水华产生的一种人类致癌物质，威胁男性生殖系统健康。本研究旨在探究MC-LR对雄性生殖细胞DNA损伤和细胞自噬的影响及调控机制。通过分析氧化应激与DNA损伤之间的关系，并探讨DNA损伤后ATM/p53通... 展开 目的 微囊藻毒素-LR(microcystin-LR，MC-LR)是由蓝藻水华产生的一种人类致癌物质，威胁男性生殖系统健康。本研究旨在探究MC-LR对雄性生殖细胞DNA损伤和细胞自噬的影响及调控机制。通过分析氧化应激与DNA损伤之间的关系，并探讨DNA损伤后ATM/p53通路在诱导细胞自噬中的作用，为MC-LR诱导雄性生殖细胞DNA损伤及细胞自噬提供新的分子机制，为进一步研究MC-LR诱导的人类雄性生殖系统损伤提供可靠的理论基础。 方法 1.评估MC-LR对C57BL/6N小鼠睾丸组织病理损伤程度 将48只C57BL/6N小鼠随机分成8个处理组，分别进行腹腔注射染毒14天。记录小鼠体重变化及最后睾丸组织重量;WesternBlot和微囊藻毒素检测试剂盒分别检测MC-LR在睾丸组织和血清中的水平;H&E染色检测睾丸组织中的病理损伤情况。 2.确定GC-1细胞中MC-LR染毒浓度和抗氧化剂NAC干预剂量 不同浓度MC-LR或NAC对GC-1细胞进行暴露24小时后，采用CCK-8试剂盒检测细胞活性，确定MC-LR和NAC的后续实验浓度。WesternBlot检测MC-LR在GC-1细胞中的表达水平。 3.检测MC-LR对小鼠睾丸组织和GC-1细胞中DNA损伤情况及氧化应激相关指标的影响 WesternBlot、免疫荧光和羟自由基(hydroxyl radical，·OH)检测试剂盒联合酶标仪分别检测小鼠睾丸组织及GC-1细胞中γ-H2AX、8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2''-deoxyguanosine，8-OHdG)以及·OH的水平;彗星实验检测GC-1细胞中DNA损伤程度。 4.检测MC-LR对小鼠睾丸组织和GC-1细胞中ATM及其下游相关蛋白表达水平和自噬水平的影响 WesternBlot检测小鼠睾丸组织和GC-1细胞中ATM及其下游相关蛋白和自噬相关蛋白的表达水平;免疫荧光检测小鼠睾丸组织和GC-1细胞中LC3蛋白的表达水平;MDC染色法检测GC-1细胞中自噬小体含量的变化。 结果 1.MC-LR在小鼠睾丸组织中蓄积并引起组织病理学损伤 C57BL/6N小鼠腹腔注射染毒14天后发现，MC-LR可通过血液循环进入睾丸组织，导致小鼠体重及性腺指数明显降低(P＜0.05)，诱导睾丸组织病理损伤程度加深。 2.MC-LR暴露后通过氧化应激诱导小鼠睾丸组织DNA损伤 MC-LR可诱导小鼠睾丸组织中·OH产生能力的增加，提高γ-H2AX和DNA氧化损伤标志性蛋白8-OHdG的表达水平(P＜0.05)。抗氧化剂NAC预处理可显著降低·OH的产生能力，减少8-OHdG和γ-H2AX的表达水平。 3.暴露于不同浓度MC-LR和NAC后，GC-1细胞活性先升高后降低 将GC-1细胞暴露于不同浓度MC-LR24h后，计算MC-LR对GC-1细胞的IC50为24μg/mL，确定后续实验浓度为3，6和12μg/mL。暴露于不同浓度NAC后，发现当NAC浓度为5mM时，细胞活性最高，确定NAC后续实验浓度为5mM。WesternBlot结果发现，染毒24h后MC-LR可进入GC-1细胞。 4.MC-LR暴露后通过氧化应激诱导GC-1细胞DNA损伤 MC-LR可显著诱导GC-1细胞彗星尾距(olive tail moment, OTM)和拖尾细胞中彗星尾部DNA含量(DNA content of comet tail in trailing cells，TailDNA％)增加，导致γ-H2AX表达水平显著升高(P＜0.05)。MC-LR还可导致GC-1细胞中·OH产生能力的增加，诱导8-OHdG的高表达。抗氧化剂NAC预处理可显著降低·OH的产生能力和8-OHdG的表达水平，导致GC-1细胞OTM、TailDNA％以及γ-H2AX表达水平的降低。 5.DNA损伤诱导的ATM/p53通路参与MC-LR在小鼠睾丸和GC-1细胞中引起的细胞自噬 MC-LR可诱导小鼠睾丸组织和GC-1细胞中ATM、CHK2和p53蛋白磷酸化水平升高，以及自噬相关蛋白Beclin1、ATG5、ATG12、ATG5-ATG12和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平增加(P＜0.05)。KU55933预处理可显著降低ATM、CHK2和p53的蛋白磷酸化水平，同时降低细胞的自噬水平。 结论 1.MC-LR可通过氧化应激引起小鼠雄性生殖细胞DNA损伤。 2.DNA损伤诱导的ATM/p53通路在MC-LR引起的细胞自噬中起重要作用。 收起